李濤，周曉東*，李炳，羅秀梅，龔哲平

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院，上?！?01508；2.上海市蒙山中學(xué)，上?！?01508)

?

M4受體阻滯劑MT3抑制豚鼠形覺剝奪性近視的探討

李濤1，周曉東1*，李炳1，羅秀梅1，龔哲平2

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院，上海201508；2.上海市蒙山中學(xué)，上海201508)

目的探討高度選擇性M4受體阻滯劑MT3對豚鼠形覺剝奪性近視的抑制作用及其潛在作用機理。方法3周齡豚鼠隨機分為三組：對照組、形覺剝奪組、形覺剝奪+MT3組。實驗前后使用帶狀光檢影測量屈光度，A超測量眼生物學(xué)參數(shù)，RT-PCR檢測視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中TGF-β2的mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果與對照組右眼相比，形覺剝奪+MT3組豚鼠右眼形成了(-1.44±0.50)D相對近視(右眼-左眼)，玻璃體腔和眼軸長度分別延長(0.10±0.02)mm和(0.14±0.07)mm(P =0.001，P<0.001，P<0.001)，但近視量、玻璃體腔和眼軸長度增加量均顯著小于單純形覺剝奪組(P<0.001，P<0.001，P<0.001)。單純形覺剝奪可引起視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜TGF-β2的mRNA相對表達(dá)量下調(diào)(P<0.001，P =0.014)；而玻璃體腔注射MT3可導(dǎo)致形覺剝奪眼視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜TGF-β2的mRNA相對表達(dá)量上調(diào)(P<0.001，P<0.001)。結(jié)論MT3能抑制豚鼠形覺剝奪性近視的形成，其可能通過上調(diào)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中TGF-β2的mRNA水平而發(fā)揮作用。

M4受體阻滯劑；MT3；形覺剝奪性近視；TGF-β2；豚鼠

近視已成為世界上最常見的眼科疾病之一，目前已報道有多種藥物可以抑制實驗性近視的形成和發(fā)展。有研究表明，高度選擇性M4受體阻滯劑MT3能有效抑制小雞[1, 2]和樹鼩[3]的形覺剝奪性近視。但其具體作用機制未見相關(guān)報道。TGF-β是一類多功能的細(xì)胞因子，生物學(xué)活性以TGF-β2為主，其在形覺剝奪性近視形成過程中發(fā)揮重要作用[4]。本研究通過建立豚鼠形覺剝奪性近視模型，探討MT3對豚鼠形覺剝奪性近視的抑制作用，進(jìn)而闡述TGF-β2在形覺剝奪性近視中的表達(dá)變化以及MT3的潛在作用機理。

1　材料和方法

1.1實驗動物

普通級3周齡英國種短毛三色雄性豚鼠32只，購自上海市松江區(qū)松聯(lián)動物養(yǎng)殖場【SCXK(滬)2012-0008】，體重為140～150g，按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。在復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院動物房【SYXK(滬)2010-0098】中飼養(yǎng)4周，保持室溫在20～26 ℃，濕度50%，采用日光燈照明，光照周期12h∶12h；自由攝食、進(jìn)水。

1.2實驗分組

24只豚鼠隨機分為三組：①對照組：8只，雙眼不進(jìn)行任何干預(yù)，正常開放飼養(yǎng)4周；②形覺剝奪組：8只，右眼形覺剝奪4周，根據(jù)李濤等[5]的方法建立形覺剝奪性近視模型；③形覺剝奪+MT3組：8只，右眼形覺剝奪4周，同時每2d進(jìn)行玻璃體腔注射1次MT3(0.1mg/瓶，日本PeptideInstitute公司)。玻璃體腔注射方法：使用25μL微量注射器于豚鼠右眼上方角膜緣后1mm處進(jìn)針注入10μL(10μmol/L)MT3，注射藥物劑量和濃度參照既往文獻(xiàn)報道[1]。其余8只豚鼠在實驗前處死，并取材和測量視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜TGF-β2的mRNA水平。

1.3眼生物學(xué)參數(shù)測量

分別在實驗前和實驗干預(yù)4周后進(jìn)行如下眼生物學(xué)參數(shù)測量：

1.3.1屈光度測量

右眼使用睫狀肌麻痹劑復(fù)方托吡卡胺滴眼液(參天制藥有限公司，中國)，每5min滴1次，共4次，30min后進(jìn)行帶狀光檢影驗光(YZ24型，中國蘇州六六公司)，由驗光經(jīng)驗豐富的檢查者檢影(散光以半量計入球鏡)。

1.3.2眼軸長度測量

應(yīng)用SuperSW1000 眼科A超測量儀，A超頻率為11MHz，測量前先行角膜表面麻醉，測量時探頭對準(zhǔn)角膜中心并垂直于角膜平面。A超測量眼軸、前房深度和晶體厚度，每次測量5 次取平均值，精確到0.01mm，眼軸平均值減去前房深度平均值和晶體厚度平均值得出玻璃體腔長度平均值。

1.4標(biāo)本收集

分別于實驗前(3周齡)和實驗干預(yù)4周(7周齡)時，處死豚鼠，摘取右眼。在冰塊上快速分離視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜，隨后保存于-80℃冰箱。

1.5RT-PCR

按照TRIzolRNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書操作，提取視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織總RNA，紫外分析測定所抽提RNA的濃度。根據(jù)Invitrogen公司的M-MLV操作說明書進(jìn)行,均為RNase-free操作，合成cDNA。根據(jù)Genbank中的基因序列，以Primer5.0軟件設(shè)計特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。TGF-β2引物序列如下：Forwardprimer：5′-TACCGTTACTGTGGCTACTGG-3′；Reverseprimer：5′-TAATTTGGACAGGATCTGACCG-3′。PCR反應(yīng)條件：預(yù)發(fā)性95℃，2min；之后每一步發(fā)性95℃，15s；退火延伸60℃，30s；共進(jìn)行45個循環(huán)；每次在延伸階段60℃讀取吸光值?？截怌T值，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。以GAPDH為內(nèi)參，引物序列如下：Forwardprimer：5′-AAAGGCATCTTGGGCTACACCG-3′；Reverseprimer：5′-ATGAGGTCCACCACCCTGTTG-3′。

1.6統(tǒng)計分析

2　結(jié)果

2.1眼生物學(xué)參數(shù)變化

24只豚鼠均呈遠(yuǎn)視狀態(tài)，3組間豚鼠右眼和組內(nèi)豚鼠雙眼間屈光度、眼軸長度、前房深度、晶體厚度及玻璃體腔長度差異均無顯著性(所有P>0.05)。經(jīng)過4周實驗干預(yù)后，3組間豚鼠雙眼生物學(xué)參數(shù)見表1。與對照組右眼相比，形覺剝奪組右眼誘導(dǎo)出(-5.44±1.05)D相對近視(右眼-左眼)，玻璃體腔和眼軸長度分別延長(0.45±0.02)mm和(0.38±0.04)mm(P<0.001，P<0.001，P<0.001)；形覺剝奪+MT3組豚鼠右眼形成了(-1.44±0.50)D相對近視，玻璃體腔和眼軸長度分別延長(0.10±0.02)mm和(0.14±0.07)mm(P =0.001，P<0.001，P<0.001)，但近視量、玻璃體腔和眼軸長度增加量顯著小于單純形覺剝奪組(P<0.001，P<0.001，P<0.001)。而4周實驗干預(yù)后，3組間前房深度和晶體厚度差異無顯著性(P =0.329，P =0.088)。

表1　4周實驗結(jié)束后豚鼠右眼和左眼屈光度和眼生物學(xué)參數(shù)

注：aP<0.05，與對照組相比；bP<0.05，與形覺剝奪組相比。

Note.aP<0.05,comparedwiththecontrolgroup;bP<0.05,comparedwiththeformdeprivationgroup.

2.2TGF-β2mRNA相對表達(dá)量變化

為了解TGF-β2的mRNA水平變化規(guī)律，我們首先對3周齡豚鼠進(jìn)行了視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜TGF-β2的mRNA相對表達(dá)量檢測。隨著豚鼠成長，視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜TGF-β2的mRNA相對表達(dá)量顯著增加(見圖1和2)。7周齡豚鼠視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜TGF-β2的mRNA相對表達(dá)量顯著高于3周齡豚鼠(P<0.001，P<0.001)。經(jīng)過4周單純形覺剝奪后，與對照組右眼相比，形覺剝奪組右眼視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜TGF-β2的mRNA相對表達(dá)量下調(diào)(P<0.001，P =0.014)；而玻璃體腔注射MT3可以引起形覺剝奪眼視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜TGF-β2的mRNA相對表達(dá)量上調(diào)(P<0.001，P<0.001)(見圖1、2)。

注：a，3周齡組；b，7周齡正常對照組；c，形覺剝奪組；d，形覺剝奪+MT3組?！鳎号c3周齡組相比；*：與對照組相比；#：與形覺剝奪組相比。圖1　各組間視網(wǎng)膜TGF-β2的mRNA相對表達(dá)量Note. A: 3-week group; b: 7-week control group; c: Form deprivation group; d: Form deprivation + MT3 group.△: Compared with the 3-week group; *: Compared with the control group; #: Compared with the form deprivation group.Fig.1　Relative mRNA expression of retinal TGF-β2 among different groups.

注：a，3周齡組；b，7周齡正常對照組；c，形覺剝奪組；d，形覺剝奪+MT3組?！鳎号c3周齡組相比；*：與對照組相比；#：與形覺剝奪組相比。圖2　各組間脈絡(luò)膜TGF-β2的mRNA相對表達(dá)量Note. A: 3-week group; b: 7-week control group; c: Form deprivation group; d, Form deprivation + MT3 group. △: Compared with the 3-week group;*: Compared with the control group; #: Compared with the form deprivation group.Fig.2　Relative mRNA expression of choroidal TGF-β2 among the different groups.

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)高度選擇性M4受體阻滯劑MT3能顯著抑制豚鼠形覺剝奪性近視，減少玻璃體腔和眼軸長度的延長量。在形覺剝奪聯(lián)合玻璃體腔注射MT3組的豚鼠右眼中，與正常對照組和單純形覺剝奪組右眼相比，其視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的TGF-β2mRNA相對表達(dá)量顯著上調(diào)。

既往研究表明非選擇性M受體阻滯劑阿托品[6]、消旋山莨菪堿[7]、環(huán)噴托酯[8]以及選擇性M1/M4受體阻滯劑哌侖西平[9]等能夠抑制形覺剝奪性近視，但這些藥物會引起不同程度的瞳孔散大、調(diào)節(jié)麻痹等副作用。而MT3作為高度選擇性M4受體阻滯劑，其對M4受體的親和力是M1受體的102倍[10]，能夠使用最小劑量直接作用于目標(biāo)受體，減少因結(jié)合其他亞型M受體(如M3等)而產(chǎn)生的副作用。McBrien等[1]報道MT3能有效抑制小雞的形覺剝奪性近視以及預(yù)防近視伴隨的脈絡(luò)膜變薄。抑制作用最大的為玻璃體腔注射10μmol/L的MT3，隨后是2.5μmol/L，抑制作用最小的則是250nmol/L。這說明玻璃體腔注射MT3的抑制效應(yīng)具有劑量依賴性，玻璃體腔中MT3的注射濃度越大，對形覺剝奪性近視的抑制作用越強。Nickla等[2]發(fā)現(xiàn)MT3能抑制小雞的形覺剝奪性近視，但對離焦性近視沒有抑制作用。Arumugam等[3]證實了MT3對哺乳動物樹鼠的形覺剝奪性近視也具有抑制作用。本研究根據(jù)McBrien等[1]的報道，對豚鼠采取玻璃體腔注射10μM的MT3，發(fā)現(xiàn)MT3能減少約74%的相對近視量。這說明MT3對豚鼠形覺剝奪性近視同樣具有抑制作用。

但MT3對形覺剝奪性近視產(chǎn)生抑制效應(yīng)的機制未見相關(guān)報道。既往研究表明TGF-β2作為多功能的細(xì)胞因子，在動物實驗性近視形成中具有重要作用，但關(guān)于TGF-β2的表達(dá)變化規(guī)律仍有爭議。Honda等[11]發(fā)現(xiàn)小雞的近視眼中視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的TGF-β2的蛋白和mRNA水平是減少的。周凌霄等[12]發(fā)現(xiàn)豚鼠形覺剝奪性近視的視網(wǎng)膜TGF-β2表達(dá)下調(diào)。然而，Seko等[13]和Kusakari等[14]發(fā)現(xiàn)在小雞的近視眼中，視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和鞏膜中TGF-β2含量是增加的。在樹鼠的近視模型中，視網(wǎng)膜中TGF-β2的蛋白和mRNA水平未發(fā)生顯著變化[15]，而鞏膜中TGF-β2的mRNA表達(dá)是減少的[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)3周齡的豚鼠視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中均存在TGF-β2表達(dá)，隨著豚鼠的自然生長，其TGF-β2的mRNA相對表達(dá)量也隨之增加。形覺剝奪可引起豚鼠視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜TGF-β2的mRNA相對表達(dá)量下調(diào)，這與Honda等[11]和周凌霄等[12]的結(jié)果一致。TGF-β2能誘導(dǎo)纖溶酶原激活物抑制物(PAI-1)的產(chǎn)生，使得纖溶酶原激活物(PA)活性下降。PA不僅能夠直接降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，還可激活其下游的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，影響ECM降解。形覺剝奪時，TGF-β2活性下降，導(dǎo)致PAI-1的合成下降，PA活性增加, 引起MMP活性增加，從而發(fā)揮其蛋白水解酶功能使ECM過度降解，引起鞏膜組織重塑[17]。而MT3則可導(dǎo)致豚鼠形覺剝奪眼視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜TGF-β2的mRNA相對表達(dá)量上調(diào)，我們推測MT3可能通過上調(diào)形覺剝奪眼視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中TGF-β2，進(jìn)而誘發(fā)一系列信號通路變化，減少鞏膜組織重塑，維持鞏膜生物力學(xué)性能，抑制形覺剝奪性近視的形成。此外，我們發(fā)現(xiàn)形覺剝奪聯(lián)合玻璃體腔注射MT3組中，視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中TGF-β2的mRNA相對表達(dá)量均高于正常對照組，但仍形成了形覺剝奪性近視，說明在形覺剝奪性近視的形成過程中，TGF-β2可能并非唯一變化的細(xì)胞因子，還有其他信號通路參與近視的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，高度選擇性M4受體阻滯劑MT3能抑制豚鼠形覺剝奪性近視的形成，其可能通過上調(diào)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中TGF-β2的mRNA水平而發(fā)揮作用。

[1]McBrienNA,ArumugamB,GentleA,etal.TheM4muscarinicantagonistMT-3inhibitsmyopiainchick:evidenceforsiteofaction[J].OphthalPhysiolOpt, 2011, 31(5): 529-539.

[2]NicklaDL,YusupovaY,TotonellyK.ThemuscarinicantagonistMT3distinguishesbetweenformdeprivation-andnegativelens-inducedmyopiainchicks[J].CurrEyeRes, 2015,40(9): 962-967.

[3]ArumugamB,McbrienNA.Muscarinicantagonistcontrolofmyopia:evidenceforM4andM1receptor-basedpathwaysintheinhibitionofexperimentally-inducedaxialmyopiainthetreeshrew[J].InvestOphthalmolVisSci, 2012, 53(9): 5827-5837.

[4]McBrienNA.Regulationofscleralmetabolisminmyopiaandtheroleoftransforminggrowthfactor-beta[J].ExpEyeRes, 2013, 114: 128-140.

[5]李濤, 周曉東, 崔心瀚, 等. 豚鼠眼形覺剝奪后恢復(fù)期的生物學(xué)參數(shù)變化規(guī)律探討 [J]. 中國實驗動物學(xué)報, 2012, 20(06): 51-56.

[6]DietherS,SchaeffelF,LambrouGN,etal.Effectsofintravitreallyandintraperitoneallyinjectedatropineontwotypesofexperimentalmyopiainchicken[J].ExpEyeRes, 2007, 84(2): 266-274.

[7]楊穎, 李濤, 陳志, 等. 球結(jié)膜下注射不同濃度消旋山莨菪堿液對雛雞形覺剝奪近視眼軸的影響 [J]. 中國實驗動物學(xué)報, 2011, 19(4): 297-300.

[8]LiT,ZhouXD,ChenZ,etal.Effectsofcyclopentolateonformdeprivationmyopiainguineapigs[J].OpenJOphthalmol, 2015, 5:10-18.

[9]CottriallCL,McbrienNA,AnniesR,etal.Preventionofform-deprivationmyopiawithpirenzepine:astudyofdrugdeliveryanddistribution[J].OphthalPhysiolOpt, 1999, 19(4): 327-335.

[10]LiangJS,Carsi-GabrenasJ,KrajewskiJL,etal.Anti-muscarinictoxinsfromDendroaspisangusticeps[J].Toxicon, 1996, 34(11-12): 1257-1267.

[11]HondaS,FujiiS,SekiyaY,etal.Retinalcontrolontheaxiallengthmediatedbytransforminggrowthfactor-betainchickeye[J].InvestOphthalmolVisSci, 1996, 37(12): 2519-2526.

[12]周凌霄, 王理論, 張林. 形覺剝奪性近視豚鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察及TGF-β2表達(dá) [J]. 國際眼科雜志, 2014, 14(11): 1950-1952.

[13]SekoY,ShimokawaH,TokoroT.ExpressionofbFGFandTGF-beta2inexperimentalmyopiainchicks[J].InvestOphthalmolVisSci, 1995, 36(6): 1183-1187.

[14]KusakariT,SatoT,TokoroT.Visualdeprivationstimulatestheexchangeofthefibrousscleraintothecartilaginoussclerainchicks[J].ExpEyeRes, 2001, 73(4): 533-546.

[15]JoblingAI,WanR,GentleA,etal.RetinalandchoroidalTGF-betainthetreeshrewmodelofmyopia:isoformexpression,activationandeffectsonfunction[J].ExpEyeRes, 2009, 88(3): 458-466.

[16]JoblingAI,NguyenM,GentleA,etal.Isoform-specificchangesinscleraltransforminggrowthfactor-betaexpressionandtheregulationofcollagensynthesisduringmyopiaprogression[J].JBiolChem, 2004, 279(18): 18121-18126.

[17]閆磐石, 張金嵩, 郭浩軼. 轉(zhuǎn)化生長因子-β2在豚鼠形覺剝奪性近視中的表達(dá) [J]. 眼科研究, 2007, 25(3): 168-170.

Preliminary study of the inhibitory effect of selective M4 muscarinicreceptorantagonistMT3onformdeprivationmyopiainguineapigs

LITao1,ZHOUXiao-dong1*,LIBing1,LUOXiu-mei1,GONGZhe-ping2

(1.JinshanHospitalofFudanUniversity; 2.ShanghaiCityMengshanMiddleSchool,Shanghai201508,China)

ObjectiveToevaluatetheinhibitoryeffectofhighlyselectiveM4receptorantagonistMT3ontheformdeprivationmyopiainguineapigsanditspotentialmechanism.MethodsThirty-twohealthymaleguineapigswererandomlydividedintothreegroups:controlgroup,formdeprivationgroup,andformdeprivation+MT3group, 8animalsineachgroup.Refractionwasmeasuredbyretinoscopyaftercycloplegiabeforeandaftertheexperiment.TheocularbiologicaldimensionsweremeasuredbyA-scanultrasound.RT-PCRwasusedtodetecttherelativeexpressionofTGF-β2mRNAintheretinaandchoroid.ResultsComparedwiththerighteyesofcontrolgroup,therighteyesofformdeprivation+MT3groupdevelopedrelativemyopiaof-1.44±0.50D(right-lefteye) (P =0.001).Thevitreouschamberdepthandaxiallengthoftherighteyesweresignificantlyprolongedby0.10±0.02mmand0.14±0.07mm(P<0.001, P<0.001),respectively,buttheincreasesofmyopiaandaxiallengthweresignificantlysmallerthanthatoftheformdeprivationgroup(P<0.001, P<0.001, P<0.001).Down-regulationofrelativemRNAexpressionofTGF-β2inretinaandchoroidwasfoundintheformdeprivationgroup(P<0.001, P =0.014)comparedwiththerighteyesofthecontrolgroup,whileup-regulationofrelativemRNAexpressionofTGF-β2inretinaandchoroidwasfoundintheformdeprivation+MT3group(P<0.001, P<0.001).ConclusionsMT3caninhibitthedevelopmentofformdeprivationmyopiainguineapigs,whichmayplayanimportantrolebytheregulationofTGF-β2mRNAlevelintheretinaandchoroid.

M4receptorantagonist;MT3;Formdeprivationmyopia;TGF-β2;Guneapigs

ZHOUXiao-dong.E-mail:xdzhou2005@163.com

上海市科委自然基金(13ZR1405800)；上海市衛(wèi)生局青年基金(2013-121)。

李濤(1983-)，男，碩士，研究方向：眼視光學(xué)。Email：litao13013@sina.com

周曉東(1963-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。Email：xdzhou2005@163.com

研究報告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0403-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.013

2015-12-09