陳偉，莫國(guó)君，羅雪蘭，王輝，楊鵬，歐和生

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

微小核糖核酸-24對(duì)內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成的影響

陳偉，莫國(guó)君，羅雪蘭，王輝，楊鵬，歐和生

目的：探討微小核糖核酸（microRNA）-24（miR-24）對(duì)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因表達(dá)調(diào)節(jié)的分子機(jī)制及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成能力的影響。

方法：構(gòu)建miR-24及其反義序列的高表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為：miR-24高表達(dá)組、miR-24 干擾組和空白質(zhì)粒對(duì)照組。用四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測(cè)HUVECs增殖能力，劃痕和Transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，人工基底膜檢測(cè)細(xì)胞的管腔形成能力；分別用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)eNOS和Sp1轉(zhuǎn)錄因子mRNA和蛋白表達(dá)水平。

結(jié)果：（1）與空白質(zhì)粒對(duì)照組比較，miR-24高表達(dá)組細(xì)胞增殖能力降低45.45%（0.36 ± 0.04 vs 0.66 ± 0.08，P＜0.05）；miR-24高表達(dá)組細(xì)胞遷移速度明顯減緩，且遷移數(shù)目降低74.75%（30.25±3.78 vs 119.80±10.94，P＜0.01），未能形成明顯管腔樣結(jié)構(gòu)。（2）與空白質(zhì)粒對(duì)照組比，miR-24高表達(dá)組eNOS mRNA降低46.2%（0.49±0.02 vs 0.91±0.01，P＜0.05），蛋白表達(dá)減少49.07%（0.55±0.05 vs 1.08±0.05，P＜0.05）；同時(shí)Sp1 mRNA降低44.9%（0.49±0. 01 vs 0. 89±0.02，P＜0.05），其蛋白質(zhì)表達(dá)量也相應(yīng)減少54.90%（0.46±0.02 vs 1.02±0.04，P＜0.05）。在miR-24抑制組中，上述指標(biāo)較空白質(zhì)粒對(duì)照組降低，但比miR-24高表達(dá)組顯著升高，特別是小管形成數(shù)量、及管腔長(zhǎng)度與空白質(zhì)粒對(duì)照組相近。

結(jié)論： miR-24顯著抑制HUVECs的增殖、遷移和管腔形成的能力，并且與miR-24對(duì)eNOS的表達(dá)調(diào)控有關(guān)；miR-24明顯抑制eNOS表達(dá)，Sp1的參與可能是這一調(diào)節(jié)過(guò)程的重要分子機(jī)制之一。

核糖核酸；管腔；一氧化氮合酶，內(nèi)皮型

Abstract

Objective: To investigate the effects of miR-24 on endothelial nitric oxide synthase （eNOS） gene expression with regulation and endothelial cell proliferation，migration，tube formation in human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）.

Methods:Constructed high expression plasmid of miR-24 and miR-24 antisense sequence were introduced into HUVECs and the cells included in 3 groups: Control group，miR-24 group and miR-24 inhibitor group. HUVEC proliferation was detected by MTT test，migration was measured by Scratching and Transwell methods，tube formation was examined by Matrigel assay； mRNA and protein expressions of eNOS and Sp1were determined by RT-PCR and Western blot analysis respectively.

Results:①Compared with Control group，miR-24 group had decreased cell proliferation by 45.45% as （0.36 ± 0.04） vs （0.66 ± 0.08），P＜0.05； miR-24 group had lower speed of cell migration，decreased number of cell migration by 74.75% as （30.25±3.78） vs （119.80±10.94），P＜0.01 and there was no obvious tube formation.②Compared with Control group，miR-24 group showed reduced eNOS mRNA expression by 46.2% as （0.49±0.02） vs （0.91±0.01），P＜0.05，reduced protein expression by 49.07% as （0.55±0.05） vs （1.08±0.05），P＜0.05； meanwhile，decreased Sp1 mRNA expression by44.9% as （0.49±0. 01） vs （0. 89±0.02） P＜0.05，decreased protein expression by 54.90% as （0.46±0.02） vs （1.02±0.04），P＜0.05. In miR-24 inhibitor group，the above indexes were lower than Control group but higher than miR-24 group，the amount of tube formation and the length of tubes were similar between Control group and miR-24 inhibitor group.

Conclusion:MiR-24 may inhibit HUVECs proliferation，migration，tube formation and suppress eNOS expression； Sp1 might be one of the important regulators.

（Chinese Circulation Journal，2016，31:797.）

近年來(lái)研究顯示，一些微小核糖核酸（MicroRNA）可通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和形態(tài)變化進(jìn)而調(diào)控血管生成。然而，這些miRNAs的表達(dá)異常參與了心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展［1，2］。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）是內(nèi)皮組織特異型基因，介導(dǎo)大部分的血管內(nèi)源性一氧化氮（NO）合成，后者不僅是調(diào)節(jié)血管緊張度的舒張因子，而且在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、血管重構(gòu)和血管生成等方面起著至關(guān)重要的作用［3］。Sp1是鋅指蛋白家族中最具代表性的一員，通過(guò)三個(gè)保守的鋅指結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合，在許多基因的表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。令人感興趣的是，eNOS核心啟動(dòng)子區(qū)域的GC盒含有Sp1的高親和位點(diǎn)，且Sp1是eNOS的必需轉(zhuǎn)錄因子。我們前期研究提示microRNA-24 （miR-24）對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的調(diào)控與其抑制eNOS和Sp1的表達(dá)有關(guān)［4］。然而，miR-24抑制eNOS的表達(dá)是否參與血管生成的調(diào)控，目前尚不清楚。

為進(jìn)一步探討miR-24對(duì)eNOS和Sp1表達(dá)調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，以及該過(guò)程對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成能力的影響，本實(shí)驗(yàn)選取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?gòu)建的miRNA-24及其反義序列的高表達(dá)質(zhì)粒，然后分別轉(zhuǎn)染HUVECs，觀測(cè)HUVECs的增殖、遷移和血管形成情況，并檢測(cè) eNOS和核轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達(dá)變化情況。

1　材料與方法

試驗(yàn)材料：HUVECs（Procell，中國(guó)武漢）；1640細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco，上海立菲生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（Gibco，澳洲）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（索萊寶科技有限公司，中國(guó)北京）；人工基底膜（Matrigel）（Corning，美國(guó)）；載體 miRNA SelectTMpEGP-miR（Cell Biolabs，美國(guó)）；質(zhì)粒提取試劑盒（天根生化科技有限公司，中國(guó)北京）；X-tremeGENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑盒（Roche，德國(guó)）；總RNA提取試劑盒（TRIzol法）（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，中國(guó)北京）；RT試劑盒（MBI公司，美國(guó)）；PCR試劑盒（天根生化科技有限公司，中國(guó)北京）；eNOS、Sp1兔源多克隆抗體（Abcam，英國(guó)）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（Santa Cruz，美國(guó)）。

miR-24高表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定：miRNA-24序列（來(lái) 自 http://www.miRbase.org）為 5`UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3`；anti-miRNA-24用于下調(diào) miR-24并干擾其作用，序列與miR-24互補(bǔ)，5`-ACCGAGUCAAGUCGUCCUUGUC-3`。對(duì)照組為隨機(jī)序列，5`-GUCAUCAGUCGAGCUAGACGAG-3`。使用脫氧核糖核酸（DNA）合成技術(shù)得到第一鏈DNA，通過(guò)DNA連接反應(yīng)合成相應(yīng)的雙鏈DNA，隨后經(jīng)過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增并進(jìn)行體外重組，最終插入pEGP-miR載體，載體分別命名為pEGP-miRNA-24、pEGP-anti-miRNA-24和 pEGP-control。分別將載體轉(zhuǎn)化入 E.coliDH5α感受態(tài)宿主菌并于氨芐抗性的平板上培養(yǎng)，挑取經(jīng)酶切初步證實(shí)插入正確的單克隆菌落，搖菌后提取質(zhì)粒DNA并寄上海生工進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

HUVECs的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：HUVECs用含有1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中。提取的質(zhì)粒分別使用NANO核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度，重復(fù)3次，取平均值。然后使用無(wú)血清1640培養(yǎng)液將質(zhì)粒稀釋至濃度為0.01 μg/ μl，并將X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒按3 μl：1 μg比例混合，取生長(zhǎng)正常的HUVECs孵育，24 h后更換含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h觀察免疫熒光。根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為：miR-24高表達(dá)組、miR-24 干擾組和空白質(zhì)粒對(duì)照組。

MTT檢測(cè)HUVECs的增殖能力：按文獻(xiàn)［5］的方法通過(guò)MTT檢測(cè)HUVECs的增殖能力。各組細(xì)胞分別以每孔5×103個(gè)接種到96孔板，待細(xì)胞達(dá)到50%融合時(shí)更換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h實(shí)現(xiàn)細(xì)胞同步生長(zhǎng)。接種后24、48和72 h，每孔加10μl MTT繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μl二甲基亞砜，震蕩15 s，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

劃痕和Transwell檢測(cè)HUVECs的遷移能力：按文獻(xiàn)［6］的方法通過(guò)劃痕檢測(cè)HUVECs的遷移能力。各組細(xì)胞分別以4×105個(gè)接種到6孔板，待細(xì)胞融合后用，用移液槍槍頭垂直培養(yǎng)板底部劃“一”字痕。接著，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（磷酸根濃度=0.01 mol/L，pH=7.4）沖洗3遍，將懸浮細(xì)胞洗脫，加入無(wú)血清1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0 h和24 h觀察細(xì)胞遷移情況并測(cè)量劃痕寬度，遷移比例=（劃痕0 h后劃痕寬度-劃痕24 h后劃痕寬度）/劃痕0 h后劃痕寬度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

按文獻(xiàn)［3］的方法通過(guò)transwell檢測(cè)HUVECs的遷移能力。各組細(xì)胞預(yù)先用無(wú)血清1640培養(yǎng)基饑餓12 h，各組細(xì)胞消化后用無(wú)血清1640重懸并以1×104個(gè)接種到Transwell上層小室，下層小室均加入500 μl的含血清培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。12 h后取出上層小室，用棉簽小心拭去小室內(nèi)的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，取出上層小室用PBS沖洗3次，結(jié)晶紫室溫染色1 h，自來(lái)水洗去多余結(jié)晶紫，倒置顯微鏡下觀察Transwell小室膜下的細(xì)胞（每組隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值表示），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Matrigel檢測(cè)HUVECs的成管能力：按文獻(xiàn)［3］的方法通過(guò)人工基底膜（Matrigel）檢測(cè)HUVECs的成管能力。預(yù)先將Matrigel放置于4℃冰箱過(guò)夜解凍，以每孔20 μl鋪于96孔板中，冰上操作。然后將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中放置1 h。各組細(xì)胞消化后用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸并以1×104個(gè)分別種于鋪好的Matrigel上，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后鏡下觀察并分析小管數(shù)量（隨機(jī)取5個(gè)視野）。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后eNOS和Sp1 mRNA的表達(dá)：按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組的細(xì)胞總RNA。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)合成人種屬eNOS、Sp1以及β-actin的引物（序列見(jiàn)表1）。分別取細(xì)胞總RNA 1μg，加入1.0 μl（0.5 g/L）Oligo（dT）18引物，70 ℃變性 5 min，迅速置于冰上冷卻。加入4μl 5×reaction buffer，1 μl RiboLockTM Ribonuclease Inhibitor（20 U/μl），2 μl 10 mmol/L dNTP Mix，37℃溫育5 min，加入1 μl逆轉(zhuǎn)錄酶，42℃1 h，之后 70℃10 min終止反應(yīng)，合成cDNA第1條鏈。PCR擴(kuò)增反應(yīng)：94 ℃ 預(yù)變性5 min后，開(kāi)始30個(gè)循環(huán)： 94℃ 30 s、56℃ 1 min、72℃ 1 min；最后72℃ 5 min，終止反應(yīng)。取5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1　引物序列

免疫蛋白印跡法檢測(cè) eNOS 和 Sp1 蛋白的表達(dá)：分別將各組細(xì)胞裂解，以8000 g離心力、4℃離心15 min，取上清。各組分別取蛋白30μg進(jìn)行SDS-PAGE（8%）分離并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。經(jīng)脫脂奶粉封閉1 h后加入eNOS和Sp1Ⅰ抗?jié)窈羞^(guò)夜（4℃）。TBST（0.14 mol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，24.8 mmol/L Trise base，1%吐溫，pH=7.4）沖洗3次（每次10 min），加入Ⅱ抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記）孵育，1 h后重復(fù)用TBST沖洗（方法同上）。利用LI-COR公司的Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析，采用LSD-t和SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1miR-24對(duì)HUVECs增殖的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示miR-24高表達(dá)組細(xì)胞增殖明顯受到抑制。培養(yǎng)72 h后，與空白質(zhì)粒對(duì)照組相比，miR-24高表達(dá)組OD值降低45.45%（0.36±0.04 vs 0.66±0.08，P＜0.05）；miR-24干 擾 組OD值降低18.18%（0.54±0.05 vs 0.66±0.08，P＜0.05）。與miR-24高表達(dá)組相比，miR-24干擾組OD值則增加50.00%（0.54±0.05 vs 0.36±0.04，P＜0.05）。可見(jiàn)miR-24對(duì)HUVECs的增殖具有一定的抑制作用。

2.2miR-24對(duì)HUVECs遷移的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示（圖1），與空白質(zhì)粒對(duì)照組相比，劃痕24 h后miR-24高表達(dá)組HUVECs的遷移比例降低42.68%（0.47± 0.02 vs 0.82±0.01，P＜0.05）；miR-24干擾組HUVECs的遷移比例降低18.29%（0.67± 0.01 vs 0.82±0.01，P＜0.05）。與miR-24高表達(dá)組相比，miR-24干擾組HUVECs的遷移比例則增加42.55%（0.67± 0.01 vs 0.47± 0.02，P＜0.05）。

為了闡明miR-24對(duì)HUVECs遷移能力的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇Transwell試驗(yàn)進(jìn)行再一次驗(yàn)證。Transwell結(jié)果以鏡下被染色的細(xì)胞判定（見(jiàn)圖2），并計(jì)數(shù)對(duì)比各組差異。與空白質(zhì)粒對(duì)照組比較，miR-24高表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)目明顯降低74.75% （30.25±3.78 vs 119.80±10.94，P＜0.01），miR-24干擾組細(xì)胞遷移數(shù)降低34.89%（78.00±4.30 vs 119.80±10.94，P＜0.01）； 而與 miR-24高表達(dá)組比較，miR-24干擾組細(xì)胞遷移數(shù)則增加157.85%（78.00±4.30 vs 30.25±3.78，P＜0.01）。可見(jiàn)miR-24對(duì)HUVECs的遷移能力具有一定的抑制作用。

圖1　微小核糖核酸-24對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的影響 （×100，n=3）

圖2　微小核糖核酸-24對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響 （×100，n=3）

2.3miR-24對(duì)HUVECs管腔形成的影響（圖3）

HUVECs的增殖和遷移能力與管腔形成密切相關(guān)，為了明確miR-24對(duì)HUVECs管腔形成的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇Matrigel試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與空白質(zhì)粒對(duì)照組相比，miR-24干擾組HUVECs所形成的管腔數(shù)目、長(zhǎng)度及寬度均較小，而miR-24高表達(dá)組HUVECs有聚集傾向，但未能形成管腔樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。綜上，miR-24對(duì)HUVECs的管腔形成具有一定的抑制作用。

圖3　微小核糖核酸-24對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成的影響（×100，n=3）

2.4miR-24對(duì)HUVECs eNOS 和Sp1 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與空白質(zhì)粒對(duì)照組相比，miR-24高表達(dá)組的eNOS mRNA表達(dá)量降低46.2% （0.49±0.02 vs 0.91±0.01，P＜0.05），miR-24干擾組的eNOS mRNA表達(dá)量降低 17.6% （0.75±0.03 vs 0.91±0.01，P＜0.05）。 而 與miR-24高 表 達(dá) 組相比，miR-24干擾組增加了53.06%（0.75±0.03 vs 0.49±0.02，P＜0.05）。 可 見(jiàn)miR-24明 顯 降 低HUVECs的eNOS mRNA水平。

與空白質(zhì)粒對(duì)照組相比，miR-24高表達(dá)組的Sp1 mRNA表達(dá)量降 低44.9%（0.49±0.01 vs 0.89±0.02，P＜0.05），miR-24干擾組的Sp1 mRNA 表 達(dá) 量 降 低 18.0%（0.73±0.02 vs 0.89±0.02，P＜0.05）。而與miR-24高表達(dá)組相比，miR-24干擾 組 增 加 了 48.98%（0.73±0.02 vs 0.49±0.01，P＜0.05）。可見(jiàn)miR-24明顯降低HUVECs的Sp1 mRNA水平。

2.5miR-24對(duì)HUVECs eNOS和Sp1蛋白表達(dá)的影響

Western blotting的檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白質(zhì)粒對(duì)照組相比，miR-24高表達(dá)組的eNOS蛋白表 達(dá) 量 下 降 49.07%（0.55±0.05 vs 1.08±0.05，P＜0.05），miR-24干擾組下降20.37% （0.86±0.07 vs 1.08±0.05，P＜0.05）；而與miR-24高表達(dá)組比較，miR-24 干擾組增加了56.36%（0.86±0.07 vs 0.55±0.05，P＜0.05）。結(jié)果顯示，miR-24明顯降低HUVECs 的eNOS蛋白水平。

通過(guò)Western blotting對(duì)Sp1蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析，miR-24高表達(dá)組轉(zhuǎn)錄因子Sp1 的表達(dá)量比對(duì)照組下調(diào)54.90%（0.46±0.02 vs 1.02±0.04，P＜0.05）；miR-24干擾組轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達(dá)量比對(duì)照組下調(diào)27.45%（0.74±0.02 vs 1.02±0.04，P＜0.05）。與miR-24高表達(dá)組比較，miR-24 干擾組蛋白表達(dá)量增加了60.87%（0.74±0.02 vs 0.46±0.02，P＜0.05）。結(jié)果顯示，miR-24明顯降低HUVECs轉(zhuǎn)錄因子Sp1蛋白水平。

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-24對(duì)HUVECs的eNOS和轉(zhuǎn)錄因子Sp1表達(dá)具有明顯的抑制作用，而且Sp1可能作為重要的調(diào)節(jié)分子與miR-24共同參與對(duì)eNOS的表達(dá)調(diào)控。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，該調(diào)控機(jī)制可能與miR-24抑制HUVECs的管腔形成有關(guān)。另外，我們?cè)僖淮悟?yàn)證了miR-24對(duì)HUVECs增殖的抑制作用，因此推測(cè)miR-24可能通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和管腔形成能力進(jìn)而調(diào)控血管生成。

血管生成是從原有的血管上形成新血管的過(guò)程，不僅貫穿整個(gè)生命過(guò)程，而且在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，研究表明，血管生成與某些miRNA的調(diào)控密切相關(guān)。例如干擾內(nèi)皮型miRNA的成熟將影響內(nèi)皮細(xì)胞功能以及內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成能力；大鼠妊娠期敲除Dicer基因使血管發(fā)生異常，甚至導(dǎo)致胚胎死亡。miR-24屬于miR-23～27～24家族，在心臟特別是血管組織表達(dá)最高［7］。值得注意的是，在高血壓患者血漿中有16個(gè)miRNA明顯下調(diào)，而miR-24等14個(gè)miRNA則明顯上調(diào)，而且miR-24與高血壓的嚴(yán)重程度和并發(fā)癥呈現(xiàn)正相關(guān)。然而，雖然近年來(lái)有關(guān)miR-24在心肌梗死過(guò)程中調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的研究已取得重大進(jìn)展，其相應(yīng)的信號(hào)通路以及發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)也逐步被闡明，但miR-24通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能促進(jìn)血管生成的研究仍處于起步狀態(tài)。

eNOS是組織特異性基因，其產(chǎn)物NO不僅是調(diào)節(jié)血管緊張度的舒張因子，而且在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、血管重構(gòu)和血管生成等方面起著至關(guān)重要的作用［3］。然而，隨著年齡的增長(zhǎng)或病理過(guò)程的發(fā)展，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙引起的NO生成減少，將導(dǎo)致血管新生功能減弱，以及血管內(nèi)皮受損區(qū)域的修復(fù)能力顯著降低［8］。例如，心血管疾病患者體內(nèi)NO產(chǎn)量減少，且循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和血管內(nèi)皮修復(fù)功能降低［9］。通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)及毛細(xì)血管的形成治療心血管疾病，得到了普遍認(rèn)可。目前，在缺血性心臟病的治療中，干細(xì)胞移植療法是一個(gè)新穎而頗具前景的選擇［10，11］。近期體外試驗(yàn)證實(shí)，eNOS的表達(dá)與間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力密切相關(guān)［12］，有進(jìn)一步研究提示，鋅指蛋白可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的eNOS表達(dá)促進(jìn)其定向內(nèi)皮細(xì)胞分化。而Sp1是鋅指蛋白家族中最具代表性的一員，eNOS核心啟動(dòng)子區(qū)域的GC盒含有Sp1的高親和位點(diǎn)，且Sp1是eNOS的必需轉(zhuǎn)錄因子。引人注目的是，miR-24可促進(jìn)干細(xì)胞定向分化及表達(dá)心血管祖細(xì)胞（cardiovascular progenitor cells，CPC）功能，并提高CPC移植到心臟MI區(qū)域后的存活率［13］，促進(jìn)血漿中干細(xì)胞通過(guò)趨化作用富集并進(jìn)入血管壁，使血管穩(wěn)定成熟，但其調(diào)控機(jī)制尚不明晰。

綜上所述，本研究已證明miR-24可能通過(guò)調(diào)節(jié)eNOS和Sp1對(duì)HUVECs的增殖和管腔形成具有一定的抑制作用。然而該調(diào)控機(jī)制是否對(duì)血管生成具有調(diào)控作用，以及是否參與干細(xì)胞定向內(nèi)皮細(xì)胞分化，仍需進(jìn)一步探討。

［1］Zhou Q，Anderson C，Zhang H，et al. Repression of choroidal neovascularization through actin cytoskeleton pathways by microRNA-24. Mol Ther，2014，22： 378-389.

［2］Lorenzen JM，Kaucsar T，Schauerte C，et al. MicroRNA-24 Antagonism Prevents Renal Ischemia Reperfusion Injury. J Am Soc Nephrol，2014，25： 2717-2729.

［3］Huang JJ，Shi YQ，Li RL，et al. Angiogenesis effect of therapeutic ultrasound on HUVECs through activation of the PI3K-Akt-eNOS signal pathway. Am J Transl Res，2015，7： 1106-1115.

［4］Zhang W，Yan L，Li Y，et al. Roles of miRNA-24 in regulating endothelial nitric oxide synthase expression and vascular endothelial cell proliferation. Mol Cell Biochem，2015，405： 281-289.

［5］Hung HS，Chang CH，Chang CJ，et al. In Vitro Study of a Novel Nanogold-Collagen Composite to Enhance the Mesenchymal Stem Cell Behavior for Vascular Regeneration. PLoS One，2014，9： e104019.

［6］Pafumi I，F(xiàn)avia A，Gambara G，et al. Regulation of Angiogenic Functions by Angiopoietins through Calcium-Dependent Signaling Pathways. Biomed Res Int，2015，2015： 965271.

［7］Zhou Q，Gallagher R，Ufret-Vincenty R，et al. Regulation of angiogenesis and choroidal neovascularization by members of microRNA-23～27～24 clusters. Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108：8287-8292.

［8］趙艷霞，格日力. 內(nèi)皮型一氧化氮合酶脫偶聯(lián)在心血管疾病中的致病作用. 中國(guó)循環(huán)雜志，2014，4： 315-318.

［9］Schmidt-Lucke C，R?ssig L，F(xiàn)ichtlscherer S，et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events： proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation，2005，111： 2981-2987.

［10］Premer C，Blum A，Bellio MA，et al. Allogeneic Mesenchymal Stem Cells Restore Endothelial Function in Heart Failure by Stimulating Endothelial Progenitor Cells. E Bio Medicine，2015，2： 467-475.

［11］李玲，石蓓. 心臟干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病的研究進(jìn)展. 中國(guó)循環(huán)雜志，2015，3： 290-292.

［12］Lin YL，Yet SF，Hsu YT，et al. Mesenchymal Stem Cells Ameliorate Atherosclerotic Lesions via Restoring Endothelial Function. Stem Cells Transl Med，2015，4： 44-55.

［13］Hu S，Huang M，Nguyen PK，et al. Novel microRNA prosurvival cocktail for improving engraftment and function of cardiac progenitor cell transplantation. Circulation，2011，124（11 Suppl）： S27-34.

Effects of miR-24 on Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene Expression and Tube Formation in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

CHEN Wei，MO Guo-jun，LUO Xue-lan，WANG Hui，YANG Peng，OU He-sheng.
College of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning （530021），Guangxi，China
Corresponding Author: OU He-sheng，hsou01@yahoo.com

RNA； Tube formation； Endothelial nitric oxide synthase； Sp1

2015-11-22）

（編輯：許菁）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81373403）；廣西研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（YCSZ2015119）

530021廣西壯族自治區(qū)南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院

陳偉碩士研究生主要研究方向：心血管分子藥理學(xué)Email：chenwei_mir2013@163.com通訊作者：歐和生Email：hsou01@yahoo.com

R54

A

1000-3614（2016）08-0797-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2016.08.017