張衡璐,黃惠敏,葉芝旭,王志華,何志旭,2,,*,舒莉萍2,,4*

(貴州醫(yī)科大學 1.附屬醫(yī)院兒科學教研室； 2.組織工程與干細胞實驗中心；3.免疫學教研室； 4.動物實驗中心，貴陽　550004)

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斑馬魚核纖層蛋白Lamins的生物信息學分析

張衡璐1,黃惠敏1,葉芝旭1,王志華3,何志旭1,2,3,*,舒莉萍2,3,4*

(貴州醫(yī)科大學 1.附屬醫(yī)院兒科學教研室； 2.組織工程與干細胞實驗中心；3.免疫學教研室； 4.動物實驗中心，貴陽550004)

目的了解斑馬魚核纖層蛋白(lamins)的重要遺傳信息。方法在UCSC、Vega及Ensemble數(shù)據(jù)庫上收集了不同物種核纖層蛋白家族相關(guān)蛋白質(zhì)序列，利用ClustalX工具進行分析，并用MEGA 4.0 軟件繪制進化樹；通過NCBI網(wǎng)站上BLAST工具將斑馬魚核纖層蛋白的蛋白質(zhì)序列與不同物種的相對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列進行對比，最后將人類、小鼠及斑馬魚的lamins基因信息，進行共線性分析。結(jié)果對核纖層蛋白相關(guān)基因進行生物信息學分析后顯示斑馬魚的核纖層蛋白與人類的相似程度高，推斷l(xiāng)mna、lmnb1和lmnb2基因在進化過程中高度保守。結(jié)論編碼斑馬魚lamins的基因lmna、lmnb1和lmnb2等可能是人類LMNA、LMNB1和LMNB2等基因的直向同源物。

斑馬魚；核纖層蛋白；lmna基因；進化樹；共線性分析

近年來, 大量研究表明編碼核纖層蛋白的基因尤其是lmna基因突變會引起一系列的疾病, 即核纖層病(laminopathy)。目前已證實有180多種的lmna基因的不同突變引起的疾病[1]，lmna基因突變可導致橫紋肌疾病、脂肪代謝障礙綜合征、周圍神經(jīng)病變、早衰綜合征等[2]。新的動物模型的建立和新技術(shù)的應(yīng)用將會加深對核纖層蛋白病的認識，進而為治療提供新的思路和途徑。

核纖層(nuclear lamina)是位于細胞核內(nèi)染色質(zhì)與核膜之間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由核纖層蛋白和核纖層結(jié)合膜蛋白組成。核纖層蛋白(lamins)屬于V型中間纖維蛋白家族(intermediate filament, IF)成員，它是細胞骨架的重要組成部分, 也是唯一一類存在于細胞核的IF蛋白質(zhì)[3]，可維持核膜正常形態(tài)，并提供染色體錨著位[4]，同時在核染色體周期性的解體和重組裝過程中也發(fā)揮重要作用[5]。此外，核纖層蛋白還廣泛分布于核質(zhì)，影響DNA復制、DNA損傷修復和轉(zhuǎn)錄[6]。

核纖層蛋白可按其一級結(jié)構(gòu)、生化特征和在細胞周期中細胞定位的不同分為A型核纖層蛋白和B型核纖層蛋白[4]。真核細胞可表達出兩種類型的核纖層蛋白[7]。細胞分裂過程中核纖層蛋白會被修飾，發(fā)生構(gòu)象上的轉(zhuǎn)變，使核纖層發(fā)生解聚或重組[8]。

斑馬魚是研究發(fā)育的理想模式生物，具有獨特的優(yōu)勢，其在對基因功能和疾病發(fā)病機制的研究中具有廣泛誘人的應(yīng)用前景。本文通過對斑馬魚核纖層蛋白lamins的生物信息學分析，以期了解斑馬魚中l(wèi)amins基因和人類相關(guān)基因的進化關(guān)系，為進一步利用斑馬魚研究lmna基因及核纖層蛋白病提供重要的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1進化樹分析

在NCBI、Ensemble數(shù)據(jù)庫中收集人、黑猩猩、小鼠、斑馬魚、非洲爪蟾、黑腹果蠅、秀麗隱桿線蟲7個不同物種核纖層蛋白家族相關(guān)蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)序列利用ClustalX 1.83程序進行多序列比對，并在此基礎(chǔ)上，利用MEGA 6.0 軟件進行進化樹繪制。

1.2蛋白質(zhì)序列比對分析

通過NCBI網(wǎng)站中的BLAST工具分別將斑馬魚與人類、小鼠、黑猩猩、非洲爪蟾的lamin A、lamin B1和lamin B2等蛋白質(zhì)兩兩比較，進行斑馬魚核纖層蛋白家族的相關(guān)蛋白質(zhì)與其他物種之間的相似性分析。

1.3共線性分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫找出lmna、lmnb1及l(fā)mnb2基因在物種人與小鼠分別處于的染色體，并分別找出同時出現(xiàn)在其染色體上相關(guān)的8種基因，利用NCBI網(wǎng)站中的MapViewer功能找出這些基因在斑馬魚的具體位置，匯總、對比lmna、lmnb1及l(fā)mnb2基因在人、小鼠、斑馬魚上的表達，最后在UCSC、Vega及Ensemble數(shù)據(jù)庫上比對基因信息，進行繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.1進化樹結(jié)果分析

斑馬魚核纖層蛋白主要有l(wèi)amin A、lamin B1、lamin B2及l(fā)amin L3等,為了進一步了解核纖層蛋白家族中的分類，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索所有存在于人類、小鼠、黑猩猩、非洲爪蟾、斑馬魚、黑腹果蠅、秀麗隱桿線蟲的核纖層蛋白編碼的蛋白質(zhì)序列。利用ClustalX 1.83程序進行蛋白質(zhì)多序列比對，并在此基礎(chǔ)上，利用MEGA 6.0 軟件進行進化樹繪制(圖1)，以確定lamins家族的直系同源關(guān)系。斑馬魚核纖層蛋白被編碼的基因均位于不同的染色體：斑馬魚lmna位于16號染色體，斑馬魚lmnb有兩種類型，lmnb1位于10號染色體，lmnb2位于5號染色體，進化樹提示它們與相對應(yīng)的人類基因存在直向同源關(guān)系，即擁有共同的祖先基因。斑馬魚lmnl3定位在23號染色體上，與非洲爪蟾的lamin LIII存在直向同源關(guān)系。

2.2蛋白質(zhì)序列相似性檢測

進化樹分析提示核纖層蛋白在進化的過程中是相對保守的，并且斑馬魚與人類、小鼠、黑猩猩、非洲爪蟾之物種間的相應(yīng)序列同源性都很高，但果蠅和線蟲核纖層蛋白與人類相關(guān)蛋白質(zhì)的同源性則相差較遠，這一現(xiàn)象與物種衍變過程相一致，一般來說，物種之間的同源性越高，序列之間的相似性越高，為了檢測核纖層蛋白的相似性，通過NCBI網(wǎng)站中的BLAST工具分別將斑馬魚與人類、小鼠、黑猩猩、非洲爪蟾的lamin A、lamin B1和lamin B2等蛋白質(zhì)兩兩比較，進行斑馬魚核纖層蛋白家族的相關(guān)蛋白質(zhì)與其他物種之間的相似性分析。

斑馬魚lamin A蛋白質(zhì)與小鼠的相似性最高，達到67%，與人類的相似性為62%；斑馬魚lamin B1與黑猩猩的相似性最高，達到72%，與人類的相似性為70%；斑馬魚lamin B2與非洲爪蟾和人類的相似性一樣，均為68%(表1)。

圖1　Lamins家族的進化樹分析Note.A:Lamin A, lamin C, lamin B1, lamin B2.B:Laminin alpha 1, laminin alpha 2, laminin alpha 3, laminin alpha 4, laminin alpha 5.C:Laminin beta 1a, laminin beta 1b, laminin beta 4. D:Laminin gamma 1, laminin gamma 2, laminin gamma 3Fig.1　Phylogeny reconstruction of the lamin family

蛋白質(zhì)種類Typesofprotein物種Species相似度Identities/%LaminA人類Homosapiens62.00黑猩猩Pantroglodytes62.00小鼠Musmusculus67.00非洲爪蟾Xenopuslaevis62.00LaminB1人類Homosapiens70.00黑猩猩Pantroglodytes72.00小鼠Musmusculus69.00非洲爪蟾Xenopuslaevis66.00LaminB2人類Homosapiens68.00黑猩猩Pantroglodytes66.00小鼠Musmusculus64.00非洲爪蟾Xenopuslaevis68.00Lamininalpha1人類Homosapiens50.26黑猩猩Pantroglodytes51.93小鼠Musmusculus50.03非洲爪蟾Xenopuslaevis51.37Lamininalpha2人類Homosapiens56.64黑猩猩Pantroglodytes56.88小鼠Musmusculus57.15非洲爪蟾Xenopuslaevis55.14Lamininalpha3人類Homosapiens28.46黑猩猩Pantroglodytes28.34小鼠Musmusculus27.95非洲爪蟾Xenopuslaevis28.80Lamininalpha4人類Homosapiens45.94黑猩猩Pantroglodytes45.58小鼠Musmusculus45.34非洲爪蟾Xenopuslaevis46.86Lamininalpha5人類Homosapiens47.19黑猩猩Pantroglodytes48.11小鼠Musmusculus46.81非洲爪蟾Xenopuslaevis51.23Lamininbeta1a人類Homosapiens66.91黑猩猩Pantroglodytes66.74小鼠Musmusculus67.19非洲爪蟾Xenopuslaevis64.00Lamininbeta1b人類Homosapiens55.18黑猩猩Pantroglodytes55.07小鼠Musmusculus54.78非洲爪蟾Xenopuslaevis51.27Lamininbeta4人類Homosapiens41.53黑猩猩Pantroglodytes41.40小鼠MusmusculusNone非洲爪蟾Xenopuslaevis41.07Laminingamma1人類Homosapiens68.93黑猩猩Pantroglodytes68.99小鼠Musmusculus69.11非洲爪蟾Xenopuslaevis67.84Laminingamma2人類Homosapiens32.95黑猩猩Pantroglodytes33.98小鼠Musmusculus32.62非洲爪蟾Xenopuslaevis28.78Laminingamma3人類Homosapiens38.73黑猩猩Pantroglodytes61.17小鼠Musmusculus39.77非洲爪蟾XenopuslaevisNone

2.3共線性分析

為進一步明確編碼斑馬魚核纖層蛋白的基因與人類基因的進化關(guān)系，本文分析了進化過程中相對保守的lmna、lmnb1及l(fā)mnb2基因，研究它們在斑馬魚染色體上的基因定位關(guān)系。斑馬魚的lmna、lmnb1及l(fā)mnb2基因分別定位于斑馬魚基因組的第16、10號和22號染色體上。如圖2A所示，在斑馬魚lmna基因附近的scnm1、lysmd1、cct3、pear1、prune、bnip1、cdc32se1和thbs3a基因分別在小鼠3號染色體、人類的1號染色體上，相距非常接近，稍有不同的是基因之間的位置，這可能是由于進化過程中出現(xiàn)過染色體內(nèi)部片段的倒轉(zhuǎn)，這種現(xiàn)象在進化過程中經(jīng)常出現(xiàn)。同樣，在lmnb1、lmnb2基因附近也有類似的現(xiàn)象，這些基因由于其他因素(染色體重組或基因插入等)排列在一起的幾率非常小，它們在基因組中的定位呈現(xiàn)高度保守的同線性，提示斑馬魚的lmna、lmnb1和lmnb2基因是人類直線同源基因。在進化史上，魚類和哺乳動物從共同的祖先分開進化后，硬骨魚發(fā)生了一次全基因組范圍內(nèi)的染色體復制現(xiàn)象(whole-genome duplication, WGD)[9]，相一致的是斑馬魚的lmna、lmnb1和lmnb2基因也發(fā)生了復制現(xiàn)象。綜合上述的分析結(jié)果，可以確定斑馬魚的lmna、lmnb1及l(fā)mnb2基因確實是人類lmna、lmnb1及l(fā)mnb2基因的直向同源物。如圖2B所示，在斑馬魚lmnb1基因附近lox、dcp、aldh7a1、phax、megf10、prrc1、slc12a2和slc37a6基因在小鼠第18號染色體，人的第5號染色體上，lmnb1基因的附近也發(fā)現(xiàn)了這8個基因。如圖2C所示，在斑馬魚lmnb2基因附近s1pr4、lsm7、tmprss9、timm13、oaz1、tle2、aes和gan11a基因在小鼠第10號染色體，人的第19號染色體上lmnb2基因的附近也發(fā)現(xiàn)了這8個基因。

3　討論

核纖層普遍存在于高等動物真核細胞的細胞核中，核纖層蛋白除了參與細胞核的形狀和大小的維持，還參與DNA的復制、有絲分裂中染色體的重組、細胞信號傳導和細胞凋亡等過程[10, 1]。模式生物作為基因功能研究的一種有用的工具，大多數(shù)的生長發(fā)育過程在長期的進化過程中具有高度的保守性，是研究人類發(fā)育、系統(tǒng)功能、疾病發(fā)生發(fā)展等的重要工具。因此采用模式生物研究lamins的功能，有助于進一步了解人類同源基因。斑馬魚具有胚胎透明、體外發(fā)育、體積小、繁殖率高及魚種發(fā)育遺傳背景清晰等優(yōu)點使其成為研究脊椎動物，特別是研究人類發(fā)育和疾病的模式物種之一。故本文選擇了斑馬魚作為研究的模式生物。

核纖層蛋白出現(xiàn)在大部分后生生物中，但在酵母、其他單細胞生物中不存在[11]，脊椎動物間的核纖層蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)，但也有各自的特點。在哺乳動物中，核纖層蛋白主要由3個基因編碼的7種蛋白質(zhì)組成。A型核纖層lmna編碼4種蛋白質(zhì)：lamin A、lamin△10、lamin C和lamin C2。其中l(wèi)aminA、lamin C是主要的剪切轉(zhuǎn)錄本[12]。B型核纖層蛋白由LMNB1及LMNB2兩種基因編碼，通常情況下，無脊椎動物只有一個單一的B型核纖層蛋白，但有一些例外，諸如黑腹果蠅有兩種類型，被稱lamin DM0(B型核纖層蛋白)和Lam C(A型核纖層蛋白)[13]。線蟲有一個單一的B型核纖層蛋白(LMN-1)。非洲爪蟾有三個B型核纖層蛋白，lamins的同源基因不存在于釀酒酵母、擬南芥中[14]。本文通過數(shù)據(jù)庫查閱到斑馬魚中有4種主要編碼核纖層蛋白的基因：lmna、lmnb1、lmnb2及l(fā)mnL3，為了證實斑馬魚的這四種基因編碼的核纖層蛋白與哺乳動物的核纖層蛋白家族之間的關(guān)系，即是否具有同源性及相似性，對斑馬魚核纖層蛋白進行進化分析，主要通過鄰接法推斷斑馬魚核纖層蛋白的進化史以了解其相關(guān)的生物信息，為進一步研究斑馬魚核纖層蛋白編碼基因的功能奠定基礎(chǔ)。

進化樹分析的結(jié)果提示，斑馬魚lamin L3與非洲爪蟾的lamin LⅢ有一定的相關(guān)性，非洲爪蟾的lamin LⅢ屬于B型核纖層蛋白，故推測斑馬魚核纖層蛋白L3也屬于B型核纖層蛋白。斑馬魚的laminA與人類的有一定相關(guān)性，屬于A型核纖層蛋白，而lamin B1和lamin B2屬于B型核纖層蛋白，即斑馬魚lamins也是由A型核纖層蛋白和B型核纖層蛋白構(gòu)成。斑馬魚的lamin A、lamin B1和lamin B2的進化程度較高，與人類有一定的相關(guān)性，而黑腹果蠅、線蟲與人類則有較遠的進化關(guān)系。同時，兩兩蛋白序列比對分析結(jié)果，斑馬魚Lmna的蛋白質(zhì)序列與人類的有62%的相似性，lamin B1有70%相似性，lamin B2則有68%的相似性，這也證實斑馬魚的lamin A、lamin B1和lamin B2與其他物種的相似程度較高。共線性分析斑馬魚的lmna、lmnb1和lmnb2基因的位置得出在不同的物種之間核纖層蛋白家族是具有相關(guān)性的。在斑馬魚lmna、lmnb1和lmn b2基因附近查找的相關(guān)基因也可在人類與小鼠的相對應(yīng)基因附近查詢到，也能說明該基因家族在進化的過程中是相對保守的。在進化史上，魚類和哺乳動物從共同的祖先分開進化后，硬骨魚發(fā)生了一次全基因組范圍內(nèi)的染色體復制現(xiàn)象(whole-genomeduplication,WGD)[15]，而以上關(guān)于斑馬魚核纖層蛋白生物信息的初步分析，也證實了斑馬魚的核纖層蛋白也發(fā)生了該復制現(xiàn)象。

注：A:lmna基因,B:lmn b1基因,C:lmn b2基因。圖2　Lmna,lmn b1,lmn b2各基因的共線性分析(人類、斑馬魚、小鼠)Note.A:lmna;B:lmn b1;C:lmn b2.Fig.2　Synteny analysis of the lmna,lmnb1,lmnb2 in human,zebrafish and mouse

綜上所述,斑馬魚的核纖層蛋白與人類的相似程度高，具有直向同源性，提示基因在進化過程中高度保守。斑馬魚可作為一種新型模式生物來研究lmna基因及其相關(guān)領(lǐng)域，為今后對核纖層蛋白的研究提供了一條可拓展的新思路。

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Bioinformatic analysis of the sequences of lamins from different species

ZHANG Heng-lu1,HUANG Hui-min1,YE Zhi-xu1,WANG Zhi-hua2,HE Zhi-xu1,2,3,*,SHU Li-ping2,3,4,*

(1. Department of Pediatrics, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2.Stem Cell and Tissue Engineering Research Center,3.Department of Immunology,4. Laboratory Animal Center,Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China)

ObjectiveType A lamins are encoded by LMNA and a major component of the nuclear lamina, which have been suggested to play important roles in chromatin organization, transcription, DNA replication, and cell apoptosis. The aim of this study was to analyze the bioinformation of zebrafish lamins. Methods A phylogeny analysis was figured out with protein sequences of different species by Clustal X and MEGA 4.0 software. Then we compared the lamin protein sequences of different species with that of zebrafish by BLAST tool from NCBI. A figure of synteny analysis results was done withlaminsequence information of humans, murine and zebrafish cited from UCSC, Vega and Ensemble. ResultsThe analysis results showed thatlmna,lmnb1, andlmnb2 genes of zebrafish are highly conservative and they may be homology of humanLMNA,LMNB1 andLMNB2 genes. ConclusionsZebrafish lamins and human lamins have homologous sequence similarity, indicating that these two genes are orthologous genes.

Zebrafish;Lamins;lmnagene;Phylogeny analysis;Synteny analysis

SHU Li-ping, E-mail:gyslp-456@163.com,HE Zhi-xu,E-mail: hzx@gmc.edu.cn

國家自然科學基金(編號：31260284)。

張衡璐(1990-)，女，碩士研究生，專業(yè)：兒科血液病學。E-mail：364124396@qq.com

舒莉萍(1974-)，博士，副教授，研究方向：干細胞基礎(chǔ)與臨床。E-mail: gyslp-456@163.com

何志旭(1967-)，博士，教授，研究方向：小兒血液病學。E-mail:hzx@gmc.edu.cn

研究報告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0351-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.004

2015-12-24