路艷芳，　劉為勇，　喬　龍，　汪　峰，　侯紅艷，　孫自鏞△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 1檢驗(yàn)科 2腫瘤生物醫(yī)學(xué)中心，武漢　430030

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用酵母雙雜交篩選與HIV Tat相互作用的宿主因子*

路艷芳1，劉為勇1，喬龍2，汪峰1，侯紅艷1，孫自鏞1△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1檢驗(yàn)科2腫瘤生物醫(yī)學(xué)中心，武漢430030

目的通過(guò)酵母雙雜交試驗(yàn)篩選與HIV Tat蛋白相互作用的宿主因子。方法對(duì)構(gòu)建的pGBKT7-tat進(jìn)行自激活和半乳糖苷試驗(yàn)。運(yùn)用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)以HIV Tat作為誘餌，與人均一化基因庫(kù)進(jìn)行初篩。對(duì)篩選出來(lái)的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果構(gòu)建的pGBKT7-tat無(wú)自激活特性和細(xì)胞毒性，然后進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在DDO/X/A平板上出現(xiàn)47個(gè)陽(yáng)性的藍(lán)色斑點(diǎn)，在QDO/X/A平板上進(jìn)行進(jìn)一步篩選，對(duì)再次出現(xiàn)的8個(gè)藍(lán)色斑點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序。在GenBank中對(duì)相互作用的人體基因進(jìn)行BLAST分析，根據(jù)基因注釋推測(cè)其在病毒與機(jī)體相互作用過(guò)程中可能發(fā)揮的作用。結(jié)果測(cè)出5個(gè)不同的基因，這5個(gè)不同的基因分別為羧肽酶N、酪氨酸磷酸酶受體M、ATP1B1、鋅指蛋白MYM2和鋅指蛋白MYM5。結(jié)論本研究新篩選出羧肽酶、酪氨酸磷酸酶受體和ATP1B1病程相關(guān)蛋白及兩個(gè)鋅指蛋白等5種功能蛋白與HIV Tat相互作用，為進(jìn)一步研究HIV Tat蛋白功能提供依據(jù)。

酵母雙雜交；HIV Tat；蛋白質(zhì)相互作用；天然免疫；病毒復(fù)制

人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是艾滋病的主要病原體。自從1981年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，目前已經(jīng)成為危害人類(lèi)生命健康的重大傳染性疾病。HIV Tat是一個(gè)14 kD的蛋白質(zhì)。它是一個(gè)重要的HIV毒力因子，在病毒基因的表達(dá)、復(fù)制、播散和疾病的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。它不但可以通過(guò)反式激活效應(yīng)參與病毒基因的復(fù)制和表達(dá)，還可以分泌到胞外，抑制免疫細(xì)胞的分化和增殖，誘導(dǎo)其凋亡，激活靜止的CD4+T細(xì)胞，利于HIV的感染和體內(nèi)傳播[1]。研究HIV蛋白質(zhì)間相互作用及與宿主蛋白相互作用對(duì)理解HIV的生命周期、感染機(jī)制等具有重大意義。

1　材料與方法

1.1材料

人均一化文庫(kù)cDNA、酵母菌株Y2H gold菌株、pGADT7、pGBKT7等質(zhì)粒購(gòu)自Clontech公司、DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TaKaRa公司；酵母質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；DNA聚合酶、DNA連接酶試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶Ndel1、Sal1，DNA純化試劑盒等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；各種引物由上海生工合成，測(cè)序由擎科測(cè)序公司完成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1誘餌載體pGBKT7-tat毒性及自激活檢測(cè)采用醋酸鋰法制備酵母菌Y2H Gold菌株感受態(tài)細(xì)胞并轉(zhuǎn)化誘餌載pGBKT7-tat。涂布于單缺SD/-Trp平皿，30℃倒置培養(yǎng)5～7 d，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單個(gè)菌落，擴(kuò)增后提取酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌JM110，以其為模板進(jìn)行PCR鑒定。分析誘餌載體pGBKT7-tat是否成功轉(zhuǎn)化至Y2H Gold菌株。挑取生長(zhǎng)良好的菌落(直徑=2～3 mm)接種于50 mL SD/-Trp并含有Kan+(卡那霉素,20 μg/mL)培養(yǎng)液的三角瓶中，30℃培養(yǎng)5、10、15、20、25和30 h后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其A600nm，分析pGBKT7-tat對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響。將含有pGBKT7-tat重組質(zhì)粒的酵母菌株Y2H Gold菌株涂布SD/-Trp、SD/-Trp/-His及SD/-Trp/-Ade平板，30℃倒置培養(yǎng)5～7 d，觀察平板菌落生長(zhǎng)情況，分析pGBKT7-tat對(duì)酵母是否具有自激活活性。

1.2.2文庫(kù)陽(yáng)性克隆的初步鑒定平板倒置培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落在SD/-His/-Leu/-Trp平板的生長(zhǎng)情況，挑取直徑超過(guò)2 mm的白色菌落，接種于SD/-Ade/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上進(jìn)一步篩選生長(zhǎng)良好的藍(lán)色菌落，參考酵母質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒pGADT7載體。

1.2.3陽(yáng)性克隆的測(cè)序和生物信息學(xué)分析舍棄插入片段小于500 bp的質(zhì)粒，其余轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，以T7 5′-TAATACGACTCACTATAGG-GC-3′，CDS Ⅲ Primer-R 5′-GGCCGCCTCGGCCT-CTAGA-3′為引物進(jìn)行測(cè)序PCR。由擎科測(cè)序公司測(cè)序。根據(jù)序列信息分析插入片段序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，找到同源序列，統(tǒng)計(jì)序列長(zhǎng)度、基因登錄號(hào)、基因注釋等信息。

2　結(jié)果

2.1重組誘餌載體pGBKT7-tat自激活及毒性檢測(cè)

將pGBKT7-tat質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母Y2H Gold菌株，涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade/X-α-Gal平板，以含有pGBKT7-53質(zhì)粒的酵母菌為陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照在三種缺陷型培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，且SD/-Trp/-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基上菌落顏色變?yōu)樗{(lán)色，而誘餌載體只有在SD/-Trp平板能正常生長(zhǎng)，誘餌載體自身不能激活報(bào)告基因His及Ade的表達(dá)，沒(méi)有自激活活性。將含有質(zhì)粒pGBKT7和誘餌載體pGBKT7-tat的Y2H Gold菌株分別進(jìn)行培養(yǎng)，比較二者不同培養(yǎng)時(shí)間A600nm的差異，結(jié)果含有質(zhì)粒pGBKT7的Y2H Gold菌株A600nm吸光度值分別為：0 h：0.008、5 h：0.008、10 h：0.043、15 h：0.250、20 h：1.045、25 h：2.101、30 h：2.434；含有pGBKT7-tat誘餌載體的Y2H Gold菌株A600nm值分別為：0 h：0.010、5 h：0.011、10 h：0.044、15 h：0.204、20 h：0.974、25 h：2.083、30 h：2.414。二者生長(zhǎng)情況相似，證明誘餌載體對(duì)酵母菌沒(méi)有毒性。

2.2酵母雙雜交篩選HIV Tat與人cDNA相互作用的基因

在DDO/X/A平板上出現(xiàn)47個(gè)藍(lán)色菌落，QDO/X/A平板上出現(xiàn)8個(gè)藍(lán)色菌落。結(jié)果如圖1所示。A圖為在DDO/X/A平板上酵母雙雜交結(jié)果。紅色酵母菌落為陰性結(jié)果，沒(méi)有出現(xiàn)相互作用的蛋白質(zhì)，不能激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，編碼β-半乳糖苷酶，催化X-a-gel出現(xiàn)藍(lán)色菌落；藍(lán)色菌落為出現(xiàn)相互作用的蛋白質(zhì)，能夠激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，編碼出β-半乳糖苷酶，催化X-a-gel出現(xiàn)藍(lán)色菌落。B圖為在電子顯微鏡下觀察到的結(jié)果。三葉草型和米老鼠頭樣為典型的兩種不同類(lèi)型的酵母相互融合。

A：在DDO/X/A平板上酵母雙雜交結(jié)果；B：電子顯微鏡觀察結(jié)果圖1　酵母雙雜交結(jié)果Fig.1 Yeast two-hybrid results

2.3HIV Tat相互作用人基因的PCR檢測(cè)鑒定

提取在QDO/X/A平板上長(zhǎng)出的藍(lán)色菌落酵母質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸埃希菌。然后提取大腸埃希菌內(nèi)的質(zhì)粒，以T7、CDSⅢ為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖電泳100 V 20 min，結(jié)果表明插入片段大小在500～1 500 bp之間。由于部分陽(yáng)性克隆未成功提取質(zhì)?；蚋呒?jí)結(jié)構(gòu)的存在導(dǎo)致PCR沒(méi)有成功。其中2、5和8號(hào)條帶過(guò)弱，導(dǎo)致測(cè)序失敗。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。

從左至右依次為M：250 bp Marker、1：陰性對(duì)照和2、3、4、5、6、7、8和9號(hào)陽(yáng)性菌落PCR檢測(cè)結(jié)果圖2　QDO/X/A平板上長(zhǎng)出藍(lán)色菌落的PCR檢測(cè)Fig.2 PCR detection of blue bacterial colonies on QDO/X/A plate

2.4HIV Tat相互作用的人基因的測(cè)序比對(duì)分析

對(duì)PCR陽(yáng)性的菌落測(cè)序結(jié)果在NCBI上BLAST進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果有5個(gè)成功測(cè)序結(jié)果，依次為酪氨酸磷酸酶受體M(PTPRM)、羧肽酶N(CPN2)、Na+，K+-ATPase β1亞單位(ATP1B1)、鋅指蛋白MYM5(ZMYM5)和鋅指蛋白MYM2(ZMYM2),見(jiàn)表1。

表1　HIV Tat為誘餌篩選到人基因信息表

3　討論

HIV Tat不像其他的轉(zhuǎn)錄因子是DNA結(jié)合蛋白，它是一種RNA結(jié)合蛋白，能夠從HIV RNA分子中識(shí)別特殊的結(jié)構(gòu)域即TAR(反式激活因子反應(yīng)元件)。在HIV轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中起著十分重要的作用。在缺乏Tat時(shí)，整合后的病毒DNA轉(zhuǎn)錄效率很低。Tat與反式激活效應(yīng)區(qū)TAR RNA相互作用，反式激活轉(zhuǎn)錄可將轉(zhuǎn)錄效率提高幾百倍。因此Tat蛋白在HIV的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起著十分重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)，從人體均一化cDNA文庫(kù)中篩選到與Tat相互作用的蛋白，通過(guò)生物信息學(xué)分析，羧肽酶、酪氨酸磷酸酶受體和ATP1B1病程相關(guān)蛋白及鋅指蛋白5種功能蛋白可能在與病毒相互作用過(guò)程中起重要作用。

羧肽酶N(CPN)是一種在肝臟中合成分泌到血液中的血漿鋅金屬酶，由兩個(gè)酶活性小單元(CPN1)和兩個(gè)大單元(CPN2)組成，可以保護(hù)蛋白質(zhì)免受降解。先前研究表明，CPN已經(jīng)作為重要的監(jiān)管炎癥分子的重要調(diào)節(jié)者通過(guò)其剪切炎癥分子如補(bǔ)體C3a、C5a的氨基酸精氨酸和賴(lài)氨酸[2-3]。CPN是羧肽酶大家庭的一員，通過(guò)僅僅剪切一個(gè)氨基酸，CPN就能改變活性和受體結(jié)合。其中許多剪切精氨酸和賴(lài)氨酸。因?yàn)楦叨缺Ｊ氐募せ钗稽c(diǎn)和羧肽酶的豐富功能，已經(jīng)很難闡明CPN在疾病過(guò)程中的作用。未來(lái)基因沉默技術(shù)的使用可能最有助于理解CPN在體內(nèi)的功能[4]。

酪氨酸磷酸酶受體M(PTPRM)，一種細(xì)胞的黏附分子，屬于酪氨酸磷酸酶家族中的一員，參與同種抗原的相互作用[5]。有研究表明PTPRM是腫瘤的負(fù)調(diào)因子，與多種腫瘤的進(jìn)程和侵襲有關(guān)，如結(jié)直腸癌和乳腺癌[6-7]。到目前為止，與病毒相關(guān)的研究暫無(wú)。

Na+，K+-ATPase β1亞單位(ATP1B1)，已證實(shí)與多種病毒蛋白有相互作用，并能影響病毒的復(fù)制。在甲型流感病毒時(shí)，其ATP1B1蛋白含量能明顯升高；并且基因敲除ATP1B1后，能夠抑制病毒的復(fù)制[8]。ATP1B1蛋白能與HCMV UL136蛋白相互作用[9]。也有研究表明用電轉(zhuǎn)法將ATP1B1轉(zhuǎn)入兔的肺組織能夠加速肺部液體的清除[10]。但是，至于ATP1B1通過(guò)何種信號(hào)通路對(duì)病毒復(fù)制有影響，還有待進(jìn)一步的研究。

鋅指蛋白MYM2(ZMYM2)，又名ZNF198。是研究得最透徹的鋅指蛋白成員之一。有研究表明其能在肝細(xì)胞復(fù)制和肝細(xì)胞轉(zhuǎn)換時(shí)，蛋白水平下調(diào)，說(shuō)明其在HBV引起的肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制和肝細(xì)胞復(fù)制中具有重要意義[11]。

酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)相互作用的非常有效的分子生物學(xué)手段，且在研究病毒與寄主相互作用方面被廣泛應(yīng)用[12-13]。本試驗(yàn)通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)初步篩選到與HIV Tat相互作用的5種不同功能宿主蛋白，可為深入探討HIV tat在病毒侵染過(guò)程中及與宿主相互作用過(guò)程中的生物學(xué)意義提供依據(jù)。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們將對(duì)選定的重要蛋白進(jìn)行再次相互作用及功能驗(yàn)證。

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(2015-12-02收稿)

Identification of Host Factors Interacting with HIV Tat Protein by Yeast Two-Hybrid System

Lu Yanfang1，Liu Weiyong1，Qiao Long2etal

1DepartmentofClinicalLaboratory，2CancerBiologyResearchCentre，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

ObjectiveTo identify host factors that interact with HIV Tat protein by using the yeast two-hybrid system.MethodsThe self-activation and galactose glucoside experiments were conducted in the constructed pGBKT7-tat vector.Then，the yeast two-hybrid assay was employed to identify human proteins that could interact with Tat protein of HIV by screening the homogenized cDNA library.The positive clones were thereafter sequenced.ResultsThe constructed pGBKT7-tat vector was found no self-activation and cell toxicity.The yeast two-hybrid analysis showed that there were 47 positive blue dots on the DDO/X/A plate.Further screening of the 47 positive blue dots on QDO/X/A plate showed eight blue dots，which were later sequenced.Blast analysis was performed on these gene in GenBank.Five different genes were found based on the gene annotation of which played an important role in the interaction of the virus and the host.They were PTPRM，CPN2，ATP1B1，ZMYM5，and ZMYM2，respectively.ConclusionCarboxypeptidase，tyrosine phosphatase receptor protein，ATP1B1 course-related protein，and two zinc finger proteins that can interact with HIV Tat were found in the study，which provides the basis for further research on the function of HIV Tat.

yeast two-hybrid；HIV Tat；protein interaction；natural immunity；virus replication

，Corresponding author，E-mail：zysun@tjh.tjmu.edu.cn

R373.51

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.009

*國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(No.2012 ZX10004207-004)

路艷芳，女，1991年生，博士研究生，E-mail：lucomeon@126.com