潘海濤，潘士勇，丁　淳，趙迎峰

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·論著·

激光損傷后不同時(shí)間點(diǎn)鼠視網(wǎng)膜中水通道蛋白-1的表達(dá)

潘海濤，潘士勇，丁淳，趙迎峰

目的采用免疫組化、熒光定量PCR法觀察激光損傷后不同時(shí)間鼠視網(wǎng)膜中水通道蛋白-1(aquaporin-1,AQP-1)的分布及其mRNA表達(dá)的變化。方法Brown Norway(BN)大鼠激光損傷視網(wǎng)膜后，脊椎脫臼法處死，摘除眼球，4%福爾馬林固定，石蠟包埋。平行視神經(jīng)矢狀連續(xù)切片，HE染色、免疫組化染色和陰性對照。用已知有AQP-1表達(dá)的正常大鼠眼球眶周組織中的血管切片為陽性對照。另取出大鼠眼視網(wǎng)膜組織，行實(shí)時(shí)定量PCR檢測。結(jié)果免疫組化切片顯示，褐色粗顆粒出現(xiàn)在大鼠眼組織細(xì)胞中為陽性，無則為陰性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，正常組AQP-1 mRNA表達(dá)量為：(1.15±0.01)，激光損傷即刻：(1.10±0.01)；12 h：(1.10±0.03)；24 h：(1.16±0.01)；72 h：(1.13±0.01)。結(jié)論AQP-1在眼內(nèi)陽性表達(dá)于多個(gè)與水代謝有關(guān)的部位，視網(wǎng)膜上AQP-1 mRNA的表達(dá)在激光損傷后呈現(xiàn)動態(tài)變化，激光損傷初期呈上調(diào)，損傷后期呈下調(diào)表達(dá)。

水通道蛋白-1；免疫組化；熒光定量PCR；BN大鼠

近些年，我國人口老齡化進(jìn)程不斷加速，老年性黃斑變性等一系列視網(wǎng)膜性疾病逐漸成為老年人中主要致盲性眼病。在糖尿病性視網(wǎng)膜病變等新生血管性疾病的發(fā)病過程中，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的損傷常常被認(rèn)為是它們的始動因素，它可導(dǎo)致局部視網(wǎng)膜處于低氧狀態(tài)，繼而引起視網(wǎng)膜屏障破壞，視網(wǎng)膜水腫等一系列問題[1-2]。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用免疫組化法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法觀察激光照射后不同時(shí)間鼠視網(wǎng)膜中水通道蛋白-1(aquaporin-1，AQP-1)的分布及mRNA的變化，并分析其變化特征，以期為下一步探索激光損傷視網(wǎng)膜，探討AQP-1在激光所致視網(wǎng)膜水腫形成發(fā)展中的作用及其相關(guān)機(jī)制打下基礎(chǔ)。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物南京總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供的12周齡雄性、健康Brown Norway(BN)大鼠30只，體重170～220 g。實(shí)驗(yàn)動物合格證號SCXK(軍)2012-0014，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SYXK(軍)2012-0046。

圖1　激光損傷鼠視網(wǎng)膜模型

1.2動物模型建立、分組及取材BN大鼠隨機(jī)分成5個(gè)組：正常對照組、激光損傷后即刻、12 h、24 h、72 h，每組6只。單眼充分散瞳，蓋玻片接觸角膜，激光光凝散瞳眼視網(wǎng)膜，離視盤約2個(gè)視盤直徑外4個(gè)象限均勻光凝50個(gè)點(diǎn)。多次預(yù)實(shí)驗(yàn)后，設(shè)置氬激光參數(shù)：532 nm波長，曝光時(shí)間0.1 s，光斑為50 μm，能量100 mw，正常眼為對照分析。大鼠視網(wǎng)膜激光損傷后，摘除眼球，慶大霉素(50 U/mL)+0.9%生理鹽水徹底沖洗。去除眼前段組織，鑷子輕輕夾取視網(wǎng)膜組織放置凍存管中，立即保存于-80 ℃溫度下，整個(gè)操作過程力求保持無菌。正常對照的BN大鼠不需激光處理以同樣的方式取出視網(wǎng)膜。

1.3主要儀器設(shè)備及試劑光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)OLYMPUS CKX41(日本)，視網(wǎng)膜系統(tǒng)分離儀Viridis Twin(法國),ZT-12H生物組織自動脫水機(jī)(湖北亞光),YB-6生物組織包埋機(jī)(湖北亞光),超薄切片機(jī)LEICA RM2235(德國),DAB顯色試劑盒(Dako公司)，羊抗兔IgG-HRP(杭州華安),兔抗鼠AQP-1多克隆抗體(abcam公司),4%多聚甲醛溶液(南京化學(xué)公司)。

1.4免疫組織化學(xué)檢查脊椎脫臼法處死大鼠，摘除眼球，4%多聚甲醛固定；石蠟包埋，平行視神經(jīng)矢狀位連續(xù)切厚4 μm的切片，每個(gè)標(biāo)本切2片用于HE染色和AQP-1染色；脫蠟，水化后置入3%甲醇、0.5%H2O2中37 ℃溫度下孵育30 min以清除內(nèi)源性過氧化物酶；蒸餾水沖洗后分別滴加正常兔血清30 μL，兔抗鼠AQP-1多克隆抗體工作液(一抗)及稀釋液配制的辣根過氧化酶化羊抗兔IgG二抗工作液，37 ℃溫度下孵育30 min。磷酸鹽緩沖液充分洗滌；吸干PBS液，滴加DAB染色，蒸餾水沖洗；蘇木素復(fù)染3 min，氨水返藍(lán)；酒精梯度順序脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片，加蓋玻片，拍照。1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢查樣品總RNA用TRIzol法提取，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物(G￣A￣P￣D￣H￣-￣F￣：￣T￣G￣T￣G￣T￣C￣C￣G￣T￣C￣G￣T￣G￣G￣A￣T￣C￣T￣G￣A￣；￣G￣A￣P￣D￣H￣-￣R￣：￣T￣T￣G￣C￣T￣G￣T￣T￣G￣A￣A￣G￣T￣C￣G￣C￣A￣G￣G￣A￣G￣)￣，以GAPDH為內(nèi)參基因，做相對定量檢測。

2　結(jié)　果

2.1激光損傷鼠視網(wǎng)膜模型如圖1所示：圍繞視乳頭，距離視乳頭邊緣約2個(gè)視盤直徑外可見激光損傷照射點(diǎn)，均勻分布于四個(gè)象限之中，避開網(wǎng)膜血管，激光斑區(qū)域網(wǎng)膜色澤灰白，透亮，激光斑周圍網(wǎng)膜局部水腫。

2.2免疫組化染色光鏡下AQP-1免疫組化切片顯示，褐色粗顆粒出現(xiàn)在大鼠眼組織細(xì)胞中為陽性，無則為陰性。棕色顆粒顏色越深，表示陽性強(qiáng)度越大。以已知大鼠眼球眶周脂肪組織中的血管管壁AQP-1染色的為陽性對照(圖2)，正常大鼠眼視網(wǎng)膜組織中AQP-1陽性表達(dá)部位主要位于：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，內(nèi)核層(圖3)。圖4～7為激光損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)圖。

圖2　AQP-1染色的為陽性對照(×200)

圖3　正常大鼠眼視網(wǎng)膜組織中AQP-1陽性表達(dá)部位(×200)

圖4　光損傷即刻視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)圖(×200)

圖5　光損傷12 h視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)圖(×200)

圖6　光損傷24 h視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)圖(×200)

圖7　光損傷72 h視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)圖(×200)

2.3熒光定量PCR檢測實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示(表1)，正常組AQP-1 mRNA表達(dá)量為：(1.15±0.01)，激光損傷組分別為：即刻：(1.10±0.01)，激光損傷后12 h：(1.10±0.03)，激光損傷后24 h：(1.16±0.01)，激光損傷后72 h：(1.13±0.01)。與正常組相比，激光損傷即刻組與激光損傷12 h組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；激光損傷24 h組和激光損傷72 h組的差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。圖8激光照射誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)鼠視網(wǎng)膜中AQP-1 mRNA的相對表達(dá)柱狀圖示：激光損傷后鼠視網(wǎng)膜中AQP-1 mRNA的表達(dá)呈動態(tài)變化，在損傷前12 h其表達(dá)不斷上調(diào)，至12 h達(dá)頂峰，后隨著時(shí)間的延長不斷下調(diào)表達(dá)。每個(gè)標(biāo)本做3次復(fù)孔反應(yīng)，ct值相接近，說明該實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性好(ct：熒光信號到達(dá)預(yù)先設(shè)定的閡值時(shí)所發(fā)生的重復(fù)次數(shù))。

表1　激光照射誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)

3　討　論

水通道蛋白(AQPS)是近些年來發(fā)現(xiàn)的一組能夠快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水運(yùn)動的非選擇性細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它普遍存在于動、植物和微生物中[3]。它主要參與體內(nèi)液體的分泌和吸收，在調(diào)節(jié)和維持機(jī)體器官和組織的生理功能中發(fā)揮重要作用。AQP-1和AQP4是目前視網(wǎng)膜上僅發(fā)現(xiàn)的兩種亞型蛋白，其中AQP-1的含量約為AQP4的7倍[4-5]。AQP-1在視網(wǎng)膜的無長突細(xì)胞[6]、色素上皮細(xì)胞[7]和光感受器細(xì)胞[8]等多種細(xì)胞均有表達(dá)，主要分布于外側(cè)視網(wǎng)膜。這種特征性的分布模式提示，AQP-1在調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜內(nèi)水、電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)均衡以及維持正常視覺功能中發(fā)揮非常重要的作用。

視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞與視網(wǎng)膜激光損傷發(fā)生和修復(fù)的全過程聯(lián)系，視網(wǎng)膜激光照射后形成激光斑，激光斑范圍視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡、壞死，形成瘢痕組織，視網(wǎng)膜色素上皮、神經(jīng)上皮與布魯赫膜產(chǎn)生粘連，視網(wǎng)膜色素上皮液體轉(zhuǎn)運(yùn)功能增強(qiáng)。同時(shí)，激光斑周圍網(wǎng)膜發(fā)生局限性水腫，而這一般為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和水平細(xì)胞的水腫。大量的研究表明，視網(wǎng)膜水腫形成是青光眼等高眼壓病人的主要病理改變，它是導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷，視覺功能下降的重要原因[9]。之前大量文獻(xiàn)報(bào)道了AQP-4與視網(wǎng)膜水腫的相關(guān)性，而AQP-1報(bào)道的相對較少。

實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是一種定量分析處理方式，它是在半定量、定性PCR技術(shù)原理上被提出來的,成為當(dāng)下研究mRNA表達(dá)水平最熱門的技術(shù)之一[10-11]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫組化法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法觀察激光照射誘導(dǎo)后不同時(shí)間鼠視網(wǎng)膜中AQP-1的分布及其mRNA表達(dá)的變化。免疫組化染色證實(shí)AQP-1在眼內(nèi)與水代謝有關(guān)的多個(gè)部位呈陽性表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與正常組AQP-1 mRNA表達(dá)量相比，激光損傷后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，只有激光損傷后即刻組與激光損傷12 h組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。我們觀察到AQP-1的表達(dá)在視網(wǎng)膜激光損傷后呈現(xiàn)動態(tài)變化：在激光損傷初期其呈上調(diào)表達(dá)，在激光損傷后其呈下調(diào)表達(dá)。先前有研究提示視網(wǎng)膜挫傷后視網(wǎng)膜會發(fā)生水腫，并且視網(wǎng)膜水腫是動態(tài)變化的[12]。因此我們大膽推測激光損傷視網(wǎng)膜上AQP-1表達(dá)的動態(tài)變化與視網(wǎng)膜水腫的動態(tài)變化這兩者之間可能存在一定的關(guān)聯(lián)性，如圖4～7所示，與正常網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)比較后發(fā)現(xiàn)，激光損傷后不同時(shí)間的網(wǎng)膜組織中，視神經(jīng)細(xì)胞層與內(nèi)核層均有不同程度的水腫。AQP-1可能促進(jìn)視網(wǎng)膜水腫的形成和發(fā)展，也有可能起到保護(hù)作用，具體作用暫不能定論，還有待進(jìn)一步的研究探索。眼組織中AQP-1的調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不十分清楚，在分子與基因水平還存在著組織特異性調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)的因素包括細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)和激素等[13-15]。離子濃度、細(xì)胞成分、容積滲透壓等平衡均跟水含量密切相關(guān)，它們的異常表達(dá)會影響基因的表達(dá)、蛋白質(zhì)分子的功能與結(jié)構(gòu)，從而影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能。眼組織中AQP-1適量表達(dá)和功能活性正常，是保證這一切正常的先決條件。

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(本文編輯：張仲書；英文編輯：王建東)

Expression of aquaporin-1 in rat retina at different time points after laser injury

PAN hai-tao,PAN Shi-yong,DING Chun,ZHAO Ying-feng.

DepartmentofCadreHealth,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,PLA,Nanjing210002,Jiangsu,China

ObjectiveUsing immunohistochemistry method, fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) to observe the AQP-1 distribution at rat retina and mRNA expression changes in different time after laser injury. MethodsThe Brown Norway (BN) rats were killed by spinal dislocation method after laser damaged, removed the eyeball, fixed in 4% formalin and embedded in paraffin. Parallel optic sagittal serial sections, HE staining, immunohistochemical staining and negative control were performed. Use the vascular slice in normal rat eyes’periorbital tissue, in which AQP-1 expression was known as a positive control. Remove the eye retina tissue of rats and check it with line real-time quantitative PCR. ResultsAQP-1 immunohistochemical examination showed brown coarse particles in rat ocular tissues and cells as positive, no as negative. Real-time PCR results showed normal AQP-1 mRNA expression level: 1.15±0.01; laser damage instantly: 1.10±0.01; 12 hours: 1.10±0.03; 24 hours:1.16±0.01; 72 hours:1.13±0.01. ConclusionAQP-1 is expressed in many parts of the water metabolism, and the expression of AQP-1 mRNA in the retina after laser injury shows dynamic changes, which of the initial laser damage was up, and the latter was down.

aquaporin-1; immunohistochemistry; fluorescence quantitative PCR; BN rats

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(12MA086)

210002江蘇南京，南京總醫(yī)院干部保健科

趙迎峰，E-mail：419569735@qq.com

R774.1

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.04.005

2016-03-11；

2016-05-25)

引用格式：潘海濤，潘士勇，丁淳，等.激光損傷后不同時(shí)間點(diǎn)鼠視網(wǎng)膜中水通道蛋白-1的表達(dá)[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(4):354-357.