包新杰，李雪元，左賦興，馮銘，竇萬臣，王任直

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科，北京　100730)

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穩(wěn)定的大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞腦梗死模型的建立

包新杰，李雪元，左賦興，馮銘，竇萬臣*，王任直

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科，北京100730)

目的探討使用激光多普勒血流監(jiān)測(cè)技術(shù)制作穩(wěn)定的大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞腦梗死模型(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)的可行性。方法16只SD雄性大鼠隨機(jī)分成2組：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各8只。實(shí)驗(yàn)組將模型制作過程中腦血流下降至基礎(chǔ)值的30%判定為模型制作成功；對(duì)照組不監(jiān)測(cè)腦血流，將尼龍栓線插入深度為1.8cm判定為模型制作成功。模型前和模型后24h分別行神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分(modifiedneurologicalseverityscores,mNSS)；模型后24h處死大鼠取腦，行2,3,5-三苯氯化四氮唑(TTC)染色并計(jì)算腦梗死體積。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組8只大鼠模型后24h均出現(xiàn)典型偏癱癥狀，mNSS評(píng)分穩(wěn)定在10分～13分，梗死體積穩(wěn)定性和均一性好，為(37.5±3.9)%。對(duì)照組8只大鼠mNSS評(píng)分穩(wěn)定性較差，其中5只大鼠的mNSS評(píng)分為10分～13分，5只大鼠的腦梗死灶和實(shí)驗(yàn)組相似，但有3只大鼠的腦梗死體積明顯小于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組的模型成功率為100%，對(duì)照組的模型成功率為62.5%(P<0.05)。結(jié)論激光多普勒血流監(jiān)測(cè)技術(shù)可以顯著提高大鼠MCAO模型的成功率、穩(wěn)定性和均一性。

腦梗死；模型；激光多普勒；中動(dòng)脈，栓塞；大鼠

腦梗死是嚴(yán)重危害人類生命和健康的重大疾病之一，目前除發(fā)病3～4.5h內(nèi)及時(shí)溶栓外，尚無更為有效的治療方法[1]。人類急需在腦梗死的研究中有所突破，所以是否具有一種穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物模型顯得尤為重要。自1989年Longa等[2]使用線栓法制備大鼠腦梗死模型(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)以來，該模型在腦梗死的研究中得到廣泛運(yùn)用。MCAO模型制作的關(guān)鍵是插入栓線的頭端能否到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始處，但是插線過程屬于盲插，栓線頭端到達(dá)的具體部位并不能用肉眼所見，只能憑借操作者的經(jīng)驗(yàn)，利用插線深度和手感間接判斷栓線位置是否合適[3-5]。但是，這種經(jīng)驗(yàn)性的判斷往往導(dǎo)致模型不穩(wěn)定、均一性差，本實(shí)驗(yàn)就能否使用激光多普勒血流監(jiān)測(cè)技術(shù)提高大鼠MCAO模型的穩(wěn)定性進(jìn)行探討。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)用品

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠16只，體重250～270g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物

水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，生理鹽水配成10%水合氯醛溶液；2,3,5-三苯氯化四氮唑(TTC，北京化學(xué)試劑廠)，生理鹽水配成2%TTC溶液。

1.1.3實(shí)驗(yàn)器材

激光多普勒血流儀(MP150)和多普勒血流模塊(LDF100)(BiopacSystems，美國(guó))；手術(shù)顯微鏡；顯微手術(shù)器械；自制大鼠固定板；尼龍栓線(型號(hào)：2432，北京沙東生物技術(shù)有限公司)；孵育箱(SeriesII,ThermoForma)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制作方法

16只SD雄性大鼠隨機(jī)分成2組：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各8只。尼龍栓線上在距離頭端1.8cm處做標(biāo)記，碘伏消毒備用。

模型制作在北京協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心手術(shù)操作間【SYXK(京)2015-0025】進(jìn)行。線栓法制作大鼠MCAO模型參照我們實(shí)驗(yàn)室的方法[3-6]。手術(shù)前動(dòng)物禁飲食4h并稱重，按外科無菌手術(shù)操作。實(shí)驗(yàn)組大鼠10%水合氯醛0.35mL/100g腹腔注射麻醉后，俯臥位固定。頭部矢狀位皮膚正中切口約1.5cm，剝離骨膜，選擇右側(cè)前囟后1mm，右側(cè)旁開2mm，硬腦膜下1mm為大鼠腦表面大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域腦血流監(jiān)測(cè)位點(diǎn)。直徑1mm磨鉆頭顱骨鉆孔，保持硬腦膜的完整性。將激光多普勒血流測(cè)量?jī)x的專用探頭插入測(cè)量點(diǎn)硬腦膜下1mm，固定。專用軟件記錄并分析腦血流，激光反射率始終控制在50%左右。再將大鼠放至仰臥位并固定，手術(shù)顯微鏡下實(shí)施大鼠MCAO手術(shù)，剪掉頸部毛發(fā)，碘伏消毒皮膚；頸部正中切口1.5cm；剪開闊筋膜后顯露右側(cè)胸鎖乳突肌，在胸鎖乳突肌和頸前肌之間向深部分離后顯露頸動(dòng)脈鞘，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈；用6-0絲線分別結(jié)扎頸外動(dòng)脈根部和頸總動(dòng)脈離分叉8mm處，壓閉阻斷頸內(nèi)動(dòng)脈血流后于頸總動(dòng)脈離分叉約5mm處剪一小口，置入尼龍栓線，左手拿顯微鑷子夾住頸總動(dòng)脈，右手用鑷子輔助栓線沿頸內(nèi)動(dòng)脈方向插入，插入深度為1.8cm左右時(shí)，有輕微阻力，腦血流下降至基礎(chǔ)值的30%提示模型制作成功[6]；雙結(jié)扎緊頸總動(dòng)脈，剪斷血管外部栓線，清理術(shù)野，縫合頸部切口，另外骨蠟封閉骨孔，全層縫合頭皮。對(duì)照組大鼠模型制作過程中不監(jiān)測(cè)腦血流，尼龍栓線插入深度為1.8cm時(shí)表示模型制作成功[5]，其余同實(shí)驗(yàn)組。將大鼠放回鼠籠，自由飲食。

1.3行為學(xué)評(píng)分

模型前和模型后24h分別進(jìn)行改良神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分(modifiedneurologicalseverityscores,mNSS)[3]。分為運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡和反射四部分，總分為18分，正常大鼠得分為0分，得分越高則癥狀越重。

1.4TTC染色

MCAO后24h，10%水合氯醛深度麻醉大鼠后開顱取腦，切掉額極和枕極后冠狀位切成2mm厚度的腦塊共6塊，放入2%TTC溶液中避光37 ℃孵育30min。10倍顯微鏡下拍照，在ImageProPlus軟件中分析并計(jì)算梗死體積。間接梗死面積=正常側(cè)腦組織面積-梗死側(cè)正常腦組織面積。相對(duì)梗死體積=累積間接梗死面積/累積正常側(cè)腦組織面積 × 100%[3]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1行為學(xué)比較

模型制作前兩組大鼠mNSS評(píng)分均為0分。實(shí)驗(yàn)組8只大鼠模型后24h均出現(xiàn)典型偏癱癥狀，表現(xiàn)為：站立不穩(wěn)，向左側(cè)跌倒或轉(zhuǎn)圈，提起鼠尾可見左前肢屈曲，頭向患側(cè)抬起，mNSS評(píng)分穩(wěn)定在10分～13分(圖1)。對(duì)照組8只大鼠mNSS評(píng)分穩(wěn)定性較差，其中5只大鼠偏癱癥狀明顯，mNSS評(píng)分為10分～13分，但有3只大鼠無明顯偏癱癥狀，mNSS評(píng)分偏低，分別為8分、6分和3分(圖1)。

圖1　兩組大鼠模型后24 h的mNSS評(píng)分Fig.1　mNSS of each rat in the two groups 24 h after MCAO

2.2大鼠腦梗死體積和模型成功率比較

TTC染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組8只大鼠均顯示出明顯梗死灶，梗死體積穩(wěn)定性和均一性好(圖2)，為(37.5±3.9)%。大鼠取腦時(shí)見右側(cè)大腦腫脹明顯，并可見外側(cè)額、顳、頂部大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域腦組織顏色蒼白，TTC染色見大腦皮層和基底核外側(cè)白色梗死灶。對(duì)照組8只大鼠的腦梗死灶穩(wěn)定性較差，其中5只大鼠的腦梗死灶和實(shí)驗(yàn)組相似，但有3只大鼠的腦梗死體積明顯小于實(shí)驗(yàn)組，分別為26%、15.6%和22.2%(P<0.05)(圖2)。

結(jié)合mNSS評(píng)分及TTC染色結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組的模型成功率為100%，對(duì)照組的模型成功率為62.5%，兩組之間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖2　兩組大鼠模型后24 h腦梗死體積Fig.2　The infarct volume of each rat in the two groups at 24 h after MCAO

3　討論

大鼠MCAO模型是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究腦梗死的常用模型之一，其最大的優(yōu)點(diǎn)是制作方便，操作熟練者制作一只模型的平均時(shí)間是20min。栓線頭端放置是否準(zhǔn)確是MCAO模型成功與否的重要因素，操作者可以通過感覺栓線頭端到達(dá)ICA分叉處時(shí)遇到輕微阻力來判斷栓線放置是否成功。但是這個(gè)模型存在一個(gè)顯著的缺點(diǎn)，就是栓線頭端的放置是一個(gè)盲插過程，完全依賴于操作者的經(jīng)驗(yàn)和熟練程度。初學(xué)者遇到的主要問題有兩個(gè)：首先，栓線放置深度不夠。栓線頭端進(jìn)入翼腭動(dòng)脈(pterygopalatineartery,PA)，這種情況對(duì)新手最為常見，此時(shí)栓線進(jìn)入深度約為0.8cm，遇到阻力；另外，若栓線頭端通過PA，栓線可以輕松到達(dá)ICA入顱處，插入深度約1.3cm，此處ICA有轉(zhuǎn)折，栓線偶爾會(huì)遇到阻力。以上情況均可能被誤判為栓線放置成功；其次，栓線放置過深。因ICA顱內(nèi)段走形較直，栓線多無阻力，當(dāng)栓線頭端到達(dá)顱內(nèi)頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處時(shí)，會(huì)遇到輕微阻力，但對(duì)于新手來說，這種輕微阻力不出現(xiàn)或者很難把控，倘若栓線繼續(xù)向前則進(jìn)入大腦中動(dòng)脈(middlecerebralartery,MCA)或者大腦前動(dòng)脈(anteriorcerebralartery,ACA)，因?yàn)镸CA是顱內(nèi)ICA的直接延伸，故以進(jìn)入MCA多見，導(dǎo)致栓線放置過深，插入深度約為2.2cm。栓線深度不夠，對(duì)側(cè)血流通過大腦底部Willis環(huán)會(huì)對(duì)右側(cè)大腦進(jìn)行供血，大鼠無偏癱癥狀和腦梗死出現(xiàn)，模型失??；栓線放置過深，進(jìn)入MCA，大鼠雖出現(xiàn)典型偏癱癥狀，但其模型后48h的存活率很低，大部分大鼠會(huì)在模型后48h內(nèi)死亡，腦梗死范圍過大和急性期腦水腫過于強(qiáng)烈是栓線插入過深后大鼠死亡的主要原因[5]。

可見，制作大鼠MCAO模型的經(jīng)驗(yàn)性判斷往往導(dǎo)致模型不穩(wěn)定、均一性差，有的模型無癥狀，mNSS評(píng)分很低；有的模型癥狀很重，mNSS評(píng)分過高，短時(shí)間內(nèi)死亡率高；研究者需要挑選mNSS評(píng)分適中的納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。這雖然在一定程度上提高了模型的均一性，但仍然不夠精準(zhǔn)，另外會(huì)廢棄相當(dāng)一部分大鼠，導(dǎo)致浪費(fèi)。所以，如何使模型癥狀明顯但又不至于過多死亡是制作MCAO模型的瓶頸所在。

為解決這一問題，我們嘗試使用激光多普勒血流監(jiān)測(cè)技術(shù)提高大鼠MCAO模型的穩(wěn)定性和均一性。我們把腦血流下降至基礎(chǔ)值的30%認(rèn)定為模型制作成功[6]，插入深度為1.8cm左右。當(dāng)栓線放置深度不夠時(shí)，腦血流不下降或者輕度下降，提示操作者即使遇到阻力也不能誤認(rèn)為模型制作已結(jié)束，必須通過手法調(diào)整栓線方向，將栓線頭端繼續(xù)向深處放置；當(dāng)栓線頭端放置過深進(jìn)入MCA時(shí)，腦血流往往急促下降至基礎(chǔ)值的30%以下，提示操作者即使未遇到阻力也應(yīng)停止繼續(xù)向深處放置，而應(yīng)該適當(dāng)退出栓線。本實(shí)驗(yàn)的兩組大鼠均由同一位操作熟練者完成，結(jié)果提示即使操作者經(jīng)驗(yàn)豐富，完全由經(jīng)驗(yàn)判斷的對(duì)照組的模型成功率為62.5%，這和我們既往的工作相符。當(dāng)我們使用激光多普勒血流監(jiān)測(cè)技術(shù)后，可以將實(shí)驗(yàn)組的模型成功率提高至100%，顯著提高大鼠MCAO模型的穩(wěn)定性和均一性，并且使得實(shí)驗(yàn)大鼠得到了充分利用。

由此可見，我們推薦激光多普勒血流監(jiān)測(cè)技術(shù)用于大鼠MCAO模型的制作。但是，目前可能阻礙其推廣的原因有兩個(gè)：首先，激光多普勒血流監(jiān)測(cè)設(shè)備和微小探頭相對(duì)昂貴；其次，模型制作過程相對(duì)繁瑣，模型制作時(shí)間明顯延長(zhǎng)。我們?cè)谑炀毲闆r下制作大鼠MCAO模型的平均時(shí)間為20min，使用激光多普勒血流監(jiān)測(cè)技術(shù)后，平均時(shí)間延長(zhǎng)至70min，時(shí)間主要消耗在激光多普勒探頭的放置和血流監(jiān)測(cè)的調(diào)試上面。但是，對(duì)于我們追求精益求精的大鼠MCAO模型及珍惜實(shí)驗(yàn)大鼠而言，設(shè)備的配置和單只模型制作時(shí)間的相對(duì)延長(zhǎng)是完全值得的。

[1]HackeW,KasteM,BluhmkiE,etal.Thrombolysiswithalteplase3to4.5hoursafteracuteischemicstroke[J].NEnglJMed, 2008, 359(13): 1317-1329.

[2]LongaEZ,WeinsteinPR,CarlsonS,etal.Reversiblemiddlecerebral-arteryocclusionwithoutcraniectomyinrats[J].Stroke, 1989, 20(1): 84-91.

[3]BaoXJ,WeiJJ,FengM,etal.Transplantationofhumanbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellspromotesbehavioralrecoveryandendogenousneurogenesisaftercerebralischemiainrats[J].BrainRes, 2011, 1367: 103-113.

[4]趙浩, 李永寧, 王任直, 等. 大鼠局灶性腦缺血模型的有效制備[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2009, 17(6): 432-436．

[5]包新杰, 王任直, 趙浩, 等．線栓法插線深度對(duì)大鼠腦梗死模型制備的影響[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2011, 19(3): 68-71.

[6]BaoXJ,FengM,WeiJJ,etal.TransplantationofFlk-1+humanbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellspromotesangiogenesisandneurogenesisaftercerebralischemiainrats[J].EurJNeurosci. 2011, 34(1): 87-98.

Establishment of a stable rat model of middle cerebral artery occlusion

BAOXin-jie,LIXue-yuan,ZUOFu-xin,FENGMing,DOUWan-chen*,WANGRen-zhi

(DepartmentofNeurosurgery,PekingUnionMedicalCollegeHospital,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100730,China)

ObjectiveToestablishastableratmodelofmiddlecerebralarteryocclusion(MCAO)assistedbylaserDopplerflowmetry.MethodsSixteenratswererandomlydividedintotwogroups: (1)experimentalgroup,n=8; (2)controlgroup,n=8.Intheexperimentalgroup,asuddendecreaseofregionalcerebralbloodflowfrombaseline(beforeischemia)toapproximately30%ofbaselineconfirmedthecorrectplacementofnylonthread.Inthecontrolgroup, 1.8cmnylonthreadinsertionwasperformedwithoutlaserDopplerflowmetry.Themodifiedneurologicalseverityscores(mNSS)weretestedbeforeand24hafterMCAO.Allratswerekilledat24hafterMCAO.Thebrainswereremovedanddissectedinto6piecesof2mmcoronalsections.Thefreshbrainsliceswerestainedwith2% 2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorideandtherelativeinfarctvolumewasmeasured.ResultsIntheexperimentalgroup, 8ratsshowedtypicalsymptomofhemiplegywithstablemNSS(between10and13)andinfarctvolume(37.5±3.9%).However,only5ratsinthecontrolgroupshowedstablemNSSandinfarctvolume.Thesuccessrateofthemodelestablishmentwas100%intheexperimentalgroupcomparedwith62.5%inthecontrolgroup(P<0.05).ConclusionTheapplicationoflaserDopplerflowmetrysignificantlyincreasestheestablishmentsuccessrateofstableMCAOmodelsinrats.

Cerebralischemia;Model;LaserDopplerflowmetry;Middlecerebralartery,occlusion;Rat

DOUWan-chen.E-mail:liubaiyan@126.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(81200916)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2014AA020513；2013AA020106)。

包新杰(1982-)，男，主治醫(yī)師，研究方向：腦血管病的干細(xì)胞治療。

竇萬臣，E-mail:wangrz@126.com

研究報(bào)告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0395-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.011

2016-01-18