周　梅，　瞿智玲，　白靖平，　岳　娜，　阿迪拉

新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 1病理科 3骨科，烏魯木齊　8300112華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院病理研究所，武漢　430030

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臨床研究

Tie2、Ang1和Ang2蛋白在血管瘤和血管畸形中的表達及臨床意義*

周梅1，瞿智玲2，白靖平3△，岳娜1，阿迪拉1

新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1病理科3骨科，烏魯木齊8300112華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院病理研究所，武漢430030

目的探討Tie2、Ang1和Ang2蛋白在血管異常(血管瘤和血管畸形)中的表達。方法收集新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院2005年至2012年血管畸形50例，皮膚增殖期血管瘤30例，正常組織20例，采用免疫組化SP法檢測Tie2、Ang1和Ang2蛋白在血管異常中的表達。結果Tie2在血管異常中的陽性表達率較高，而Ang1在血管異常中的陽性表達率較低，Tie2在血管瘤和血管畸形中的表達顯著高于正常組織，Ang1在血管瘤和血管畸形中的表達顯著低于正常組織，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；Tie2和Ang2在血管異常中的表達呈正相關關系(P<0.05)。結論Ang1蛋白表達降低可能破壞了血管的穩(wěn)定性，有助于病變的發(fā)展，Tie2蛋白表達增高，其與Ang2結合對病變血管生成可能具有促進作用，Tie2、Ang1和Ang2表達失衡在血管異常的發(fā)病過程中可能起重要的調節(jié)作用。

血管畸形；血管瘤；Tie2；Ang1；Ang2

血管異常在臨床多見，可分為良性血管腫瘤和血管畸形。血管異?？赡芘c血管形成中的調節(jié)因素改變有關，這些調節(jié)因素包括Ang/Tie2系統(tǒng)，Ang/Tie2系統(tǒng)通過干預內皮細胞、平滑肌細胞和血管周細胞的相互作用，促進血管生成和重塑。Tie2是酪氨酸激酶受體，血管生成素Ang1和Ang2是Tie2受體的配體。Ang1是Tie2的啟動劑，Tie2受體與Ang1結合使血管穩(wěn)定。Ang2是Ang1的拮抗劑，可競爭性地與Tie2結合，抑制Ang1的作用。

本課題選取新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院2005年至2012年血管畸形病例50例，皮膚增殖期血管瘤30例，正常組織20例進行研究，旨在通過免疫組化的方法探討血管異常的發(fā)病機制。

1　材料與方法

1.1臨床資料

選取新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院2005年至2012年血管異常病例80例，其中軟組織血管畸形病例50例，男20例，女30例，年齡3～61歲，平均年齡26.8歲；皮膚增殖期血管瘤病例30例，男10例，女20例；年齡1～12個月，平均年齡5.7個月，另選取正常組織20例作對照。

1.2主要試劑

Tie2(BS-1300 R)為兔抗人單克隆抗體，Ang1(OTI8H2)和Ang2(OTI4A3)蛋白均為鼠抗人單克隆抗體，Tie2、Ang1和Ang2抗體稀釋度分別為(1∶200、1∶150、1∶100)，Tie2蛋白免疫組化試劑盒購自于博奧森生物有限公司，Ang1和Ang2蛋白免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物有限公司。

1.3實驗方法

全部標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，將標本制備成4 μm厚的切片，按SP免疫組化試劑盒推薦染色步驟進行操作。

1.4結果判定

Tie2、Ang1和Ang2蛋白陽性為細胞質出現棕黃色或棕褐色顆粒，按陽性細胞所占比例進行半定量分級：<25%為(-)，25%～為(+)，50%～為()，>75%為()。

1.5統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行分析，兩組間率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結果

皮膚增殖期血管瘤由分葉狀毛細血管構成，小葉間為纖維結締組織分隔，小葉內血管內皮細胞較幼稚，增生較活躍，管腔結構不明顯，內皮細胞核較大，核分裂像偶見；而血管畸形由被覆單層扁平內皮細胞的擴大血管腔隙構成，無核分裂像，細胞無明顯異型，管壁發(fā)育不良，有不規(guī)則的管壁平滑肌缺失(圖1A、1B)。在血管異常中，Tie2的陽性表達率較高，表達較強(圖1C、1D)，Ang2的陽性表達率稍高，表達也稍強(圖1E、1F)，而Ang1的陽性表達率較低，表達較弱。Tie2在血管瘤和血管畸形中的表達高于正常組織，Ang1在血管瘤和血管畸形中的表達低于正常組織，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表1、表2；而Ang2在血管異常和正常組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Tie2和Ang2在血管異常中的表達呈正相關(P<0.05)，見表3，但Tie2與Ang1蛋白間無明顯相關性。

A：增殖期血管瘤，由分葉狀毛細血管瘤構成，細胞較幼稚(HE，×100)；B：血管畸形，由被覆單層扁平內皮細胞的擴大血管腔隙構成(HE，×100)；C：Tie2在血管瘤中的陽性表達(IHC，×200)；D：Tie2在血管畸形中的陽性表達(IHC，×200)；E：Ang2在血管瘤中的陽性表達(IHC，×200)；F：Ang2在血管畸形中的陽性表達(IHC，×200)圖1　增殖期血管瘤和血管畸形的組織形態(tài)學特點及免疫組化表達結果Fig.1 Morphological characteristics of proliferating hemangioma and vascular malformation and the immunohistochemical results

類型Tie2+-Ang2+-Ang1+-血管瘤2551713327正常組織7131191010χ212.1690.0149.979P0.0000.9070.002

表2　Tie2、Ang2、Ang1蛋白在血管畸形中的表達

表3　Tie2和Ang2蛋白在血管異常中表達的相關性分析

3　討論

國際脈管性疾病研究協(xié)會(ISSVA)于2007年根據臨床、影像學、病理解剖特征將血管異常分為良性血管腫瘤和血管畸形[1]。血管瘤中最常見的是皮膚嬰兒毛細血管瘤，Bischoff[2]運用多態(tài)性X染色體相關人類男性雄激素受體基因和非隨機X染色體滅活狀態(tài)的方法證實了嬰兒毛細血管瘤為單克隆增生，而血管畸形由結構異常的血管通道構成，可能是胚胎血管形成的調控途徑異常所致[3]。遺傳學研究顯示部分嬰兒毛細血管瘤存在5q丟失和血管內皮生長因子(VEGF)的錯義突變[4]，近年來研究發(fā)現血管畸形的發(fā)生與基因缺陷有關，這些基因中包括靜脈血管畸形的Tie2基因突變[5]，但血管異常的發(fā)病機制還尚未明確。

Tie2是受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族成員，與EGF受體及免疫球蛋白具有同源性，其基因定位于9p21，Tie2在內皮細胞及某些造血內皮祖細胞中特異性的表達，而且均勻表達于胚胎時期血管內皮細胞，在肺內皮細胞，肉芽組織等血管生成活躍的血管內皮中表達較高，對血管生成和心血管發(fā)育具有重要的調節(jié)作用[6-7]。促血管生成素1(Angiopoietins1，Ang1)是Tie2的配體，Ang1在正常組織中表達廣泛，Ang1分泌后進入細胞外基質中，在血管新生及維持血管完整與穩(wěn)定中發(fā)揮著重要的作用[8]。Ang1對內皮細胞具有趨化作用，可促使血管內皮細胞出芽。Ang1啟動Tie2受體后，使內皮周圍平滑肌細胞和血管周細胞募集至血管內皮細胞周圍，通過增加內皮細胞與周圍支持細胞之間的相互作用，維持血管的完整性與穩(wěn)定性，使血管的滲透性降低。Ang1是血管成熟的重要因子[9]，無論是Ang1或Tie2蛋白缺乏均會導致嚴重的微血管缺陷，使小鼠死于胚胎期[10]，因此，Ang1和Tie2是血管形成中重要的角色。本研究顯示Tie2蛋白在血管瘤和血管畸形中的表達顯著高于正常組織，而Ang1在血管瘤和血管畸形中的表達顯著低于正常組織，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，提示Tie2和Ang1在血管瘤和血管畸形的發(fā)病過程中可能發(fā)揮一定的調節(jié)作用，Ang1表達降低，破壞了血管的穩(wěn)定性，有助于病變的發(fā)展，Tie2蛋白表達增高對病變血管生成可能具有促進作用。

Ang2基因位于8p23.1染色體上，主要由血管內皮細胞及內皮旁細胞分泌。Ang2是Ang1的天然拮抗劑，主要分布于子宮、卵巢和胎盤等部位，可能與這些組織的血管重建有關。Ang2是Tie2的配體，多數學者認為其為無信號傳導功能，不能引起Tie2受體的磷酸化，但能競爭性地阻斷Ang1的效應，促進內皮祖細胞移行，Ang2與血管內皮祖細胞間的作用可能在早期能促進新生血管的形成。一些體外實驗發(fā)現Ang2和Angl具有相似的作用，高濃度的Ang2與Ang1類似，能夠抑制內皮細胞的凋亡，促進內皮細胞的存活[11]。Ang2與Tie2結合后，對血管的生成具有雙重調節(jié)作用，其作用主要依賴于周圍環(huán)境中其它促血管生成因子，尤其是VEGF，在組織當中存在VEGF的情況下，Ang2可通過阻斷Ang1的作用，破壞血管的穩(wěn)定性，促進新生血管形成。在缺乏VEGF的情況下，由于Ang2抑制Ang1/Tie2途徑的作用，導致血管發(fā)生斷裂、內皮細胞凋亡、使血管發(fā)生消退[12]。本研究顯示Ang2在血管異常和正常組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示Ang2在血管異常和正常組織的血管形成中均具有調節(jié)作用。

Ang1和Ang2的比例平衡調控著血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，血管的靜止狀態(tài)是通過Ang1-Tie2信號維持的。血管異常中Ang/Tie2的表達情況目前國內外研究和報道較少。Malik等[13]研究發(fā)現Tie2和Ang2等在嬰幼兒血管瘤組織中表達增高，而Ang1表達較低。Hashimoto等[14]研究發(fā)現，Ang2在靜脈系統(tǒng)中的表達是降低的，然而在腦動靜脈畸形(BAVM)中，Ang2的表達卻明顯升高，提示Ang2在血管局部微環(huán)境中的作用占主導地位時，將有利于血管內皮細胞的增殖、遷移、分化和形成新生血管。本課題研究結果顯示Tie2蛋白在血管異常中的表達率較高，陽性率為78.75%，Ang2表達的陽性率也稍高，陽性率為51.25%，Tie2和Ang2蛋白的表達呈正相關關系(P<0.05)，而Ang1蛋白在血管異常中的表達率較低，陽性率為18.75%，本組研究與文獻報道一致，也顯示了Ang/Tie2表達的不平衡。Ang1和Ang2是Tie2基因的配體，Angl與Tie2基因結合起維持血管結構穩(wěn)定的作用，而Ang2作為Ang1的拮抗劑，競爭性地與Tie2基因結合，導致Angl與Ang2在局部表達失衡，Ang1/Tie2信號轉導系統(tǒng)受抑，阻斷了Ang1穩(wěn)定血管活性的作用，導致內皮細胞與血管周圍細胞之間的粘附及相互作用減弱，介導細胞外基質與血管基底膜裂解，內皮細胞和血管周圍間質細胞失去聯系，結構松散，血管壁發(fā)育不良，破壞了血管的穩(wěn)定性，同時在VEGF等生長因子的作用下，血管內皮細胞大量增殖、遷移，誘導血管的形成[15-16]。Ang/Tie2體系表達失衡在血管異常的發(fā)病過程中可能發(fā)揮一定的調節(jié)作用。

綜上所述，Ang1在血管異常中的表達降低，可能破壞了血管的穩(wěn)定性，而Tie2蛋白在血管異常中的表達增高，Tie2與Ang2結合后對病變血管的形成可能具有促進作用，Ang/Tie2體系表達失衡在血管畸形和血管瘤的發(fā)病過程中可能均具有一定的調節(jié)作用，但Ang/Tie2體系蛋白在血管畸形及血管瘤中的作用機制及其相互關系有待于進一步研究。

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(2016-02-01收稿)

Expression of Tie2，Ang1，and Ang2 Proteins in Hemangioma and Vascular Malformation

Zhou Mei1，Qu Zhiling2，Bai Jingping3△etal

1DepartmentofPathology，3DepartermentofOrthopedics，AffiliatedTumorHospital，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China2DepartmentofPathology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

ObjectiveTo investigate the expression of Tie2，Ang1 and Ang2 proteins in hemangioma and vascular malformation.MethodsSpecimens of 50 cases of vascular malformation and 30 cases of skin proliferating hemangioma were collected from patients who were treated during 2005-2012 in the Tumor Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，and 20 cases of normal tissue were used as control.The immunohistochemical S-P method was used to detect the expression of Tie2，Ang1 and Ang2 proteins in vascular anomalies.ResultsThe positive expression rate of Tie2 was significantly higher in vascular anomalies than in control group，but the positive expression rate of Ang1 was much lower in vascular anomalies than in control group.There were significant differences in the expression rate of Tie2 and Ang1 between vascular anomaly group and control group(P<0.05).The expression of Tie2 was positively associated with that of Ang2 in vascular anomalies(P<0.05).ConclusionThe reduced expression of Ang1 protein may undermine the stability of blood vessels，and contribute to the development of the lesion.The increased expression of Tie2 protein，when combined with Ang2，may promote angiogenesis.The imbalance of Tie2，Ang1 and Ang2 may play an important regulatory role in the pathogenesis of vascular anomalies.

vascular malformation；hemangioma；Tie2；Ang1；Ang2

，Corresponding author，E-mail：baijingping1022@sina.com

R365

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.016

*國家自然科學基金資助項目(No.81360282)

周梅，女，1973年生，副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，E-mail：zmzg168@sina.com