余俊杰，　王建軍，　翟　偉，　趙　亮，　吳　東

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院胸外科，武漢　4300142華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胸外科，武漢　430022

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論著

DACH1對人肺腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的抑制作用*

余俊杰1，2，王建軍2，翟偉2△，趙亮1，吳東2

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院胸外科，武漢4300142華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胸外科，武漢430022

目的研究DACH1在肺癌組織及配對癌旁組織中的表達(dá)情況，以及對人肺腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的作用。方法收集46例經(jīng)病理學(xué)診斷為肺癌患者的組織標(biāo)本，選取腫瘤組織并以配對癌旁組織為對照，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測腫瘤組織與配對癌旁組織標(biāo)本中DACH1 mRNA表達(dá)情況；采用免疫組織化學(xué)法檢測兩組標(biāo)本中DACH1蛋白的表達(dá)情況。使用siRNA干擾技術(shù)抑制人肺腺癌A549細(xì)胞系中DACH1的表達(dá)，采用MTT法觀察其對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，Transwell小室法觀察腫瘤細(xì)胞侵襲的變化，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測對細(xì)胞系誘導(dǎo)凋亡的作用。結(jié)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR測得DACH1 mRNA在肺癌組織中表達(dá)下降，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示肺癌組織中DACH1蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。siRNA干擾A549細(xì)胞DACH1的表達(dá)后，MTT法顯示，si-DACH1組細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)；Transwell小室法顯示si-DACH1組細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)，流式細(xì)胞術(shù)顯示，si-DACH1組細(xì)胞自發(fā)凋亡率明顯降低。結(jié)論DACH1在肺腺癌組織中表達(dá)減少，在肺腺癌中起到抑癌基因的作用，并有望成為肺癌治療的新靶點(diǎn)。

肺腺癌；DACH1；增殖；侵襲；凋亡

肺癌是人類常見的惡性腫瘤之一，近年來，其發(fā)病率呈逐步上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命[1]。盡管目前各種診療手段不斷提高，但約80%臨床確診為肺癌的患者來醫(yī)院就診時(shí)就已經(jīng)處于腫瘤晚期，有超過一半的患者已經(jīng)存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而無法手術(shù)根治，或合并有不適合手術(shù)的疾病而無法接受手術(shù)[2]。即使接受手術(shù)根治、化療、放療以及個(gè)體化治療，其中大部分也將最終發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)期生存率普遍較低。近年來，DACH1在腫瘤中的作用越來越受到關(guān)注，已經(jīng)有研究證明在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌、腎透明細(xì)胞癌和胃癌中有DACH1表達(dá)的改變[3-4]。對于肺癌中是否存在DACH1 mRNA以及蛋白表達(dá)的改變值得研究。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

A549細(xì)胞(美國ATCC公司)、高糖DMEM培養(yǎng)液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，美國Hyclone公司)、胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)、噻唑藍(lán)(MTT，美國Amresco公司)、Transwell小室(美國Corning公司)、基質(zhì)膠(Matrigel，美國BD公司)、Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒(上海貝博公司)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(日本TaKaRa公司)、兔抗人DACH1多克隆抗體、HRP標(biāo)記的二抗(美國Abcam公司)。

1.2標(biāo)本收集

46例病例均來源于武漢協(xié)和醫(yī)院胸外科2012年3月～2013年6月期間接受外科手術(shù)治療的肺腺癌患者，所有患者術(shù)前均未接受化療和(或)放療等抗腫瘤治療，所有患者術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)為原發(fā)性肺腺癌，臨床病理資料完整可靠。病理標(biāo)本分別取自術(shù)中切除的新鮮肺癌組織和癌旁組織(距腫瘤邊緣3 cm以內(nèi)的肺組織)兩部分配對，所有標(biāo)本分兩份，其中一份標(biāo)本快速冰凍保存于-80℃冰箱中，直至用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測mRNA水平；另一份標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定后制作成蠟塊，標(biāo)準(zhǔn)條件存放，此部分標(biāo)本用于免疫組織化學(xué)法檢測DACH1蛋白的表達(dá)。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測腺癌組織及癌旁組織DACH1 mRNA表達(dá)

提取RNA后行cDNA的合成，應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒行熒光定量PCR反應(yīng)。DACH1上游引物序列：5′-CTTGTCAGAGGGAAGGGTGG-3′，下游引物序列：5′-GCACTGTTTGCCGCTTTACTT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。反應(yīng)體系為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火50 s，72°C延伸45 s，行40個(gè)循環(huán)。系統(tǒng)自動檢測熒光，得出Ct(Cycle Threshold)值。

1.4免疫組織化學(xué)法檢測腺癌組織及癌旁組織DACH1蛋白表達(dá)

組織固定及石蠟包埋后切片，血清封閉后一抗孵育，DACH1多克隆抗體濃度為1∶100，于4℃冰箱中保存過夜，二抗37℃孵育45 min后行DAB顯色，復(fù)染脫水后封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.5siRNA技術(shù)干擾A549細(xì)胞DACH1的表達(dá)

DACH1基因siRNA表達(dá)載體由上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)建，設(shè)計(jì)DACH1正義序列鏈：5′-AAGGCCTCCTAAGAGGACTCA-3′，陰性對照正義序列鏈：5′-GACTTCATAAGGCGCATGC-3′。按照Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后行Western blot及免疫熒光測siRNA干擾效果。

1.6Western blot及免疫熒光測siRNA干擾效果

分別將兩組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞加入裂解液中進(jìn)行研磨，超聲后離心取上清進(jìn)行蛋白定量，每組加樣40 μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜。脫脂牛奶封閉后一抗(1∶500)孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，用ECL化學(xué)發(fā)光劑在凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像及定量分析。

分別將兩組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行爬片，多聚甲醛固定后，0.01%Triton X-100破膜，室溫下1%胎牛血清封閉30 min，加一抗(1∶500)4℃孵育過夜；PBS洗3遍每次5 min；Cy3-羊抗兔二抗(1∶50)室溫下暗盒中孵育2 h，DAPI染核后封片，熒光顯微鏡成像。

1.7MTT實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染72 h后將A549細(xì)胞以1.0×105/mL密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，分別于接種后1、2、3、4 d進(jìn)行MTT檢測。每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)，混勻，37℃培養(yǎng)4 h，吸棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，紫外分光光度計(jì)490 nm波長測各孔吸光度(A)值，每孔設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.8細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

Matrigel稀釋液(5 mg/L)包被Transwell小室的上室面，4℃干燥，PBS漂洗后放入預(yù)先加有600 μL含10%FBS的培養(yǎng)液內(nèi)，隨后在小室內(nèi)加入100 μL A549細(xì)胞懸液，1.0×104/孔，37℃培養(yǎng)20 h后取出小室，棉簽擦去上室面細(xì)胞后固定，0.1%結(jié)晶紫染色后顯微鏡下行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.9Annexin Ⅴ-FITC/PI法檢測凋亡率

用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后離心收集細(xì)胞，冷PBS洗滌細(xì)胞2次，離心后用400μL Annexin Ⅴ結(jié)合液重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1×106/mL。加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC染色液，4℃避光孵育15 min，加入10 mL PI 4℃避光孵育5 min，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組數(shù)據(jù)均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1DACH1在肺癌組織與在癌旁組織中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，46例癌組織中DACH1相對于GAPDH的ΔCt值為(6.18±0.42)，癌旁組織中其ΔCt值為(3.00±0.23)，計(jì)算2-ΔΔCt為0.43倍，即癌組織中DACH1基因mRNA含量為癌旁組織中的0.43倍，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，肺癌組織中IOD/area值為(0.067 1±0.005 8)，癌旁組織中IOD/area值為(0.151 2±0.012 8)，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。該結(jié)果顯示癌組織中DACH1 mRNA與蛋白表達(dá)均低于癌旁組織。

A：癌旁組織；　B：肺癌組織圖1　肺癌組織與癌旁組織中DACH1的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×100)Fig.1 Expression of DACH1 in lung adenocarcinomas and the matched adjacent normal tissues(IHC Staining，×100)

2.2肺腺癌患者臨床參數(shù)與DACH1 mRNA的關(guān)系

根據(jù)46例肺腺癌標(biāo)本的mRNA檢測結(jié)果，將患者以mRNA的中位數(shù)進(jìn)行分類，23例為高表達(dá)，23例為低表達(dá)。分組結(jié)果顯示DACH1與腫瘤大小及疾病分期存在關(guān)聯(lián)，與吸煙狀態(tài)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(表1)。

表1　肺腺癌患者臨床參數(shù)與DACH1 mRNA的關(guān)系

2.3siRNA干擾A549細(xì)胞DACH1表達(dá)

轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞72 h后，行免疫熒光檢測DACH1的表達(dá)，結(jié)果顯示si-DACH1組細(xì)胞的DACH1表達(dá)明顯較對照組減少(圖2A)；RT-PCR及Western bolt檢測也顯示si-DACH1組細(xì)胞的DACH1表達(dá)明顯較對照組減少(圖2B)。Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組相對灰度值為(1.00±0.11)，si-DACH1組灰度值為(0.34±0.09)，si-DACH1組的DACH1表達(dá)明顯較對照組減少。值得注意的是，在A549細(xì)胞中，DACH1在胞質(zhì)及核內(nèi)均有表達(dá)，胞質(zhì)表達(dá)較核內(nèi)明顯，我們考慮與細(xì)胞系的差異性有關(guān)。

A：免疫熒光檢測DACH1表達(dá)(×400);B：左RT-PCR檢測DACH1 mRNA表達(dá)，右Western blot檢測DACH1蛋白表達(dá)圖2　si-DACH1抑制A549細(xì)胞DACH1的表達(dá)Fig.2 Inhibited DACH1 expression in A549 cells transfected with si-DACH1

2.4DACH1沉默對肺腺癌細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，si-DACH1組A549細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)(圖3)。在1、2、3、4 d，對照組的吸光度值分別為(0.34±0.04)、(0.47±0.05)、(0.78±0.07)、(1.33±0.06)，si-DACH1組的吸光度值分別為(0.35±0.06)、(0.62±0.05)、(1.07±0.07)、(1.84±0.06)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.5DACH1沉默對肺腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染DACH1 siRNA 72 h后，通過Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)比較兩組細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示si-DACH1組的侵襲細(xì)胞率為(65.2±1.5)%，明顯高于對照組(28.2±1.1)%(P<0.05，圖4)，提示DACH1 siRNA具有增強(qiáng)A549細(xì)胞侵襲的作用。

圖3　兩組細(xì)胞增殖能力的比較Fig.3 Comparison of the proliferation of A549 cells between the two groups

A：對照組；B：si-DACH1組圖4　兩組細(xì)胞侵襲能力的比較(×100)Fig.4 Comparison of the invasion of A549 cells between the two groups(×100)

2.6DACH1沉默對肺腺癌細(xì)胞凋亡的影響

兩組細(xì)胞用Annexin Ⅴ-FITC/PI染色，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞凋亡率為(3.84±0.52)%，si-DACH1組細(xì)胞凋亡率為(1.42±0.61)%，兩組凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。表明DACH1的沉默可明顯降低肺腺癌細(xì)胞的自發(fā)凋亡。

A：對照組B：si-DACH1組圖5　兩組細(xì)胞自發(fā)凋亡的比較Fig.5 Comparison of the spontaneous apoptosis of A549 cells between the two groups

3　討論

DACH1是近年來發(fā)現(xiàn)的與多種腫瘤密切相關(guān)的抑癌基因之一，DACH1通過DS域參與相關(guān)信號通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，其低表達(dá)提示預(yù)后不良。目前研究結(jié)果顯示，DACH1在人乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中表達(dá)降低，并與腫瘤類型、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[5-6]。

DACH1通過直接結(jié)合到細(xì)胞周期蛋白D1啟動子區(qū)域并減少癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)。在乳腺癌中，DACH1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和干細(xì)胞重組因子，起到抑制腫瘤的作用[7]。DACH1通過DS域直接作用于DACH1靶基因的啟動子區(qū)域抑制Klf4、Nanog和Sox2的表達(dá)，阻礙乳腺腫瘤的生長并抑制干細(xì)胞增殖。DACH1也可抑制IL-8的表達(dá)和分泌從而抑制乳腺癌細(xì)胞的浸潤和全身轉(zhuǎn)移[7]。在前列腺癌中同樣觀察到DACH1水平的降低，DACH1增加AR活性而參與調(diào)控前列腺腫瘤的進(jìn)展[8]。這些研究顯示出DACH1的多種調(diào)控作用以及對細(xì)胞活性及腫瘤發(fā)生的影響。

通過全基因組測序顯示，DACH1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)明顯降低，提示其在肺癌中同樣存在抑癌作用的可能[9]。我們首先進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組化實(shí)驗(yàn)，檢測結(jié)果顯示DACH1在肺腺癌組織中表達(dá)水平明顯降低，說明其可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展，其表達(dá)水平下降可能會失去對其他轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的調(diào)控，從而失去對癌基因的轉(zhuǎn)錄抑制，肺癌細(xì)胞得以生長，也可能通過一個(gè)特定的細(xì)胞通路調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因。我們應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)沉默A549細(xì)胞DACH1的表達(dá)后，觀察到細(xì)胞增殖、侵襲明顯增強(qiáng)，細(xì)胞自發(fā)凋亡率明顯降低，說明DACH1的缺失可能導(dǎo)致細(xì)胞正常分化的失調(diào)，在肺癌的浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定作用。以上結(jié)果表明，DACH1基因在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能具有重要的作用，并有望成為肺腺癌治療的有效靶點(diǎn)，但具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。Han等[10]的研究顯示，DACH1的表達(dá)與CXCL5呈負(fù)相關(guān)，并證明DACH1對腫瘤的抑制作用是通過抑制CXCL5信號通路來完成，這對我們今后的研究方向具有一定借鑒作用。

DACH1表達(dá)缺失的肺癌患者是否也存在較差的預(yù)后還需要繼續(xù)臨床隨訪觀察。此外，在非小細(xì)胞肺癌中常常伴隨著極度活躍的EGFR突變基因，果蠅中與DACH1同源的DAC基因有抑制EGFR的作用[11-12]，DACH1能否通過抑制EGFR的功能而阻止腫瘤的進(jìn)展，目前未見文獻(xiàn)報(bào)道，我們將在后續(xù)工作中進(jìn)行深入研究。

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(2016-03-11收稿)

DACH1 Suppresses the Proliferation，Invasion and Apoptosis of Human Lung Adenocarcinoma Cells

Yu Junjie1，2，Wang Jianjun2，Zhai Wei2△etal

1DepartmentofThoracicSurgery，WuhanCentralHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430014，China2DepartmentofThoracicSurgery，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

ObjectiveTo examine the expression of DACH1 mRNA and protein in lung tumor tissues and their adjacent normal tissues and the role of DACH1 in the proliferation，invasion and apoptosis of lung adenocarcinoma cells.MethodsThe expression of DACH1 mRNA was detected by real-time fluorescent quantitative PCR in lung adenocarcinomas(n=46)and the matched adjacent normal tissues(n=46).Immunohistochemistry was used to detect the expression of DACH1 protein.Small-interfering(si)RNA was used to inhibit the expression of DACH1 in A549 cells.After down-regulation of DACH1 with siRNA，the proliferation of A549 cells was evaluated by MTT assay，the invasive ability of cells by using Transwell chamber assay，and the cell apoptosis by flow cytometry.ResultsReal-time fluorescent quantitative PCR and immunohistochemistry showed that the levels of DACH1 mRNA and protein were significantly decreased in lung adenocarcinomas as compared with those in normal tissues.Down-regulation of DACH1 by siRNA resulted in a significant increase in the proliferation and invasion of A549 cells.Flow cytometry revealed that the spontaneous apoptosis was significantly decreased in A549 cells with down-regulation of DACH1.ConclusionThe expression of DACH1 was profoundly decreased in lung adenocarcinomas，indicating that DACH1 may serve as a tumor suppressor gene in lung adenocarcinomas and it is expected to become a new therapeutic target for lung cancer.

lung adenocarcinoma；DACH1；proliferation；invasion；apoptosis

，Corresponding author，E-mail:zw111@aliyun.com

R734.2

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.001

*湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2013CF088)

余俊杰，男，1988年生，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，E-mail:hbsyyjj@163.com