金長鑫，吳　瓊，劉　燁，劉　波，劉　衛(wèi)，黃進軍

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·論著·

富血小板血漿凝膠聯(lián)合脂肪干細胞促進大鼠創(chuàng)面修復的實驗研究

金長鑫1，吳瓊2，劉燁3，劉波4，劉衛(wèi)5，黃進軍3

目的探討富血小板血漿(PRP)凝膠聯(lián)合脂肪干細胞(ADSCs)對大鼠創(chuàng)面修復的影響，為其臨床應用提供理論基礎。方法體外分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠ADSCs。取16只SD大鼠，制備大鼠自體PRP凝膠，采用自身對照的方法，每只實驗大鼠背部制作4個1 cm2的正方形皮膚全層缺損創(chuàng)面，分為AP組、A組、P組、O組，分別給予ADSCs+PRP 處理、ADSCs處理、PRP處理以及空白對照處理，觀察術后各組創(chuàng)面愈合情況。并于術后3、5、7、14 d分別隨機處死4只實驗大鼠，取創(chuàng)面組織，HE染色進行病理組織學觀察，血小板-內皮細胞黏附分子(CD31)免疫組化分析各時間點新生血管化情況，天狼猩紅染色對Ⅰ型膠原含量和Ⅲ型膠原含量進行檢測，并對創(chuàng)面組織的轉化生長因子β1(TGF-β1)表達情況進行逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測。結果大體觀察AP組和P組較A組和O組結痂快、創(chuàng)緣收縮也較快；微血管計數(shù)CD31細胞陽性表達率及I型膠原蛋白含量AP組、A組、P組均高于O組，且AP組與O組差異更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；創(chuàng)面愈合過程中，AP組創(chuàng)面組織的TGF-β1表達也明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論ADSCs與PRP凝膠的應用能加速新生血管化及增加膠原蛋白合成，可有效加速創(chuàng)面愈合。

脂肪干細胞；富血小板血漿凝膠；皮膚缺損；創(chuàng)面修復

戰(zhàn)傷是軍事醫(yī)學的重點研究對象，由于戰(zhàn)傷導致的皮膚與軟組織缺損，將直接影響戰(zhàn)斗力和戰(zhàn)士戰(zhàn)后的生活質量，是亟待解決的課題之一。脂肪干細胞(ADSCs)可增加真皮細胞外基質中膠原的合成，促進皮膚創(chuàng)面愈合[1]；富血小板血漿(PRP)在血管發(fā)生、組織修復和炎癥過程中也起重要作用，促進創(chuàng)面愈合。本實驗研究通過建立皮膚全層缺損的動物模型，觀察應用ADSCs和富血小板血漿修復皮膚全層缺損后創(chuàng)面愈合、組織學變化，對創(chuàng)面組織的血小板-內皮細胞黏附分子(CD31)的表達、轉化生長因子β1(TGF-β1)的表達以及I型膠原和Ⅲ型膠原含量進行檢測。探討ADSCs和PRP促進戰(zhàn)傷創(chuàng)面愈合的機制，為其臨床應用提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1主要試劑和設備DMEM/F12培養(yǎng)基，含EDTA0.25%胰蛋白酶(美國 Hyclone公司)，PBS緩沖液(美國 Hyclone公司)，DMEM溶液，一抗CD31(abcam，ab28364)，二抗Envision，anti-rabbit-HRP(DAKO，K4003)，DAB染色液(DAKO，K5007)，天狼猩紅染色混合液，TRE-Trizol(Invitrogen)， Primers(上海生工)，PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)，SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)，CO2培養(yǎng)箱(Heraeus，German)，拍照系統(tǒng)(Olympus，DP71)，高速冷凍離心機(SIGMA 3K15，德國SIGMA公司)，Real Time PCR儀(CFX96，美國Bio-Rad公司)等。

1.2方法

1.2.1SD大鼠ADSCs體外分離、培養(yǎng)與擴增取4周齡SPF級雄性SD大鼠,使用水合氯醛(7%，0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉,取兩側腹股溝脂肪墊組織,用PBS緩沖液反復漂洗去除組織中的小血管、外包膜和明顯的結締組織，剪碎至靡狀。0.2%一型膠原酶恒溫消化40～50 min。采用基礎培養(yǎng)液中和一型膠原酶后，以1500 r/min離心10 min(離心機半徑為15 cm)，棄雜質及上清后，沉淀混懸后200目濾網過濾，再以1000 r/min離心5 min,棄上清，含10%FBS的DMEM/F12混懸細胞后，按細胞數(shù)1×104～2×104個/培養(yǎng)瓶接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶中加入3 mL全培，置入37 ℃，5%CO2及飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h換液，后每3～4 d換液一次，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，原代細胞培養(yǎng)6～7 d后細胞融合達80%～90%時進行傳代。細胞傳代時棄去原培養(yǎng)液,PBS洗滌1次,以去除血清,加入適量0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA進行消化，在倒置顯微鏡下觀察見胞質回縮、細胞間隙增大,細胞變圓,立即加入適量完全培養(yǎng)基終止消化,用吸管反復輕柔吹打,將細胞吹打下來,1000 r/min離心5 min,含10%胎牛血清,1%青、鏈霉素原液的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸沉積細胞,按1傳3的比例進行傳代。當傳代細胞生長接近單層匯合達到70%以上時,可繼續(xù)傳代。

1.2.2ADSCs多能分化及流式細胞表面標記物的鑒定取生長良好的第3代細胞消化后,以5×104/mL接種于放有玻片的6孔板中，分別加入成脂及成骨分化誘導液培養(yǎng)基進行誘導分化，每3 d更換誘導培養(yǎng)基1次；成脂誘導分化組進行誘導分化處理后2周行油紅O染色倒置顯微鏡下觀察，成骨誘導分化組進行誘導分化處理后4 周后行茜素紅染色觀察鑒定。

1.2.3PRP凝膠的制備利用改良Cascade-Esforax法制備PRP[2-4]，用Ca2+激活制成PRP凝膠[5]。7%水合氯醛(0.3 ml/100 g)經腹腔內注射成功麻醉大鼠后，用裝有0.3 mL 4%枸櫞酸鈉抗凝劑的5 mL注射器連接硬膜外管進行頸靜脈插管抽取大鼠靜脈血3 mL，將抽取的靜脈血等分兩份分別以1100g離心10 min，之后分別加入0.15 mL 50 mg/mL氯化鈣激活，靜置后，取出中間層的淡黃色凝膠，即PRP凝膠備用。

1.2.4大鼠皮膚軟組織缺損創(chuàng)面模型的構建與分組造模前10 min將ADSCs自培養(yǎng)瓶中消化下來，以DMEM溶液混懸，制成ADSCs為3×106/mL的DMEM混懸液備用。大鼠在提取PRP后，在其背部正中脊柱兩側相距2 cm處，等距分別設計四個邊長為1 cm的方形創(chuàng)面，全背部用1%碘伏消毒3次后，沿標記線全層切除皮膚，形成皮膚軟組織缺損創(chuàng)面，并用硅膠板對創(chuàng)面邊緣進行固定，防止創(chuàng)面愈合早期過度收縮，同一只大鼠背部四個創(chuàng)面進行隨機分組，AP組為ADSCs+PRP 處理組，A組為ADSCs處理組，P組為PRP處理組，O組為空白對照組。

1.2.5組織標本的制備與處理術后3、5、7、14 d分別處死四只大鼠，取愈傷組織及其周圍部分組織，使用4%甲醛固定，脫梯度脫水、浸蠟、包埋后制成約5 μm厚的切片。使用HE染色對愈合后的創(chuàng)面組織進行組織病理學觀察。使用CD31免疫組化染色，衡量新生微血管密度?？梢暬炕裥秃廷笮湍z原蛋白的比例，使用天狼星紅染色，偏振光下觀察兩種膠原蛋白的比例。I型膠原纖維呈現(xiàn)紅色或黃色，Ⅲ型膠原蛋白呈現(xiàn)綠色。提取各時間點各組愈傷組織中的核糖核酸(RNA)，逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測其中TGF-β1的表達情況。

1.3統(tǒng)計學處理采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用Bonferroni法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1ADSCs體外誘導多向分化及流式細胞鑒定第3代細胞置于培養(yǎng)基誘導分化2周后細胞體積增大，胞漿內充滿圓形脂滴呈葡萄串狀，這時進行油紅O染色陽性：圓形細胞內出現(xiàn)亮紅色的顆粒，說明細胞可向脂肪細胞分化。成骨分化培養(yǎng)基內誘導分化4周后，經茜素紅染色陽性，可見紅色鈣結節(jié)，證明成骨誘導后細胞可向成骨細胞系分化。流式細胞分析顯示細胞表型為CD29、CD90陽性，CD34、CD45陰性，與ADSCs表型相符。見圖1、圖2。

圖1　A:ADSCs體外誘導 ADSCs成脂誘導分化，2周后油紅O染色(×200)；B:ADSCs成骨誘導分化，4周后茜素紅染色(×200)

2.2大體觀察結果實驗第3天，肉眼觀察下可見AP、P組表面可見覆蓋PRP凝膠處形成淡紅色血痂，且該兩組創(chuàng)面較A組、O組干燥； 實驗第7天，肉眼觀察到創(chuàng)面大小、深度AP組

2.3組織學分析

2.3.1HE染色組織學分析觀察創(chuàng)面愈合后組織切片，AP組腺體樣結構層次分明，新生血管較多，膠原纖維排列與正常皮膚組織類似；A組腺體樣結構較多，新生血管較 AP組少，膠原纖維排列較AP組紊亂；P組新生毛細血管較多，腺體樣結構較少，但其膠原纖維排列有序；O組新生血管形成，視野里被紊亂排列的膠原纖維填充，腺體樣組織較少。見圖3。

2.3.2CD31染色觀察微血管密度各組隨時間的遷移CD31陽性表達率呈上升趨勢，其中術后第14天，ADSCs+PRP組與其他3組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

2.3.3膠原蛋白合成分析I型膠原蛋白，在天狼星紅染色過程中被染成紅色或黃色，是各組創(chuàng)面含量最為豐富的膠原蛋白。III型膠原蛋白(未成熟的膠原蛋白、被染成綠色)含量較少。結果顯示I型膠原含量在14 d內隨時間的遷移而增加，其中3 d時，除A組與P組組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),其余各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，即AP組I型膠原蛋白含量較其余三組高，A組、P組I型膠原蛋白含量均較O組高；5 d時，除A組與P組組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),其余各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，即AP組I型膠原蛋白含量較其余三組高，A組、P組I型膠原蛋白含量均較O組高；7 d，AP組、A組、P組、O組各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，即I型膠原蛋白含量AP組>P組>A組>O組；14 d時，AP組、A組、P組、O組各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，即I型膠原蛋白含量AP組>A組>P組>O組。見圖5。

圖2　流式細胞表型鑒定：CD29、CD90陽性，CD34、CD45陰性

A:ADSCs+PRP組；B:PRP組；C:ADSCs組；D:空白對照組圖3　術后第14天，各組HE染色(×100)

O組:空白對照組；A組:ADSCs組；P組:PRP組；AP組:ADSCs+PRP組 圖4　各組各時間點創(chuàng)面組織的CD31染色(×100)

O組:空白對照組；A組:ADSCs組;P組:PRP組；AP組:ADSCs+PRP組圖5　各組各時間點創(chuàng)面組織的天狼猩紅染色(×100)

2.4TGF-β1含量的RT-PCR檢測結果各組TGF-β1的表達在術后第1周內均呈上升趨勢， AP組、A組及P組的上升情況高于O組，其中AP組上升更為明顯；在術后第2周時TGF-β1的表達下降，AP組下降較為顯著，與O組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3　討　論

3.1PRP聯(lián)合ADSCs可有效促進新生血管再生許多成熟組織中含有干細胞，用于組織損傷修復過程。自脂肪組織中分離干細胞已有十幾年，并且越來越多地用于臨床前和臨床模型，ADSCs可提供有效的血管生成生長因子,包括血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子等，促進病灶的新生血管化。大量實驗研究發(fā)現(xiàn)單一的生長因子不會促進細胞增殖及細胞轉移，只有當多種細胞因子結合在一起時才能發(fā)揮作用，促進創(chuàng)面愈合。而PRP是全血經離心后得到的血小板濃縮物，被Ca2+激活后，可釋放大量生長因子，如血小板衍生生長因子(PDFG)、轉化生長因子-β(TGF-β)和類胰島素生長因子1(IGF-1)等[6]。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，ADSCs聯(lián)合PRP凝膠使局部創(chuàng)面組織血管化的程度優(yōu)于單純ADSCs組及PRP組。這種差異在我們第2周的研究中更加明顯。值得注意的是，PRP凝膠對ADSCs在新生血管化方面起著協(xié)同作用，并且可能加強了ADSCs的增殖及對生長因子的分泌。

3.2PRP聯(lián)合ADSCs可增加膠原蛋白合成皮膚的強度及耐力主要與真皮中膠原蛋白的組成有關，通常起主要作用的是I型膠原蛋白(85%～95%)，其次是Ⅲ型膠原蛋白(10%～15%)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，ADSCs聯(lián)合PRP凝膠組I型膠原蛋白的含量較其他幾組明顯增加。這種差異在第2周時更為明顯，表明膠原蛋白再生已經加速，并形成了高質量的瘢痕。之前有研究可以解釋該結果的產生，ADSCs可通過TGF-β等細胞因子調控其旁分泌作用，從而加速成纖維細胞的遷移和增殖[7-8]。TGF-β是一種多功能蛋白質，作用于細胞增殖、分化和細胞外基質分泌，參與調控生物體免疫調節(jié)、血管形成、胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合骨的重建等生理過程。其中TGF-β1有動物實驗表明它可以促進傷口愈合和典型肉芽組織形成等[9-10]。亦有實驗證明TGF-β1治療可以提高I、III型膠原mRNA的表達[11]。所以TGF-β1在治療傷口愈合方面有潛在的應用前景。在本實驗中可見在AP組、A組P組及O組TGF-β1的表達在術后第1周內均呈上升趨勢，且AP組較其他各組增加尤為明顯，而在術后第 2周時表達下降，這一結果可能和TGF-β1在預防瘢痕方面有關。研究認為TGF-β1這種細胞因子的過度表達可以致瘢痕形成，而在創(chuàng)面愈合后期適當?shù)囊种瓶梢詼p少瘢痕的產生[12]。這種現(xiàn)象說明PRP聯(lián)合ADSCs可以通過改變TGF-β1的提前表達加速創(chuàng)面組織的愈合，同時后期表達的下降可以減少瘢痕組織的形成。

綜上所述，本研究結果表明，聯(lián)合ADSCs與PRP凝膠的應用能加速新生血管化及增加膠原蛋白合成，可有效加速創(chuàng)面愈合。未來的實驗可側重于如何完整上皮化的研究，從而使這項技術早日應用于臨床。

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(本文編輯：黃攸生；英文編輯：王建東)

Thereseach of platelet rich plasma gel combined with adipose-derived stem cells in repairing soft tissue wounds in rats

JIN Chang-xin1, WU Qiong2, LIU Ye3,LIUBo4,LIUWei5,HUANGJin-jun3.

1.DepartmentofPlasticSurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an,Shanxi710032,China; 2.DepartmentofPlasticandReconstructiveSurgery,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510282,China; 3.DepartmentofPlasticandAestheticSurgery, 4.DepartmentofInfectionDiseases, 5.DepartmentofGastroenterology, 105HospitalofPLA，Hefei,Anhui230031,China

ObjectiveTo explore the role of ADSCs and PRP in skin defect repairing, and to provide theoretical basis for clinical application. MethodsAdipose tissues from inguinalis fat pad of SD rats were harvested, isolated, cultured, and identified. 16 SD rats were taken, and autologous PRP gel was prepared. 4 square shaped full-thickness skin defect (a=1 cm2) was made on the rat back using self-control method. The wounds were divided into 4 groups randomly, of which group AP was treated with ADSCs and PRP; group A was treated with ADSCs; group P was treated with PRP and group O is blank control group. The wound healing process was observed. HE, sirius red, CD31 stain were observed at 3 d, 5 d,7 d, 14 d after surgery. TGF-beta 1 expression was detected by Rt-PCR in wound tissue. ResultsThe wound contraction of group AP and group P were faster than the group A and O; CD31 positive expression rate and content of type I collagen of microvascular counts in group A, group P and group AP were higher than that of O group. There was significant difference between group AP and group O (P<0.05). In the process of wound healing, the expression of TGF - beta 1 in wound tissue of group AP was significantly higher than the blank control group (P<0.05). ConclusionApplication of ADSCs comnined with PRP gel by means of accelerating new blood vessels and increasing collagen synthesis can effectively accelerate wound healing.

adipose stem cell; platelet-rich plasma gel; skin defects; wound healing

南京軍區(qū)醫(yī)藥科研項目(12MA033)

1. 710032陜西西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院整形外科；2. 510280廣東廣州，南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院整形外科；3. 230031安徽合肥，解放軍105醫(yī)院整形美容外科，4. 感染科,5. 消化科

黃進軍，E-mail: surgeonhuangjj@163.com

R641

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.04.004

2016-02-23；

2016-05-04)

引用格式：金長鑫，吳瓊，劉燁，等.富血小板血漿凝膠聯(lián)合脂肪干細胞促進大鼠創(chuàng)面修復的實驗研究[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(4):349-353.