葉致豪，許文豪，劉慶華，沈金花，彭勇波

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點實驗室，武漢　430074)

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小鼠氣管平滑肌原代細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定

葉致豪，許文豪，劉慶華，沈金花，彭勇波*

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點實驗室，武漢430074)

目的建立一種可靠的通過組織塊貼壁法分離培養(yǎng)原代小鼠氣管平滑肌細(xì)胞及免疫組化鑒定的方法。方法體視顯微鏡下立體分離小鼠氣管平滑肌組織，組織塊貼壁法培養(yǎng)原代細(xì)胞，對分離培養(yǎng)細(xì)胞通過免疫組化方法進(jìn)行鑒定，并用MTT法對其增殖特性進(jìn)行檢測。結(jié)果從BALB/c雄性小鼠分離氣管平滑肌組織，剪碎為1mm3，用含1%青-鏈霉素的PBS及培養(yǎng)液漂洗，使組織塊貼于培養(yǎng)皿底，并加入5mL培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3～5d后有明顯梭狀細(xì)胞從組織塊爬出，5～6d后，細(xì)胞可見明顯“峰-谷”結(jié)構(gòu)。經(jīng)免疫熒光鑒定，在傳代、純化后，可得純度為99%以上的氣管平滑肌細(xì)胞。用MTT法測量其生長曲線。結(jié)論本方法操作簡單、經(jīng)濟(jì)，獲得的氣管平滑肌細(xì)胞具有較好增殖能力，細(xì)胞數(shù)量和純度能夠滿足后續(xù)細(xì)胞生物學(xué)實驗研究的需要。

氣管平滑肌細(xì)胞；原代培養(yǎng)；組織塊貼壁法；免疫熒光；MTT法；小鼠

哮喘是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病，目前我國有約2000萬人罹患哮喘[1, 2]。近些年，由于霧霾等空氣質(zhì)量與環(huán)境污染程度的日益惡劣，呼吸系統(tǒng)疾病也逐漸成為了全世界范圍影響人類健康最嚴(yán)重的慢性疾病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2025年，世界上將會有4億人患上哮喘[3, 4]。

哮喘發(fā)病癥狀眾多，早期表現(xiàn)為過敏性炎癥[5]，后期由于氣管平滑肌增生[6, 7]，阻塞氣管，導(dǎo)致氣道狹窄、氣道高反應(yīng)[5]及氣道重塑[8, 9]，患者出現(xiàn)胸悶、氣喘等癥狀，嚴(yán)重時危及生命。因此，對哮喘的發(fā)病機(jī)理與治療的研究是至關(guān)重要的。

在對哮喘發(fā)病機(jī)制的研究中，氣管平滑肌是針對氣道阻塞性癥狀的主要研究目標(biāo)之一[10, 11]，針對氣管平滑肌細(xì)胞(airwaysmoothmusclecells,ASMCs)的形態(tài)學(xué)觀察與細(xì)胞增殖速率的測量是在細(xì)胞生物學(xué)水平研究哮喘發(fā)病機(jī)制的常用手段。因此, 成功建立ASMCs的原代培養(yǎng)技術(shù)十分關(guān)鍵。原代細(xì)胞培養(yǎng)的方法通常有酶消化法[12, 13]與組織塊貼壁法[14, 15]，但對于不同特性的不同組織，兩種方法并不是都適用。尤其是對于氣管平滑肌細(xì)胞，盡管已有文獻(xiàn)采用上述兩種方法分離原代ASMCs的報道，但氣管平滑肌組織量較少，使用酶消化法時酶解時間與酶濃度不好控制[16]，組織貼壁法也存在原代細(xì)胞密度不均、細(xì)胞爬出慢等問題[17]。本研究針對現(xiàn)有氣管平滑肌細(xì)胞原代分離培養(yǎng)中存在的問題，旨在建立一種簡單經(jīng)濟(jì)的ASMCs原代培養(yǎng)與鑒定的方法，為獲得足夠數(shù)量、較高純度的ASMCs用于后續(xù)哮喘發(fā)病機(jī)制的研究及治療哮喘疾病的藥物篩選奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

1.1.2試劑耗材

維納斯鑷子，維納斯剪，超凈工作臺，二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，體視顯微鏡，恒溫水浴鍋，酶標(biāo)儀，激光共聚焦顯微鏡(LSM-700)。0.25% 胰蛋白酶，75%乙醇，95%乙醇，酒精燈，圓形蓋玻片，0.22μm濾膜，6cm培養(yǎng)皿，6孔板，96孔板，二甲基亞砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸(glycine)。①培養(yǎng)液100mL: 78mLDMEM(high-glucose,Hyclone)、20mL胎牛血清(FBS,Hyclone)、1mL青-鏈霉素 (Hyclone)、1mL200mmol/LL-谷氨酰胺(L-Glu)。②一抗：Anti-α-smoothmuscleactin[EPR5368] (Abcam)。③二抗：GoatAnti-RabbitIgG,FITCConjugated(康為世紀(jì))。④PBS：NaCl10g，KCl0.25g，Na2HPO4·12H2O3.62g，KH2PO40.25g，調(diào)pH=7.4。⑤MTT母液：5mg/mLMTT溶于PBS，調(diào)pH=7.4。⑥MTT工作液：MTT母液∶DMEM=1∶9。Propidiumiodide(PI,Biosharp).

1.2方法

1.2.1氣管平滑肌的分離

用斷頸法處死小鼠后，除口鼻部之外全身浸泡在75%乙醇中片刻，避免乙醇進(jìn)入呼吸道而損傷氣管平滑肌。將小鼠從乙醇中取出，用大頭針固定在解剖板上，用75%乙醇浸泡過的手術(shù)器械從小鼠的胸腹部剪開皮膚至下顎，再從正中間剪開肋骨，暴露胸腔內(nèi)部，除去心臟及其余組織，小心取出完整的氣管與肺組織。把取出的組織放置在體視顯微鏡下，浸泡在含有1%青-鏈霉素的PBS中，用維納斯剪與鑷子精準(zhǔn)地剪去食管及其余組織。從軟骨環(huán)的一側(cè)剖開氣管，可見中部平行條紋的氣管平滑肌組織，并將其分離出來。

1.2.2原代細(xì)胞培養(yǎng)

將分離出的氣管平滑肌組織剪碎為1mm3的小塊，放入內(nèi)盛1% 青-鏈霉素的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)入超凈工作臺中漂洗片刻；將組織塊轉(zhuǎn)至培養(yǎng)液中漂洗片刻，再放置在干燥的6cm培養(yǎng)皿。放入的組織塊按合適的間隔密集地鋪滿皿底。隨后將培養(yǎng)皿放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，倒置放置20～30min，組織塊會因干涸而貼在皿底。從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)皿，加入5mL培養(yǎng)液，放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，3～5d后即會有細(xì)胞爬出，之后每兩天換1次培養(yǎng)液。

1.2.3細(xì)胞傳代

“中國市場作為全球農(nóng)業(yè)市場的核心之一，受到了西班牙海拉的高度關(guān)注，積極將優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)中國農(nóng)業(yè)?！蔽靼嘌篮＠境隹诓拷?jīng)理Antonio Arres表示，為滿足中國市場的需求，西班牙海拉已提前做好了產(chǎn)能準(zhǔn)備，今后將攜手瑞豐生態(tài)，在技術(shù)、產(chǎn)品、品牌等多方面繼續(xù)深度合作，將優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品與種植理念與中國市場相融合。

組織塊周圍細(xì)胞生長至逐漸融合80% 左右時，即可傳代。吸凈培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入5mLPBS，輕輕晃動培養(yǎng)皿，將PBS吸凈。向培養(yǎng)皿中加入1mL0.25%胰蛋白酶，覆蓋整個皿底，輕輕晃動，片刻后吸出大部分胰酶。將培養(yǎng)皿放入37℃培養(yǎng)箱中放置1～2min左右，取出培養(yǎng)皿，輕輕拍打，在顯微鏡下觀察到絕大部分細(xì)胞浮起。用1mL的培養(yǎng)液收集細(xì)胞，均勻滴入兩個含有4.5mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，前后、左右輕晃分散細(xì)胞，顯微鏡觀察到細(xì)胞均勻分散后，放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4細(xì)胞純化

經(jīng)原代培養(yǎng)所得的細(xì)胞中會含有少部分的氣管上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，氣管上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞一般在半小時內(nèi)就可以貼壁，而氣管平滑肌細(xì)胞一般至少需1～4h貼壁[18]。利用氣管平滑肌細(xì)胞與其他細(xì)胞貼壁時間不同的特性，就可以將培養(yǎng)皿中的氣管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行純化。利用上述細(xì)胞傳代的方法，將一皿中融合率達(dá)80%左右的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化制備成細(xì)胞懸液，1∶1傳入一新的培養(yǎng)皿；30～60min后，小心地吸出上層細(xì)胞懸液(此懸液即含有還未貼壁的氣管平滑肌細(xì)胞)，轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿中。反復(fù)幾次，即可得到較純的氣管平滑肌細(xì)胞。

1.2.5細(xì)胞免疫熒光

將一皿生長至80%左右的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后用1mL培養(yǎng)液收集細(xì)胞。取經(jīng)過乙醇消毒后的干凈的圓形蓋玻片，逐一放入六孔板中，每個蓋玻片上滴1～2滴細(xì)胞懸液，隨后小心地放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，細(xì)胞將會貼附于蓋玻片上。接下來，PBS洗2～3次，每次1min；4%多聚甲醛固定30min；PBS洗2～3次，每次1min；0.5%TritonX-100孵育20min；PBS洗2～3次，每次1min；50mmol/Lglycine孵育20min；PBS洗2～3次，每次1min；20g/LBSA封閉30min。轉(zhuǎn)入濕盒中。一抗anti-α-smoothmuscleactin(1∶300)孵育1h；20g/LBSA洗3次，每次5min；二抗FITC(1∶50)孵育1h；20g/LBSA洗3次，每次5min；PI染料(50μg/mL)孵育30min；PBS洗3次，每次5min。在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6細(xì)胞增殖

將細(xì)胞消化后所得的細(xì)胞懸液按照1×105個/mL的密度種入96孔板，每個孔內(nèi)加入細(xì)胞懸液100μL，96孔板的最外圈全部加入100μL的PBS，防止蒸發(fā)。培養(yǎng)1d后，開始用于實驗。將待測孔中的培養(yǎng)液全部吸出，加入MTT工作液100μL。37℃培養(yǎng)4h后，吸盡MTT工作液，加入150μLDMSO，放入37℃恒溫的酶標(biāo)儀中測量其在492nm的吸光度[19, 20]。每一天測量一列細(xì)胞的吸光度，連續(xù)測量。培養(yǎng)中的細(xì)胞也需要按時換液。

2　結(jié)果

2.1ASM原代細(xì)胞

建立原代培養(yǎng)的3～5d后，通過顯微鏡觀察，可見組織塊周圍有少許細(xì)胞爬出，細(xì)胞呈梭形或多角梭形(圖1A)。繼續(xù)培養(yǎng)，組織塊周圍的細(xì)胞會生長至融合，呈現(xiàn)出原代氣管平滑肌細(xì)胞典型的“峰-谷”樣結(jié)構(gòu)(圖1B)。經(jīng)傳代、純化后，可以得到比較純的氣管平滑肌細(xì)胞(圖1C)。傳代細(xì)胞與原代細(xì)胞的表觀特性與生長特性基本相同。

2.2細(xì)胞免疫熒光

通過對平滑肌內(nèi)特異性表達(dá)的α-smoothmuscleactin(α-SMA) 進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光實驗，激光共聚焦顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光所示與細(xì)胞縱軸方向平行的纖維即為α-SMA，紅色熒光為PI染料顯示出的細(xì)胞核(圖2)?？梢姎夤芷交〖?xì)胞的純度可達(dá)99% 以上。

2.3ASMCs增殖曲線

氣管平滑肌在傳代后生長速度逐漸加快，在3～4d到達(dá)對數(shù)生長期，生長最為迅速；5d之后到達(dá)生長的平臺期，細(xì)胞間發(fā)生接觸抑制，細(xì)胞生長逐漸停滯，并出現(xiàn)略微的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(圖3)。

3　討論

細(xì)胞原代分離培養(yǎng)技術(shù)主要包括組織塊貼壁法和單酶(胰酶[21]或膠原酶[22])或酶聯(lián)消化法[23]，但消化法非常難以控制所運用酶的濃度、濃度比例及消化時間，很容易造成細(xì)胞消化過度而損傷細(xì)胞或并不能完全消化而使細(xì)胞分散[16]，比較適合于大塊的組織[22]；其次，各種酶也都價格不菲。與此相對的是，組織塊貼壁法[14, 15]能較好避免上述酶消化法的問題。本文采用的經(jīng)改進(jìn)后的組織塊貼壁法十分方便、經(jīng)濟(jì)，細(xì)胞自由地從組織塊游出也不會損傷細(xì)胞的活性；組織塊爬出的速度也較快，適當(dāng)?shù)慕M織塊間隔保證了細(xì)胞的數(shù)量與生長的狀態(tài)；同時，經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定，培養(yǎng)出的細(xì)胞純度也較高，不需要多代傳代培養(yǎng)純化，且分離細(xì)胞可多次傳代，表現(xiàn)出較好增殖特性。因此，針對氣管平滑肌的原代細(xì)胞培養(yǎng)，組織塊貼壁法是更為合適的一種方法。

注：A: 建立原代培養(yǎng)后3 d左右，氣管平滑肌細(xì)胞從組織塊爬出。B: 5～6 d后，組織塊周圍的細(xì)胞逐漸生長，部分融合，呈現(xiàn)出原代氣管平滑肌細(xì)胞生長的典型“峰-谷”樣結(jié)構(gòu)。C: 經(jīng)傳代、純化后的氣管平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞呈梭形或長梭形，部分為多角形，并含有一個或數(shù)個足突。圖1　氣管平滑肌原代細(xì)胞Note. A. Cells grew out from tissue pieces within 3 to 5 days. B. Cells cultured after 5 to 6 days, “hill-valley” structure can be observed. C. ASMCs after cell passage and purification are fusiform or long-fusiform, some of which have one or more projections.Fig.1　Primary ASMCs

注：T-PMT：透射光；綠色熒光為α-SMA；紅色熒光為細(xì)胞核。圖2　氣管平滑肌細(xì)胞的免疫熒光鑒定Note. T-PMT. Transmission light; Green fluorescence: α-SMA; Red fluorescence. Nucleus.Fig.2　Identification of ASMCs by immunofluorescence microscopy.

注：A: 接種細(xì)胞后的第1 ～7天，通過MTT法處理細(xì)胞后，利用酶標(biāo)儀測量其在492 nm處的吸光度(A492, n=6, Mean±SEM)。B:通過MTT法所得吸光度，繪制氣管平滑肌細(xì)胞的生長曲線。圖3　氣管平滑肌細(xì)胞生長曲線Note. A. Day 1 to 7 after cell seeding, measuring the absorbance of 492 nm after MTT treatment (A492, n=6, Mean±SEM). B. The growth curve of ASMCs was constructed with absorbance by MTT assay.Fig.3　The growth curve of the ASMCs.

在本實驗中，我們主要通過做到以下幾點提高氣管平滑肌細(xì)胞分離培養(yǎng)的成功率。①選擇年齡較小的小鼠(5～6周為宜)。因為年齡較小的小鼠還處于生長發(fā)育時期，細(xì)胞的生長還比較旺盛，原代氣管平滑肌更易爬出。②解剖小鼠所用的實驗器械都需經(jīng)75%乙醇浸泡消毒，在超凈工作臺中使用的器械還需經(jīng)酒精燈火焰灼燒，以防止原代培養(yǎng)細(xì)胞污染。③在解剖小鼠的過程中都必須盡量避免氣管平滑肌組織的過度牽拉，以保證氣管平滑肌組織的活性，提高細(xì)胞爬出率。④組織塊轉(zhuǎn)入干燥的培養(yǎng)皿的時候可將組織塊稍稍瀝干，這樣組織塊會更快地干涸，使組織塊暴露在無培養(yǎng)液的環(huán)境下的時間盡可能的短。⑤組織塊在培養(yǎng)皿中的排列間隔需要合適。組織塊的排列不宜太密，細(xì)胞太密集會有接觸抑制現(xiàn)象；也不宜太稀疏，細(xì)胞密度太低會導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢，甚至停滯。⑥在原代細(xì)胞培養(yǎng)的前3d都不需要換液，使培養(yǎng)皿在細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置，以免影響細(xì)胞爬出。

總之，本文提供了一種經(jīng)濟(jì)又方便的以組織塊貼壁法為基礎(chǔ)的氣管平滑肌原代細(xì)胞培養(yǎng)方法，能在短時間內(nèi)獲得數(shù)量較多且較純的原代氣管平滑肌細(xì)胞，可滿足在細(xì)胞水平上針對氣管平滑肌細(xì)胞相關(guān)實驗的需要，為哮喘等與氣管平滑肌相關(guān)呼吸道疾病的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Isolation, culture and identification of primary airwaysmoothmusclecellsfrommice

YEZhi-hao,XUWen-hao,LIUQing-hua,SHENJin-hua,PENGYong-bo*

(HubeiProvincialKeyLaboratoryforProtectionandApplicationofSpecialPlantsinWulingAreaofChina,InstituteofMedicalBiology,SchoolofLifeScience,South-CentralUniversityforNationalities,Wuhan430074,China)

ObjectiveTodevelopareliablemethodfortheprimarycultureofairwaysmoothmusclecells(ASMCs)frommicebyadherenttissuecultureandtoidentifythembyimmunofluorescencemicroscopy.MethodsAirwaysmoothmuscle(ASM)tissuewasisolatedfromBALB/cmiceunderdissectingmicroscope,andcutinto1mm3pieces.ThesetissueblockswerewashedwithPBSwith1%penicillinandstreptomycin,andadheredon6cmculturedishwith5mLculturemedia.Thedisheswereincubatedat37℃inanincubatorwith5%CO2.TheobtainedprimaryASMCswereidentifiedbyimmunofluorescencemicroscopy,andthecellproliferationwasmeasuredbyMTTassay.ResultsWeobservedthatobviousfusiformcellsgrewoutfromtissueblockswithin3to5days.After5to6days, “hill-valley”structurewasobserved.Aftercellpassageandpurification,theimmunofluorescencemicroscopyshowedthatthepurityofisolatedASMCsreachedupto99%.ThegrowthcurveofASMCswasconstructedbyMTTassay.ConclusionsObtainedASMCsfromthissimpleandeconomicalmethodshowapreferableproliferationability,densityandpurity,andcansatisfytheneedforcellbiologyresearch.

Airwaysmoothmusclecells,SMCs;Primaryculture;Tissuesectionadherence;Immunofluorescence;MTTassay;Mice

PENGYong-bo.E-mail:pyb1980@mail.scuec.edu.cn

國家自然科學(xué)基金項目(30900816, 31371307)；湖北省自然科學(xué)基金項目(2014CFC116)。

葉致豪(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：氣管平滑肌細(xì)胞及哮喘相關(guān)功能基因分析。

彭勇波，研究方向：氣管平滑肌細(xì)胞及哮喘相關(guān)功能基因分析。E-mail：pyb1980@mail.scuec.edu.cn

研究報告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0364-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.006

2016-01-25