蔣　鳴，　翟祥軍，　徐　池，　周國仁

1 江蘇省腫瘤醫(yī)院放療科，南京　2100092江蘇省疾病預(yù)防與控制中心，南京　210009

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TRAF4沉默對食管癌細胞Eca-109增殖、凋亡及細胞周期的影響

蔣鳴1，翟祥軍2，徐池1，周國仁1

1江蘇省腫瘤醫(yī)院放療科，南京2100092江蘇省疾病預(yù)防與控制中心，南京210009

目的探討小干擾RNA(siRNA)靶向沉默腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4(TRAF4)基因表達對人食管癌細胞惡性行為的影響。方法選取對數(shù)生長期Eca-109細胞并行脂質(zhì)體法高效轉(zhuǎn)染2條靶向沉默TRAF4的siRNA(siTRAF4-1、siTRAF4-2)，采用實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后的TRAF4 mRNA水平以篩選沉默效果較好的siRNA為沉默組，同時設(shè)陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性siRNA序列)和空白對照組。采用噻唑藍(MTT)法檢測轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h的吸光度值以計算各組增殖抑制率，Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染、Caspase-3 FITC單染或PI單染流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后的凋亡率、Caspase-3活化率和細胞周期分布情況。結(jié)果靶向沉默TRAF4 24～96 h內(nèi)，轉(zhuǎn)染siTRAF4-1、siTRAF4-2的Eca-109細胞中TRAF4 mRNA水平均低于未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染對照siRNA的細胞，且轉(zhuǎn)染siTRAF4-1、siTRAF4-2后的沉默率均高于轉(zhuǎn)染對照siRNA的細胞(均P<0.05)；后續(xù)試驗選取沉默率較高的siTRAF4-1進行研究。與空白對照組和陰性對照組相比，沉默組的增殖抑制率、凋亡率及Caspase-3活化率均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；沉默組轉(zhuǎn)染96 h的G0/G1期細胞比例高于空白對照組和陰性對照組，而S、G2/M期細胞比例低于其余兩組，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；空白對照組和陰性對照組以上指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。結(jié)論通過siRNA靶向沉默TRAF4基因表達的效果較好，可抑制細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡、Caspase-3活化和細胞周期G0/G1期阻滯，為食管癌靶向治療提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

小干擾RNA；腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4；食管癌細胞Eca-109；增殖；凋亡

食管癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國屬于高發(fā)腫瘤之一，盡管目前在食管癌診斷、治療上有較大發(fā)展，但預(yù)后仍不盡人意[1]。惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中涉及多個基因的異常表達，故探討影響食管癌惡性行為的關(guān)鍵基因成為靶向治療的重點[2]。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4(Tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF4)在人乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中首次被發(fā)現(xiàn)，與其他TRAF家族成員調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)不同，該因子被證實參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-5]，但目前TRAF4在食管癌中的作用效果及方式尚不清楚。本研究采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)靶向沉默人食管癌細胞Eca-109細胞中TRAF4的表達，在體外水平研究靶向沉默TRAF4基因?qū)ca-109細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響，為TRAF4基因靶向治療提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細胞和主要試劑

食管癌細胞Eca-109購于中科院上海細胞庫，RPMI 1640細胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶為Gibco BRL公司產(chǎn)品，Trizol試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體LipofectamineTM2000為美國Sigma公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為福州邁新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒為南京凱基公司產(chǎn)品，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Caspase-3試劑盒為美國BD公司產(chǎn)品。2條TRAF4 siRNA片段由GenePharma公司設(shè)計并合成，其中siTRAF4-1正義鏈：5′-ATCCGAAAG-CAGTGTGAACACTCCTTTCTTTCGTTAGGC-TTGAATGAAGAACGAG-3′，反義鏈：5′-AGC-AATAGTCGGTTCTGATTTCCAGTCTTACCA-AAGCGTTAGGAACCGCGAAATTC-3′；siTRAF4-2正義鏈：5′-CGAATCCTGATTTCTAGGATGCTAACAGTCGTAACACACGAGTCTCGTTTTGTA-ATGATGG-3′，反義鏈：5′-CTACCGTCAAGAA-ATCTAAGTTGATTCCGTGTCCTATTCCCGT-TGGTTAACAAGGACGAATC-3′。

1.2細胞培養(yǎng)

將凍存的Eca-109從液氮罐中取出，迅速復(fù)蘇后采用RPMI 1640培養(yǎng)液(含體積分數(shù)10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)進行培養(yǎng)，置于CO2無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件維持在溫度37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%及飽和濕度。培養(yǎng)48 h后首次半量換液，之后每3天換液1次。待細胞融合度達80%以上時可進行后續(xù)實驗。

1.3siRNA轉(zhuǎn)染及實驗分組

取100 μL無血清培養(yǎng)液2份，分別加入脂質(zhì)體LipofectamineTM轉(zhuǎn)染試劑和siRNA溶液，室溫孵育5 min后將兩者混勻，進行Eca-109細胞的轉(zhuǎn)染操作，當(dāng)siRNA終濃度為10 nmol/L、脂質(zhì)體Lipofectamine為1.75 μL/mL時的siRNA轉(zhuǎn)染效率達90%以上。將Eca-109培養(yǎng)液更換成無血清培養(yǎng)液后分別加入含2條靶向沉默TRAF4的siRNA載體片段(siTRAF4-1、siTRAF4-2)的轉(zhuǎn)染混合液(沉默組)，同時設(shè)陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性siRNA序列)和空白對照組(僅加Lipofectamine 2000)。在siRNA轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h采用熒光定量RT-PCR(qPCR)檢測Eca-109細胞中的TRAF4 mRNA水平變化，以選取沉默效果較好的siRNA片段進行后續(xù)研究。

1.4細胞增殖活性檢測

取處于對數(shù)生長期Eca-109細胞，制成密度為4.5×104/mL的細胞懸液，按照每孔100 μL接種至96孔板中，CO2培養(yǎng)箱常規(guī)條件培養(yǎng)24 h后進行siRNA轉(zhuǎn)染，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72和96 h后每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清后每孔加入100 μL二甲基亞砜，待結(jié)晶物充分溶解后，采用全自動酶標(biāo)儀在492 nm波長處測定各孔吸光度值(A)，根據(jù)下述公式計算增殖抑制率：抑制率(%)=(空白對照組A值-陰性對照組或沉默組A值)/空白對照組A值×100%。

1.5流式細胞術(shù)檢測凋亡率及Caspase-3活化率

將對數(shù)生長期Eca-109細胞的密度調(diào)整至2×106/mL，接種于6孔培養(yǎng)板中(每孔2 mL)，常規(guī)條件下培養(yǎng)48、96 h后收集細胞并等分為兩部分：①加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI，避光于冰上孵育10 min后，將細胞重懸后將樣品逐一上機檢測，每組設(shè)3個復(fù)孔，計算凋亡率；②FITC標(biāo)記的Caspase-3抗體染色后，上機檢測Caspase-3活化率。每個實驗重復(fù)3次。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞周期

收集各組轉(zhuǎn)染96 h的Eca-109細胞，采用胰蛋白酶消化后，經(jīng)PBS重懸后用乙醇進行固定30 min，用含RNase和PI的染色液染色30 min，上機進行細胞周期分析，采用軟件分別計算不同周期(G0/G1、S、G2/M)細胞數(shù)目占細胞總數(shù)的百分比。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1siRNA靶向沉默TRAF4的效果分析

由圖1A可見，qPCR檢測轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后的TRAF4 mRNA水平發(fā)現(xiàn)，在靶向沉默TRAF4 24 h后即可發(fā)現(xiàn)其mRNA水平降低，且在24～96 h觀察時間內(nèi)轉(zhuǎn)染siTRAF4-1、siTRAF4-2的Eca-109細胞中TRAF4 mRNA水平均低于未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染siRNA的Eca-109細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；圖1B顯示，以未轉(zhuǎn)染的Eca-109細胞為參照，轉(zhuǎn)染siTRAF4-1、siTRAF4-2后的抑制率均高于轉(zhuǎn)染對照siRNA的細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；鑒于siTRAF4-1轉(zhuǎn)染96 h的抑制率高于siTRAF4-2(P<0.05)，故后續(xù)試驗選擇siTRAF4-1片段進行功能學(xué)研究。

A：TRAF4的相對表達量；B：抑制率；與Eca-109同時間組比較*P<0.05；與Eca-109-siRNA同時間組比較△P<0.05圖1　siRNA靶向沉默TRAF4的效果分析Fig.1 Effect of siRNA targeted silencing of TRAF4 gene

2.2siRNA靶向沉默TRAF4對細胞增殖的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，靶向沉默TRAF4可抑制細胞增殖，沉默組的增殖抑制率均高于空白對照組和陰性對照組，且抑制率隨轉(zhuǎn)染時間的延長而升高，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；空白對照組和陰性對照組增殖抑制率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1　siRNA靶向沉默TRAF4對細胞增殖的影響

與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

2.3siRNA靶向沉默TRAF4對細胞凋亡率的影響

AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，靶向沉默TRAF4可促進細胞凋亡，沉默組轉(zhuǎn)染48、96 h的凋亡率均高于空白對照組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；空白對照組和陰性對照組凋亡率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2、圖2。

表2　siRNA靶向沉默TRAF4對細胞凋亡率的影響

與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：沉默組圖2　各組轉(zhuǎn)染96 h后細胞凋亡檢測的流式圖Fig.2 Flow chart of cell apoptosis at 96 h after transfection in each group

2.4siRNA靶向沉默TRAF4對細胞Caspase-3活化的影響

Caspase-3 FITC單染流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，靶向沉默TRAF4可促進細胞Caspase-3活化，沉默組轉(zhuǎn)染48、96 h的Caspase-3活化率均高于空白對照組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；空白對照組和陰性對照組Caspase-3活化率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表3、圖3。

表3　siRNA靶向沉默TRAF4對細胞

與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：沉默組圖3　各組轉(zhuǎn)染96 h后細胞Caspase-3活化檢測的流式圖Fig.3 Flow chart of Caspase-3 activation at 96 h after transfection in each group

2.5siRNA靶向沉默TRAF4對細胞周期的影響

PI單染流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，靶向沉默TRAF4可誘導(dǎo)細胞周期G0/G1期阻滯，沉默組轉(zhuǎn)染96 h的G0/G1期細胞比例高于空白對照組和陰性對照組，而S、G2/M期細胞比例低于其余兩組，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；空白對照組和陰性對照組細胞周期分布的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖4。

組別G0/G1SG2/M空白對照組51.09±3.6229.70±2.1919.02±1.75陰性對照組53.48±4.1727.31±2.6620.37±2.34沉默組82.63±5.12*#11.54±1.53*#7.12±0.97*#

與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：沉默組圖4　各組轉(zhuǎn)染96 h后細胞周期檢測的流式圖Fig.4 Flow chart of cell cycle at 96 h after transfection in each group

3　討論

TRAF為一類重要的胞質(zhì)銜接蛋白，主要參與腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族的信號傳導(dǎo)[6]。此外TRAF家族可以直接或間接地與TNFR的胞質(zhì)部分結(jié)合，調(diào)節(jié)多種信號通路，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、存活，分化與凋亡[7]。TRAF4為該家族中參與腫瘤調(diào)控的一個因子，目前多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)TRAF4在乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤中高表達。Yang等[8]發(fā)現(xiàn)TRAF4可通過Wnt-β-catenin信號通路促進口腔鱗狀細胞癌細胞的生長、侵襲和遷移。通過基因載體手段改變TRAF4表達水平可影響癌細胞的惡性行為，如李偉等[9]的研究發(fā)現(xiàn)采用慢病毒感染的基因手段來沉默TRAF4表達，可抑制結(jié)直腸癌細胞SW620生長，同時對Akt活化及糖酵解過程均有較強抑制效果，而張曉麗等[10]通過載體過表達乳腺癌細胞中的TRAF4水平發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231的細胞增殖能力增強，同時可增加S期細胞比例，以上結(jié)果提示靶向TRAF4可為腫瘤防治提供新思路，但目前TRAF4在食管癌中的作用尚不清楚，故本研究選取常用的食管癌Eca-109細胞為對象，研究靶向沉默TRAF4對其增殖、凋亡及細胞周期的影響。

經(jīng)2條靶向沉默TRAF4的siRNA載體轉(zhuǎn)染后，本研究發(fā)現(xiàn)siTRAF4-1、siTRAF4-2轉(zhuǎn)染后的TRAF4基因表達受抑制，提示TRAF4靶向沉默成功，連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)該沉默方法效果較為持久且沉默率較高，為進一步研究沉默TRAF4對食管癌Eca-109細胞惡性行為的影響，故后續(xù)選擇96 h沉默率可達90%以上的siTRAF4-1片段。惡性腫瘤的基本特征之一為無限增殖，即增殖能力不受控制，本研究采用MTT法發(fā)現(xiàn)siTRAF4轉(zhuǎn)染后的吸光度值降低，以未轉(zhuǎn)染細胞為參照發(fā)現(xiàn)，沉默組的增殖抑制率亦隨轉(zhuǎn)染時間的延長而升高，表明沉默TRAF4基因表達可達到抑制Eca-109細胞增殖的效果。Yao等[11]的研究也發(fā)現(xiàn)沉默TRAF4可在體內(nèi)和體外抑制骨肉瘤細胞生長，與本研究結(jié)果一致。此外，有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)TRAF4水平可達到抑制非小細胞肺癌進展的效果[12]，以上結(jié)果表明靶向沉默TRAF4細胞對抑制惡性腫瘤生長有較好前景。

細胞凋亡是一種細胞自主生理性死亡過程，其啟動和執(zhí)行的發(fā)生過程受機體的精確調(diào)控，而惡性腫瘤細胞的凋亡失衡，也是抗腫瘤治療的關(guān)注點[13-15]。與對照組相比，siRNA靶向沉默TRAF4后的細胞凋亡率升高，轉(zhuǎn)染96 h后的凋亡率升高為對照組的8倍左右，表明靶向沉默TRAF4具有顯著的凋亡促進效果。凋亡蛋白酶Caspase-3信號激活是導(dǎo)致凋亡的主要途徑[16]，而Caspase-3活化率也是評價凋亡作用的主要指標(biāo)[17]，與凋亡率的結(jié)果一致，siTRAF4轉(zhuǎn)染后的Caspase-3活化率較對照組升高，以上表明靶向沉默TRAF4可通過促進Caspase-3活化來發(fā)揮促凋亡效果。細胞周期紊亂是腫瘤的基本特征，也是腫瘤防治的重要切入點[18]。本研究發(fā)現(xiàn)靶向沉默TRAF4基因表達后，絕大部分的Eca-109細胞處于G0/G1期，僅少部分處于S、G2/M期，表明TRAF4對細胞周期有負性調(diào)控作用，推測可能與其影響細胞周期調(diào)節(jié)蛋白表達有關(guān)，下一步將進行重點研究。

綜上所述，通過siRNA靶向沉默TRAF4基因表達的效果較好，可抑制細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡、Caspase-3活化和細胞周期G0/G1期阻滯，為食管癌靶向治療提供了方法學(xué)基礎(chǔ)，后續(xù)研究將在動物實驗中進行驗證。

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(2016-02-01收稿)

Effects of TRAF4 Silencing on the Proliferation，Apoptosis and Cell Cycle of Esophageal Cancer Cell Line Eca-109

Jiang Ming1，Zhai Xiangjun2，Xu Chi1etal

1DepartmentofRadiotherapy，JiangsuCancerHospital，Nanjing210009，China2JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention，Nanjing210009，China

ObjectiveTo investigate the effects of small interfering RNA(siRNA)targeted silencing of tumor necrosis factor receptor associated factor 4(TRAF4)gene on the malignant behaviors of human esophageal cancer cells.MethodsEca-109 cells at the logarithmic growth phase were transfected with 2 siRNAs targeting TRAF4(siTRAF4-1 and siTRAF4-2)by using liposomes.Real-time quantitative PCR was used to detect the TRAF4 mRNA level after transfection in order to screen out the siRNA with better silencing effect.Besides，the negative control group(cells transfected with negative siRNA sequence)and blank control group were set up.The absorbance(A)value at 24，48，72 and 96 h after transfection were measured by MTT assay as to calculate the inhibition rate of cell proliferation.Annexin Ⅴ-FITC/PI double staining，Caspase-3 FITC single staining and PI single staining were used to detect the apoptosis rate，Caspase-3 activation rate and cell cycle distribution，respectively.ResultsIn Eca-109 cells transfected with siTRAF4-1 or siTRAF4-2，TRAF4 mRNA levels were much lower than those without transfection or transfected with control siRNA within 24-96 h post transfection.The silencing rates of cells transfected with siTRAF4-1 or siTRAF4-2 were significantly higher than those transfected with control siRNA(allP<0.05).siTRAF4-1 with higher silencing rate was selected for the follow-up experiment.The proliferation inhibition rate，apoptosis rate and Caspase-3 activation rate were increased in silencing group as compared with those in the blank control group and negative control group，and the differences were statistically significant(allP<0.05).Ninety-six hours after transfection，the proportion of cells at G0/G1phase was found to be higher and the proportions of cells at S and G2/M phase to be lower in silencing group than those in blank control group and negative control group(allP<0.05).There were no significant differences between the control group and the negative control group in the aforementioned indicators(allP>0.05).ConclusionSilencing TRAF4 gene expression by siRNA could inhibit the proliferation and induce the apoptosis，Caspase-3 activation and G0/G1phase arrest of esophageal cancer cells，which provides a methodological basis for targeted therapy of esophageal cancer.

small interfering RNA；tumor necrosis factor receptor associated factor 4；esophageal cancer cell Eca-109；proliferation；apoptosis

R735.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.007

蔣鳴，男，1971年生，副主任醫(yī)師，E-mail：xiaojiduoduo@163.com