智紅葉，徐宏燕，陳瑛瑛，陳亞寧，周麗君，戰(zhàn)大偉，顏克松，姚合斌,*

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院，北京　100048；2.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院　內(nèi)分泌科，北京100048；3. 中國人民解放軍海軍總醫(yī)院海戰(zhàn)傷基礎(chǔ)研究中心，北京　100048；4.中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科，北京　100048)

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基因敲入小鼠甲亢性低鉀型周期性麻痹模型的評(píng)價(jià)

智紅葉1，徐宏燕1，陳瑛瑛2，陳亞寧2，周麗君3，戰(zhàn)大偉4，顏克松4，姚合斌1,2*

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院，北京100048；2.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100048；3. 中國人民解放軍海軍總醫(yī)院海戰(zhàn)傷基礎(chǔ)研究中心，北京100048；4.中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科，北京100048)

目的用基因敲入CaV1.1-R528H小鼠建立甲亢性低鉀型周期性麻痹模型并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。 方法 8周齡基因敲入CaV1.1-R528H雄性小鼠及8周齡野生型C57BL/6J雄性小鼠各36只，采用三因素兩水平2×2×2析因設(shè)計(jì)方法按體重隨機(jī)原則(三因素分別為突變、甲狀腺素及胰島素因素，兩水平為有或無)分為8組。其中有甲狀腺素處理組的小鼠制備高甲狀腺素毒癥，按350μg/kg體重連續(xù)腹腔注射左旋甲狀腺素鈉12d，末次給藥后有胰島素處理組按0.8U/kg體重給予腹腔注射短效胰島素，分別檢測并記錄各組小鼠注射前(0min)及注射后(30、60min)的血鉀。 結(jié)果(1)制備高甲狀腺素毒癥的小鼠出現(xiàn)煩躁不安、易激怒及毛色枯燥現(xiàn)象，相比對(duì)照組，飲食及飲水量明顯增多，而體重增加緩慢。甲狀腺功能檢測顯示T3、T4明顯高于相應(yīng)對(duì)照組，TSH明顯低于相應(yīng)對(duì)照組，且差異均有顯著性(P<0.05)。(2)單獨(dú)給予甲狀腺素或胰島素處理，突變組與野生組血鉀同時(shí)間點(diǎn)比較并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在高甲狀腺素毒癥下給予胰島素處理后，突變組與野生組同時(shí)間點(diǎn)(30、60min)比較突變組血鉀顯著低于野生組(P<0.05)。(3)主效應(yīng)及交互作用：單獨(dú)突變因素或甲狀腺素因素對(duì)血鉀并沒有作用，僅有胰島素對(duì)降低血鉀有作用(P<0.05)；甲狀腺素因素和突變因素之間以及胰島素因素和突變因素之間均有交互作用(P<0.05)；甲狀腺素因素和胰島素因素之間沒有交互作用。 結(jié)論 (1)高甲狀腺素毒癥制備成功。(2)利用基因敲入CaV1.1-R528H小鼠成功的建立了甲亢性低鉀型周期性麻痹模型。

甲亢性低鉀型周期性麻痹；基因敲入；CaV1.1-R528H小鼠；高甲狀腺素毒癥；胰島素

甲亢性低鉀型周期性麻痹(thyrotoxichypokalemicperiodicparalysis，簡稱THPP)是一種在遺傳缺陷基礎(chǔ)上，由于甲狀腺素毒癥及其他誘因激發(fā)的與細(xì)胞內(nèi)外鉀離子跨膜轉(zhuǎn)移異常相關(guān)的疾病，主要表現(xiàn)為甲狀腺毒癥、低鉀血癥及發(fā)作性肌無力[1]。該病發(fā)病年齡多在20～40歲，多見于男性，是我國低鉀型周期性麻痹的主要類型。發(fā)病前通常伴有明顯的誘因，如高碳水化合物的飲食、大量葡萄糖的輸入等，這些誘因均可導(dǎo)致體內(nèi)胰島素水平的增多，誘發(fā)該病的發(fā)作。目前該病的發(fā)病機(jī)制仍不是十分清楚，有研究顯示THPP存在相關(guān)離子通道的突變，如編碼鉀通道輔助亞單位、編碼鈉通道α亞單位以及內(nèi)向整流鉀通道的突變，但除個(gè)別報(bào)道外，數(shù)量極少，陽性率不足1%[2-5]，但也說明THPP是有離子通道病的特點(diǎn)。因此，已發(fā)現(xiàn)的低鉀型周期性麻痹相關(guān)突變可以作為甲亢性低鉀型周期性麻痹發(fā)病機(jī)制研究的借鑒與補(bǔ)充，利用課題組前期構(gòu)建的鈣離子通道缺陷型基因敲入CaV1.1-R528H小鼠模型[6]進(jìn)一步建立甲亢性低鉀型周期性麻痹模型。目前認(rèn)為甲亢性低鉀型周期性麻痹的發(fā)病因素包括本身存在相關(guān)離子通道突變、高甲狀腺素毒癥、導(dǎo)致體內(nèi)胰島素增多的誘因以及雄性激素，因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用已構(gòu)建的鈣通道缺陷型基因敲入CaV1.1-R528H雄性小鼠，通過給予外源性左旋甲狀腺素鈉處理來制備小鼠高甲狀腺素毒癥，并在高甲狀腺素毒癥基礎(chǔ)上給予注射外源性胰島素，模擬人類甲亢性低鉀型周期性麻痹發(fā)病時(shí)的特點(diǎn)，建立甲亢性低鉀型周期性麻痹動(dòng)物模型。

1　材料與方法

1.1主要儀器及試劑

1.1.1儀器

日本京都干式電解質(zhì)分析儀(型號(hào)：SE-1520)，購自日本京都有限公司，采用日本原裝配套試劑干片及參比液，每次實(shí)驗(yàn)前使用磁卡對(duì)其進(jìn)行校對(duì)；PCR儀(型號(hào):德國AG22331Hamburg)；DNA測序儀(型號(hào)：美國ABI公司Prism377)；貝克曼DXC800全自動(dòng)生化分析儀，美國貝克曼庫爾特公司；西門子CentaurCP全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀，德國西門子公司；電子天平(型號(hào)：YP/0001)，購自上海越平科學(xué)儀器有限公司；胰島素一次性使用無菌注射器，美國BD公司；一次性注射器(1、5、20mL)，購自深圳市保安醫(yī)療用品有限公司。

1.1.2試劑

左旋甲狀腺素鈉，阿拉丁(貨號(hào)：T113354)；T3、T4及TSH測定試劑盒，西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司；短效胰島素(10mL: 400U)，購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司；Tap酶、dNTP，購自大連寶生物工程有限公司；DNAladdermarker，購自深圳晶美生物技術(shù)有限公司；PCR引物，上海英俊生物技術(shù)有限公司和上海生物工程有限公司合成；0.9%生理鹽水，購自天津天安藥業(yè)股份有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

8周齡SPF級(jí)野生型C57BL/6J雄性小鼠36只，體重為21～23g，購自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司【SCXK(京)2011-0004】；8周齡SPF級(jí)基因敲入CaV1.1-R528H雄性小鼠36只，體重為21～23g，由本課題組在中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院(304醫(yī)院)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室傳代所得，原代小鼠由本課題組和上海南方模式生物研究中心共同研制【SCXK( 滬)2009-0023】。所有小鼠均飼養(yǎng)于中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院(304醫(yī)院)屏障環(huán)境動(dòng)物房【SYXK(軍)2012-2014】，實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20～26℃，濕度40%～70%，每周換兩次墊料，添加食物和水。所有小鼠按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，購買的野生型C57BL/6J小鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.3基因敲入CaV1.1-R528H小鼠的鑒定及其生化指標(biāo)檢測

實(shí)驗(yàn)所使用的基因敲入CaV1.1-R528H小鼠為傳代小鼠，在傳代中突變基因是否會(huì)發(fā)生丟失，對(duì)其進(jìn)行了鑒定?；蚯萌隒aV1.1-R528H小鼠是以野生型C57BL/6J小鼠為背景構(gòu)建的，因此選取野生型C57BL/6J小鼠作為參考對(duì)照小鼠，該小鼠與突變小鼠生化指標(biāo)是否存在差異，對(duì)二者的生化指標(biāo)進(jìn)行檢測并比較。

1.3.1基因敲入CaV1.1-R528H小鼠的鑒定

實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)抽取8只基因敲入CaV1.1-R528H小鼠，提取鼠尾基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，并在8只小鼠基因組DNA的PCR產(chǎn)物中隨機(jī)選取5只進(jìn)行DNA測序。

1.3.2基因敲入CaV1.1-R528H小鼠與野生型C57BL/6J小鼠生化指標(biāo)比較

實(shí)驗(yàn)前取8周齡基因敲入CaV1.1-R528H小鼠雌雄各8只以及8周齡野生型C57BL/6J小鼠雌雄各8只，所有小鼠于當(dāng)日20：00開始禁食、禁水，次日早晨8:00摘取眼球取血于EP管中送檢，檢測指標(biāo)包括葡萄糖(GLU)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶 (CK)、血肌酐(Cr)、電解質(zhì)(Na+、K+、Cl-) 8項(xiàng)指標(biāo)。

1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)采用三因素兩水平2×2×2析因設(shè)計(jì)方法，三因素分別為突變、甲狀腺素及胰島素因素，兩個(gè)水平為有或無。

1.4.2動(dòng)物分組

取8周齡基因敲入CaV1.1-R528H雄性小鼠及8周齡野生型C57BL/6J雄性小鼠各36只，采用三因素兩水平2×2×2析因設(shè)計(jì)方法按體重隨機(jī)原則分為野生+鹽水組、突變+鹽水組、野生+鹽水+胰島素組、突變+鹽水+胰島素組、野生+甲狀腺素+鹽水組、突變+甲狀腺素+鹽水組、野生+甲狀腺素+胰島素組及突變+甲狀腺素+胰島素組8組，其中有甲狀腺素處理組每組8只，其他組每組10只。

1.4.3高甲狀腺素毒癥制備及給藥方法

有甲狀腺素處理組的小鼠每日腹腔注射左旋甲狀腺素鈉(按350μg/kg)，左旋甲狀腺素鈉用生理鹽水配制成濃度為35μg/mL的溶液，按0.1mL/10g體重的量腹腔注射，連續(xù)注射12d[7]。同時(shí)其余組小鼠給予0.9%生理鹽水作為對(duì)照，按0.1mL/10g體重的量腹腔注射。實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠外觀行為，測量并記錄小鼠體重。最后一次給藥后有胰島素處理組的小鼠給予腹腔注射短效胰島素(0.8U/kg)，胰島素用0.9%生理鹽水稀釋配置成0.1U/mL，按0.1mL/10g體重的量腹腔注射，同時(shí)其余組以注射相同體積的0.9%生理鹽水作為對(duì)照。

1.4.4血鉀及甲狀腺功能測定

小鼠斷尾取血，采取讓血液自由滴入的方式，取血約25μL即可，避免用手?jǐn)D壓鼠尾，防止紅細(xì)胞破裂影響血鉀，取血后立即用干式電解質(zhì)分析儀進(jìn)行血鉀測定，分別在胰島素或生理鹽水注射前(0min)及注射后(30、60min)測定并記錄血鉀。測完血鉀后，野生+鹽水組、突變+鹽水組、野生+甲狀腺素+鹽水組及突變+甲狀腺素+鹽水組小鼠于當(dāng)日20:00開始禁食不禁水12h后，次日早晨摘取眼球取血于EP管并送檢實(shí)驗(yàn)室，檢測血清T3、T4及TSH。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1基因敲入CaV1.1-R528H小鼠鑒定結(jié)果及其生化指標(biāo)檢測結(jié)果

2.1.1基因敲入CaV1.1-R528H小鼠鑒定結(jié)果

PCR結(jié)果顯示8只小鼠的基因組DNA擴(kuò)增片段長度為870bp，為純合子基因敲入CaV1.1-R528H小鼠，而對(duì)照的野生型小鼠DNA擴(kuò)增片段長度為748bp。DNA測序結(jié)果證實(shí)5只小鼠為攜帶CaV1.1基因G→A突變的小鼠，并與野生型小鼠進(jìn)行對(duì)比。

2.1.2基因敲入CaV1.1-R528H小鼠與野生型C57BL/6J小鼠生化指標(biāo)比較結(jié)果

基因敲入CaV1.1-R528H小鼠與野生型C57BL/6J小鼠同性別之間比較，結(jié)果差異無顯著性(P>0.05)；基因敲入CaV1.1-R528H小鼠雌、雄之間比較及野生型C57BL/6J小鼠雌、雄之間比較，結(jié)果差異均無顯著性(P>0.05)(表1)。

2.2高甲狀腺素毒癥鑒定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中觀察到注射甲狀腺素組在注射左旋甲狀腺素鈉一周后，出現(xiàn)煩躁不安、易激怒及毛色枯燥現(xiàn)象。相比對(duì)照組，飲食及飲水量明顯增多，而體重增加緩慢。對(duì)照組小鼠精神狀況、活動(dòng)情況及毛色光澤均未見明顯異常。甲狀腺功能T3、T4及TSH檢測結(jié)果顯示，基因敲入CaV1.1-R528H小鼠與野生型C57BL/6J小鼠之間差異無顯著性，而注射甲狀腺素組小鼠T3、T4均明顯高于相應(yīng)對(duì)照組，TSH明顯低于相應(yīng)對(duì)照組，且差異有顯著性(P<0.05)(表2)。

表1　生化指標(biāo)比較

注：與野生型同性別組比*P>0.05； 與同型雌性組比△P>0.05。

Note.*P>0.05,comparedwiththesamegenderofwildtypegroup;△P>0.05,comparedwiththefemalemiceofthesametypegroup.

表2　T3、T4及TSH指標(biāo)比較

注：與突變對(duì)照組比*P<0.05； 與野生對(duì)照組比△P<0.05。

Note:*P<0.05comparedwiththemutantcontrolgroup;△P<0.05comparedwiththewildcontrolgroup.

2.3突變、甲狀腺素及胰島素因素對(duì)血鉀的作用

2.3.1血鉀的變化(表3)

(1)胰島素對(duì)血鉀的影響

胰島素處理后，與基線值(0min)相比，野生+鹽水+胰島素組、突變+鹽水+胰島素組、野生+甲狀腺素+胰島素組、突變+甲狀腺素+胰島素組在處理后30min或60min血鉀均有下降趨勢，除野生+甲狀腺素+胰島素組外其他處理組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。鹽水處理后，野生小鼠血鉀水平有下降趨勢，但野生+鹽水組與突變+鹽水組之間同時(shí)間點(diǎn)相比并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；突變+甲狀腺素+鹽水組也觀察到血鉀下降趨勢；其他鹽水處理組血鉀均無明顯變化。

(2)突變對(duì)血鉀的影響

給予鹽水處理后，突變+鹽水組與野生+鹽水組兩組之間血鉀同時(shí)間點(diǎn)比較并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異；給予胰島素處理后，即突變+鹽水+胰島素組與野生+鹽水+胰島素組兩組之間血鉀同時(shí)間點(diǎn)比較也并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異；給予甲狀腺素處理制備成高甲狀腺素毒癥后，即突變+甲狀腺素+鹽水組與野生+甲狀腺素+鹽水組兩組之間血鉀同時(shí)間點(diǎn)比較也并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異；但在高甲狀腺素毒癥下給予胰島素處理后，即高甲狀腺素與高胰島素聯(lián)合作用下，突變+甲狀腺素+胰島素組與野生+甲狀腺素+胰島素組相比突變組血鉀在30min或60min時(shí)顯著低于野生組，差異有顯著性(P<0.05)。

2.3.2主效應(yīng)及交互作用

析因設(shè)計(jì)重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示，單獨(dú)突變因素或甲狀腺素因素對(duì)血鉀并沒有作用，僅有胰島素對(duì)降低血鉀有影響，且差異有顯著性(P<0.05)；甲狀腺素和突變因素之間以及胰島素和突變因素之間均有交互作用，差異有顯著性(P<0.05)，比較邊際均值提示有協(xié)同作用；甲狀腺素和胰島素之間無交互作用。

表3　不同處理組小鼠血鉀變化情況

注：與基線值(0min)比*P< 0.05； 與野生相同處理組比△P<0.05。

Note.*P<0.05,comparedwiththebaselinevalue;△P<0.05,comparedwiththesametreatmentgroupofwildtypemice.

3　討論

甲亢性低鉀型周期性麻痹是我國低鉀型周期性麻痹的主要發(fā)病類型，但目前我國對(duì)于THPP研究甚少，鑒于人體試驗(yàn)倫理原則的限制，建立甲亢性低鉀型周期性麻痹動(dòng)物模型用來研究THPP致病過程及發(fā)病機(jī)制顯得尤為重要，因此利用前期課題組構(gòu)建的基因敲入CaV1.1-R528H小鼠進(jìn)一步建立了甲亢性低鉀型周期性麻痹動(dòng)物模型。

實(shí)驗(yàn)中使用的基因敲入CaV1.1-R528H小鼠為傳代小鼠，傳代小鼠是否還攜帶突變基因，對(duì)其進(jìn)行了鑒定，結(jié)果證實(shí)該突變基因在傳代中不會(huì)發(fā)生丟失，能夠穩(wěn)定的遺傳到子代小鼠中。實(shí)驗(yàn)前對(duì)基因敲入CaV1.1-R528H小鼠與野生型C57BL/6J小鼠的生化指標(biāo)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示它們之間生化指標(biāo)并無差異，可以用C57BL/6J小鼠作為本實(shí)驗(yàn)的參考對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)需要多次取血，每次取血后需小鼠存活且狀態(tài)良好，而眼球和心臟取血容易使小鼠致死，因此只能通過鼠尾取血，而鼠尾取血量少，用傳統(tǒng)濕化學(xué)法測定其電解質(zhì)不易實(shí)現(xiàn)。選取干化學(xué)法測定電解質(zhì)，需血量少(約25μL)，可以滿足該實(shí)驗(yàn)需求。實(shí)驗(yàn)前課題組設(shè)計(jì)了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，對(duì)干化學(xué)法可以替代濕化學(xué)法測定小鼠血電解質(zhì)進(jìn)行了驗(yàn)證[10]。

甲亢性低鉀型周期性麻痹的發(fā)病特點(diǎn)是在本身遺傳缺陷基礎(chǔ)上由于高甲狀腺素毒癥和其他誘因如胰島素增多的聯(lián)合作用下，導(dǎo)致了疾病的發(fā)作。目前發(fā)現(xiàn)THPP存在鉀離子通道相關(guān)的突變，雖然還并未發(fā)現(xiàn)鈣離子通道存在突變，但該病確實(shí)有離子通道疾病的特點(diǎn)，因此利用前期課題組構(gòu)建的基因敲入CaV1.1-R528H小鼠，模擬人類甲亢性周期性麻痹發(fā)病特點(diǎn)，建立甲亢性低鉀型周期性麻痹動(dòng)物模型。首先，通過連續(xù)給予小鼠注射外源性左旋甲狀腺素鈉模擬人類高甲狀腺素毒癥，小鼠在注射左旋甲狀腺素鈉一周后，出現(xiàn)煩躁不安、易激怒及毛色枯燥現(xiàn)象，以及相比對(duì)照組體重增加緩慢，飲食及飲水量明顯增多。T3、T4及TSH檢測結(jié)果顯示，注射甲狀腺素組小鼠T3、T4均明顯高于相應(yīng)對(duì)照組，TSH明顯低于相應(yīng)對(duì)照組，成功的制備了小鼠高甲狀腺素毒癥。然后，在小鼠高甲狀腺素毒癥下給予胰島素處理，以生理鹽水作為對(duì)照，給予鹽水處理后，突變組和野生組小鼠之間血鉀同時(shí)間點(diǎn)比較并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異，給予單獨(dú)胰島素或高甲狀腺素毒癥處理后，兩組小鼠之間血鉀同時(shí)間點(diǎn)比較也并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在小鼠高甲狀腺素毒癥下，再聯(lián)合給予胰島素處理時(shí)，兩組血鉀在同時(shí)間點(diǎn)(30、60min)相比突變組顯著低于野生組，說明小鼠突變因素在高甲狀腺素毒癥和高胰島素血癥聯(lián)合作用下對(duì)血鉀有影響。且突變組小鼠血鉀相比基線值(0min)在30min或60min均明顯下降，60min時(shí)下降更明顯，下降幅度約為20%。人類正常平均血鉀為4.2mmol/L，當(dāng)血鉀低于3.5mmol/L時(shí)，即血鉀下降幅度約為17%時(shí)為低鉀血癥，與人類參考指標(biāo)相比小鼠血鉀下降的幅度達(dá)到了低鉀血癥[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示突變和甲狀腺素因素之間以及突變和胰島素因素之間具有交互作用，即它們相互聯(lián)合在一起時(shí)對(duì)血鉀有影響，但突變因素或甲狀腺素因素單獨(dú)對(duì)血鉀并沒有作用，與人類甲亢性低鉀型周期性麻痹的發(fā)病特點(diǎn)相符，說明運(yùn)用基因敲入CaV1.1-R528H小鼠成功的建立了甲亢性低鉀型周期性麻痹模型。

綜上所述，本研究首次運(yùn)用基因敲入CaV1.1-R528H小鼠成功的建立了甲亢性低鉀型周期性麻痹的動(dòng)物模型，且首次在整體動(dòng)物水平下誘發(fā)小鼠出現(xiàn)血鉀水平降低。以往對(duì)低鉀型周期性麻痹小鼠模型的研究中，多數(shù)是建立在細(xì)胞或組織水平，并且是在外源低鉀環(huán)境中觀察模型小鼠肌肉電生理特征變化，并沒有誘導(dǎo)出現(xiàn)自發(fā)性血鉀水平降低。但在本次實(shí)驗(yàn)研究中，野生型小鼠和高甲狀腺素毒癥突變小鼠在注射生理鹽水時(shí)，也有血鉀的下降，考慮可能與小鼠斷尾取血時(shí)應(yīng)激產(chǎn)生的高腎上腺素有關(guān)，有待以后進(jìn)一步給予麻醉處理后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。并且由于疾病特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)量有限，我們僅觀察到小鼠低鉀血癥的表現(xiàn)，并未觀察到甲亢性低鉀型周期性麻痹其他典型表現(xiàn)，如四肢癱瘓，有待以后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察。

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Evaluation of the CaV1.1-R528H gene knock-in mouse model ofthyrotoxichypokalemicperiodicparalysis

ZHIHong-ye1,XUHong-yan1,CHENYing-ying2,CHENYa-ning2,ZHOULi-jun3,ZHANDa-wei4,YANKe-song4,YAOHe-bin1,2*

(1.NavalClinicalCollegeofAnhuiMedicalUniversity,Beijing100048,China; 2.DepartmentofEndocrinology,NavyGeneralHospitalofChinesePeople′sLiberationArmy,Beijing100048; 3.CenterofNavalBattleWoundBasicMedicalSciences,NavyGeneralHospitalofChinesePeople’sLiberationArmy,Beijing100048;4.DepartmentofLaboratoryAnimals, 304HospitalofChinesePeople’sLiberationArmy,Beijing100048)

ObjectiveToestablishandevaluatetheCaV1.1-R528Hgeneknock-inmousemodelofthyrotoxichypokalemicperiodicparalysis.MethodsThirty-six8-week-oldmaleCaV1.1-R528Hgeneknock-inmiceandthirty-six8-week-oldwild-typemaleC57BL/6Jmicewereusedinthisstudy.Usingthree-factortwo-level2 × 2 × 2factorialdesign(thethreefactorsincludingmutation,thyroxineandinsulin,andtwolevelswerewithorwithout),themiceweredividedinto8groups.Thethyroxinegroupswereintraperitoneallyinjectedwithlevothyroxineinadoseof350μg/kgonceperdayfor12consecutivedaystoproducethyrotoxicosis.Theinsulingroupswereintraperitoneallyinjectedwithshort-actinginsulininadoseof0.8U/kgafterthelastadministrationoflevothyroxine,andthepotassiumlevelsofdifferentgroupsweremeasuredandrecordedbefore(0min)andafterinsulininjection(30min, 60min).Results(1)Comparedwiththecontrolgroup,thefollowingphenomenaincludingirritability,dullcoat,increaseddietandwaterintake,andslowbodyweightgain,wereobservedinthethyrotoxicmice.ThyroidfunctiontestsshowedthatthelevelsofT3andT4inthethyrotoxicmiceweresignificantlyhigherthanthoseinthecorrespondingcontrolmice(P<0.05),andtheTSHlevelwassignificantlylowerthanthatofthecorrespondingcontrolmice(P<0.05 ). (2)Afteradministrationofinsulinorthyroxinealone,thepotassiumlevelsinthemutantandwild-typemicewerenotsignificantlydifferent.However,aftercombinedadministrationofthyroxineandinsulin,thepotassiumlevelsinthemutantgroupweresignificantlylowerthanthoseinthewild-typemiceat30minand60min( P<0.05forboth). (3)Themaineffectsandinteractions:Mutationfactororthyroxinefactoralonedidnotinfluenceonthepotassiumlevel,onlyinsulinshowedhypokalemiceffect(P<0.05).Therewereinteractionsbetweenthyroxineandmutation,andbetweeninsulinandmutation(P<0.05),butnointeractionbetweenthyroxineandinsulin.Conclusions(1)Athyrotoxicosisstateinmiceissuccessfullydevelopedinthisstudy. (2)AnCaV1.1-R528Hgeneknock-inmousemodelofthyrotoxichypokalemicperiodicparalysisissuccessfullyestablished.

Thyrotoxichypokalemicperiodicparalysis;Geneknock-in；CaV1.1-R528Hmice;Thyrotoxicosis;Insulin

YAOHe-bin,Email:yhb196321@163.com

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：30671006；81170800)；北京市自然科學(xué)基金(編號(hào)：7154240)。

智紅葉(1983-)，女，碩士生，內(nèi)分泌與代謝病專業(yè)。E-mail:hongye111124@126.com

姚合斌(1963-)，男，博士，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向：內(nèi)分泌與代謝病。E-mail:yhb196321@163.com

研究報(bào)告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0369-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.007

2016-04-15