崔云前，葉國(guó)超，魏麗培，魏世雄

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353）

降低上面發(fā)酵小麥啤酒頭痛感的釀造條件優(yōu)化

崔云前，葉國(guó)超，魏麗培，魏世雄

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353）

啤酒上頭的原因主要是較高的醇酯比和乙醛含量。為降低上面發(fā)酵小麥啤酒頭痛感，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并通過氣相色譜（GC）檢測(cè)啤酒中高級(jí)醇、酯類和乙醛等風(fēng)味物質(zhì)含量。結(jié)果表明，最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度18℃（醇酯比2.02、乙醛含量3.51 mg/L）、發(fā)酵壓力0.12 MPa（醇酯比2.01、乙醛含量2.75 mg/L）和零代酵母（醇酯比2.20、乙醛含量2.76 mg/L）。在此條件下發(fā)酵的小麥啤酒醇酯比為2.0～2.5，乙醛含量＜4 mg/L，不易引起上頭。

上面發(fā)酵小麥啤酒；頭痛感；醇酯比；乙醛

上面發(fā)酵小麥啤酒以其潔白細(xì)膩的泡沫、濃郁的香味、強(qiáng)烈的殺口力、略酸的口感、較低的苦味廣受消費(fèi)者青睞［1］。其采用上面發(fā)酵酵母高溫發(fā)酵（發(fā)酵溫度15～25℃），帶來豐富酯香、飽滿風(fēng)味的同時(shí)卻容易引起頭痛即上頭。高級(jí)醇、乙醛隨血液循環(huán)進(jìn)入腦部，使腦神經(jīng)細(xì)胞收縮、痙攣，引起上頭；而酯類進(jìn)入腦后，使腦神經(jīng)細(xì)胞松弛、擴(kuò)張，抵消了高級(jí)醇、乙醛的上頭作用［2］。因此，引起上頭的主要原因是較高的醇酯比（高級(jí)醇與酯類含量之比）和乙醛含量［3-4］。

高級(jí)醇俗稱雜醇油，是指3個(gè)碳原子以上的醇類總稱，是啤酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)。啤酒中高級(jí)醇主要有正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇等［5］。酯類是啤酒風(fēng)味物質(zhì)的主要成分，含量雖少，但對(duì)啤酒風(fēng)味影響極大，主要有乙酸乙酯（溶劑味）、乙酸異戊酯（香蕉味）、乙酸異丁酯（水果味）、乙酸苯乙酯（玫瑰花香和蜂蜜香味）、己酸乙酯（甜蘋果味）、辛酸乙酯（酸蘋果味）等［5-6］。一般情況下，啤酒醇酯比≥6易上頭，醇酯比≤4.7不易上頭，醇酯比在2.5～4.7之間風(fēng)味最優(yōu)［4，7-8］。有報(bào)道［9］指出，啤酒過濾損失酯類引起醇酯比升高0.4，故考慮到啤酒過濾灌裝可能造成酯類更多的損失導(dǎo)致醇酯比升高，在此之前必須保證啤酒醇酯比＜2.5，才能保證消費(fèi)者買到的啤酒風(fēng)味最佳。乙醛是在啤酒發(fā)酵前期大量形成的一種中間代謝物質(zhì)、生青味物質(zhì)，影響著啤酒的風(fēng)味和穩(wěn)定性，優(yōu)質(zhì)啤酒中乙醛含量為2～8 mg/L［3，10］。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平逐漸提高、消費(fèi)觀念逐漸增強(qiáng)，小規(guī)模上面發(fā)酵小麥啤酒生產(chǎn)已無法滿足人們的需求。本試驗(yàn)以2 t啤酒發(fā)酵設(shè)備對(duì)上面發(fā)酵小麥啤酒的發(fā)酵條件進(jìn)行中試規(guī)模優(yōu)化，能較準(zhǔn)確地模擬大規(guī)模生產(chǎn)，是實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模設(shè)備無法比擬的。研究發(fā)酵溫度、發(fā)酵壓力及酵母代數(shù)等發(fā)酵條件對(duì)啤酒中高級(jí)醇、酯類和乙醛等風(fēng)味物質(zhì)含量的影響，以期獲得降低頭痛感的最優(yōu)條件，為大規(guī)模生產(chǎn)上面發(fā)酵小麥啤酒的優(yōu)化提供一些理論和實(shí)踐的基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

大麥芽、小麥芽：永順泰（昌樂）麥芽有限公司；苦型酒花顆粒：張掖斯丹納酒花有限公司；上面發(fā)酵啤酒酵母DM 303：德國(guó)Doemens啤酒學(xué)院提供，齊魯工業(yè)大學(xué)中德啤酒技術(shù)中心保藏；氯化鈉（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；4-甲基-2-戊醇（分析純）、乙醇（色譜純）：美國(guó)Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

2 t啤酒發(fā)酵設(shè)備（1 t糖化煮沸鍋和2 t發(fā)酵罐）：濟(jì)南中德啤酒有限公司；6820氣相色譜儀（gaschromatograph，GC）、DB-WAXETR毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.53 mm×1.0 μm）火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）：安捷倫科技（上海）有限公司；頂空固相微萃取裝置（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME），包括SPME手柄和聚丙烯酸樹脂（Poly（acrylic acid），PA）萃取頭（85 μm）：美國(guó)SUPELCO公司；Xutemp恒溫水浴鍋：杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1酵母擴(kuò)培

1.3.2工藝流程

1.3.3優(yōu)化設(shè)計(jì)

在相同設(shè)備和糖化工藝條件下，得到11°P麥汁（40%小麥芽），接種零代酵母（滿罐酵母數(shù)1.0×107CFU/m L），控制發(fā)酵20℃發(fā)酵，當(dāng)糖度降到4.3°P后封罐保溫20℃保壓0.14 MPa還原雙乙酰，待雙乙酰含量＜0.1 mg/L后降溫至5℃維持24 h（保壓0.14 MPa），再降溫至0℃，冷貯保壓5 d，即得發(fā)酵成熟的嫩啤酒，利用氣相色譜儀檢測(cè)啤酒中高級(jí)醇、酯類和乙醛等風(fēng)味物質(zhì)含量。在此工藝基礎(chǔ)上，通過改變發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度、發(fā)酵壓力及酵母代數(shù)等單因素，研究其對(duì)啤酒中高級(jí)醇、酯類和乙醛等風(fēng)味物質(zhì)含量的影響（試驗(yàn)平行三組），以得最優(yōu)發(fā)酵條件。

1）發(fā)酵過程采取3個(gè)溫度：16℃、18℃和20℃。

2）在糖度降到4.3°P后封罐，分別采取了0.12 MPa、0.14 MPa和0.16 MPa保壓發(fā)酵。

3）采用0、40%小麥芽的11°P麥汁（麥汁的理化指標(biāo)見表1），均接種零代和一代酵母進(jìn)行發(fā)酵。

表1　麥汁的理化指標(biāo)Table 1 Physicochem ical indicators of wort

1.3.4檢測(cè)方法

定性分析采用頂空固相微萃取法（HS-SPME）氣相色譜檢測(cè)啤酒中高級(jí)醇、酯類和乙醛等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。運(yùn)用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standard and technology，NIST）譜庫(kù)進(jìn)行初步檢索，再結(jié)合文獻(xiàn)的保留指數(shù)進(jìn)行對(duì)比，確認(rèn)各香氣物質(zhì)的化學(xué)組成。

定量分析采用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為4-甲基-2-戊醇。

樣品處理：在20 m L頂空進(jìn)樣瓶中，加入氯化鈉3 g，注入10 m L事先預(yù)冷至約5℃的啤酒，移入0.1 m L質(zhì)量濃度約5.000 mg/L的4-甲基-2-戊醇溶液，加蓋密封墊和鋁帽、壓緊，電磁攪拌15 min混勻。

萃取及進(jìn)樣：將SPME裝置插入頂空進(jìn)樣瓶，推出萃取頭，在（40±0.2）℃水浴中準(zhǔn)確保溫30 min，退出萃取頭，將SPME裝置取出頂空進(jìn)樣瓶，迅速插入GC進(jìn)樣口，解吸5 min。

氣相色譜條件：初始溫度60℃，保持2 m in，以6℃/m in升至220℃，保持10 m in。載氣：高純氮?dú)?，柱流速?.0 m L/m in，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度220℃，檢測(cè)器溫度250℃。

2　結(jié)果與分析

2.1氣相色譜檢測(cè)啤酒中高級(jí)醇、酯類和乙醛的含量

通過氣相色譜（GC）檢測(cè)啤酒（采用基礎(chǔ)工藝釀造）中風(fēng)味物質(zhì)，獲得不同變量條件下高級(jí)醇、酯類和乙醛等含量變化情況。啤酒氣相色譜檢測(cè)結(jié)果見圖1及表2。

圖1　啤酒樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram o f volatile flavor substances in beer sam ple

表2　啤酒樣品風(fēng)味物質(zhì)名稱及其保留時(shí)間Table 2 Nam es and reten tion tim e o f flavor substances in beer sam p le

圖2　發(fā)酵溫度對(duì)啤酒中高級(jí)醇（A）、酯類（B）、醇酯比（C）及乙醛（D）含量的影響Fig．2 Effec t of temperature on higher alcohols（A），esters（B），ratio of higher alcohols to esters（C），and acetaldehyde（D）content in beer

由圖1及表2可知，從啤酒樣品中鑒定出主要物質(zhì)包括乙醛、醇類4種，酯類7種。

2.2發(fā)酵溫度對(duì)風(fēng)味物質(zhì)含量的影響

在其他工藝條件一致情況下，采用40%小麥芽、零代酵母、0.14 MPa發(fā)酵壓力，研究發(fā)酵溫度16℃、18℃和20℃對(duì)啤酒的高級(jí)醇、酯類和乙醛等風(fēng)味物質(zhì)的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2A可知，發(fā)酵溫度升高，正丙醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇等高級(jí)醇含量均增加，其中異戊醇增加最顯著。不同的是，SAERENS S M等［11］研究得到了發(fā)酵溫度升高顯著增加正丙醇含量，可能酵母菌種不同所致。圖2B可知，發(fā)酵溫度的升高顯著增加了乙酸乙酯和乙酸異戊酯含量，對(duì)其他酯類影響較小，導(dǎo)致酯類總量增加。有報(bào)道提出了發(fā)酵溫度引起高級(jí)醇含量增加促進(jìn)了酯類的形成［12］，增加酯類含量。圖2C可知，總醇和總酯與發(fā)酵溫度呈正相關(guān)趨勢(shì)，而醇酯比卻表現(xiàn)出先小后大的趨勢(shì)，在18℃發(fā)酵時(shí)最?。s為2.02），最不上頭，因此最優(yōu)發(fā)酵溫度18℃。圖2D可知，乙醛與發(fā)酵溫度呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，由于發(fā)酵前期大量產(chǎn)生的乙醛，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，受到乙醇脫氫酶Ⅰ作用而還原成乙醇［12-13］，所以發(fā)酵溫度升高促進(jìn)酶活性，促進(jìn)乙醛還原，乙醛含量自然減少。16～20℃發(fā)酵，乙醛含量均在4.5 mg/L以下（優(yōu)質(zhì)啤酒的乙醛含量為2～8 mg/L［3，11］）不上頭。綜合考慮，選取18℃為最優(yōu)發(fā)酵溫度。

2.3發(fā)酵壓力對(duì)風(fēng)味物質(zhì)含量的影響

以40%小麥芽、零代酵母、20℃發(fā)酵及其他工藝條件不變?yōu)榛A(chǔ)，分別采取0.12 MPa、0.14 MPa和0.16 MPa保壓發(fā)酵，并維持各自壓力直到取樣檢測(cè)，結(jié)果見圖3。

圖3A、圖3B可知，發(fā)酵壓力的升高，正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇等高級(jí)醇與乙酸乙酯、乙酸異戊酯等酯類含量均有所減少，其中異丁醇、異戊醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯變化顯著。主要是因?yàn)榘l(fā)酵壓力升高引起兩種變化。其一是酵母細(xì)胞數(shù)量減少，直接造成高級(jí)醇和酯類含量減少；其二是酵母的脫羧反應(yīng)受到抑制，阻礙了高級(jí)醇和乙酰輔酶A（乙酸酯的前體）的合成，進(jìn)而影響高級(jí)醇和乙酸乙酯、乙酸異戊酯等乙酸酯含量［12］。因此，總醇和總酯含量與發(fā)酵壓力呈負(fù)相關(guān)（見圖3C）。但是三種發(fā)酵壓力下醇酯比均在較低水平（2.00～2.25），可能是酵母狀態(tài)、特性所致。醇酯比在0.12 MPa條件下發(fā)酵時(shí)最?。s為2.01），最不引起頭痛。由圖3D可知，在0.12 MPa和0.14 MPa條件下的乙醛含量相等（約為2.75 mg/L），而在0.16 MPa條件下的乙醛含量開始略微增加（約為3 mg/L）。雖如此，在這三種壓力（0.12 MPa、0.14 MPa和0.16 MPa）條件下發(fā)酵的乙醛含量基本不變且均在較低水平，均不易導(dǎo)致頭痛。綜合考慮，選取0.12 MPa為最優(yōu)發(fā)酵壓力。

圖3　發(fā)酵壓力對(duì)高級(jí)醇（A）、酯類（B）、醇酯比（C）和乙醛（D）含量的影響。Fig．3 Effect o f pressure on higher alcohols（A），esters（B），alcohols to esters ratio（C），and acetaldehyde（D）content in beer

2.4酵母代數(shù)對(duì)風(fēng)味物質(zhì)含量的影響

根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 4927—2008《啤酒》［13］規(guī)定，小麥啤酒的小麥芽比例為40%以上。采用小麥芽比例為0和40%的11°P麥汁，均接種零代和一代酵母，20℃發(fā)酵、0.14 MPa保壓，其他工藝條件一致下，完成中試規(guī)模啤酒釀造，檢測(cè)啤酒中高級(jí)醇、酯類和乙醛的含量，結(jié)果見表3。

表3　酵母代數(shù)對(duì)風(fēng)味物質(zhì)含量的影響Table 3 Effec t of yeast genera tion on flavor substances content

由表3可知，40%小麥芽麥汁α-氨基酸態(tài)氮高于全大麥芽麥汁，歸因于小麥芽的蛋白質(zhì)含量較高。α-氨基酸態(tài)氮是酵母生長(zhǎng)代謝的主要氮源，影響啤酒的風(fēng)味物質(zhì)形成：通過Ehrlich途徑合成高級(jí)醇，進(jìn)而一些高級(jí)醇與有機(jī)酸類聚合成酯類［5，12，14］。α-氨基酸態(tài)氮含量升高，必然導(dǎo)致高級(jí)醇和酯類合成而增加。對(duì)相同代數(shù)的酵母而言，40%小麥芽麥汁釀成啤酒中高級(jí)醇、酯類含量較高，而醇酯比差異極?。ㄏ啾热篼溠葵溨驘o小麥芽麥汁）。另外，對(duì)于這兩種不同成分麥汁，接種零代酵母發(fā)酵成的啤酒醇酯比較小、乙醛含量較低，最不易上頭（相比一代酵母）。經(jīng)過一次啤酒生產(chǎn)的一代酵母發(fā)酵特性有所改變，表現(xiàn)出產(chǎn)高級(jí)醇能力增強(qiáng)、產(chǎn)酯、乙醛還原能力減弱等部分性狀衰退現(xiàn)象，說明了酵母菌種遺傳不穩(wěn)定。但也不是絕對(duì)的，酵母回收時(shí)間和方法也會(huì)影響到酵母的活性與特性［5］。因此，降低上面發(fā)酵小麥啤酒的醇酯比、乙醛的最優(yōu)酵母代數(shù)為零代。

3　結(jié)論

通過對(duì)上面發(fā)酵小麥啤酒中風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)，確定了上面發(fā)酵啤酒酵母DM 303發(fā)酵的小麥啤酒風(fēng)味物質(zhì)的特點(diǎn)：高級(jí)醇含量較高，以異戊醇為主；酯類較豐富，以乙酸乙酯和乙酸異戊酯為主，產(chǎn)生濃郁香蕉香味；醇酯比較低（均在2.0～2.5之間）、乙醛含量較小（＜4 mg/L），不易上頭。雖然酵母DM 303的優(yōu)勢(shì)很明顯，但是可能存在遺傳衰退現(xiàn)象，不利于大生產(chǎn)，將進(jìn)一步研究這種酵母的遺傳穩(wěn)定性問題和完善酵母回收方法。

通過對(duì)降低上面發(fā)酵小麥啤酒頭痛感的釀造條件優(yōu)化，確定了最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度18℃、發(fā)酵壓力0.12 MPa和零代酵母。

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Optim ization of top-fermented wheat beer brew ing technology to reduce headache

CUI Yunqian，YE Guochao，WEI Lipei，WEI Shixiong
（College of Bioengineering，Qilu University of Techno logy，Jinan 250353，China）

The main cause of headache after drinking beer is high ratio of higher alcohols to esters and high level of acetaldehyde.To reduce headache after drinking top-fermented wheat beer，the fermentation conditions were optim ized，and the flavor substances of higher alcohols，esters，and acetaldehyde were detected by gas chromatography.The result showed that the optimum fermentation conditions were as follow s：fermentation tem perature 18℃（alcohols to esters ratio 2.02，acetaldehyde content 3.51 mg/L），pressure 0.12 MPa（alcohols to esters ratio 2.01，acetaldehyde content 2.75 mg/L）and zero yeast generation（alcohols to esters ratio 2.20，acetaldehyde content 2.76 mg/L）.Under this condition，the alcohol to ester ratio of the fermented beer was 2.0-2.5，acetaldehyde content was less than 4 mg/L，which was not easy to cause headache.

top-fermented wheat beer；headache；alcohols to esters ratio；acetaldehyde

TS261．4

0254-5071（2016）05-0134-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．028

2015-12-19

工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津科技大學(xué)）開放基金項(xiàng)目（2011IM 002）

崔云前（1969-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代啤酒釀造技術(shù)。