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天津市津南區(qū)咸水沽醫(yī)院內(nèi)科　天津　300350

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肺癌合并慢性阻塞性肺疾病患者C反應(yīng)蛋白與高遷移率蛋白B1的表達(dá)水平分析

孫樹(shù)申李寶福王茂軍宋燕峰郝術(shù)安

天津市津南區(qū)咸水沽醫(yī)院內(nèi)科天津300350

①目的探討肺癌合并慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者高遷移率族蛋白B1(HMGB1)及C反應(yīng)蛋白(CRP)水平，分析其臨床意義。②方法選擇在我院住院的COPD伴肺癌患者作為觀(guān)察組，同期在我院住院的無(wú)COPD肺癌患者作為對(duì)照組，同期在我院查體證實(shí)無(wú)肺功能異常的健康體檢者作為正常對(duì)照組。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)患者血清HMGB1、CRP的水平，蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡試驗(yàn))(Western blot)檢測(cè)患者HMGB1、CRP的表達(dá)，分析其臨床意義及影響因素。③結(jié)果觀(guān)察組HMGB1、CRP表達(dá)水平較對(duì)照組及正常組明顯升高，且對(duì)照組HMGB1、CRP高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；COPD急性加重期的肺癌患者HMGB1、CRP水平明顯高于COPD穩(wěn)定期的肺癌患者，并且重度COPD、多發(fā)肺大泡、呼吸衰竭、III-IV期、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者血清HMGB1、CRP 的水平較輕中度、無(wú)肺大泡、 無(wú)呼吸衰竭、 I～I(xiàn)I期、 無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；COPD分期、COPD病情嚴(yán)重程度、有無(wú)肺大泡、有無(wú)呼吸衰竭、肺癌的臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均是影響實(shí)驗(yàn)組患者 HMGB1、CRP 表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。④結(jié)論HMGB1、CRP在肺癌合并COPD患者中的表達(dá)水平升高，COPD分期、病情嚴(yán)重程度、有無(wú)肺大泡、有無(wú)呼吸衰竭、肺癌的臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均是影響肺癌合并COPD患者HMGB1、CRP表達(dá)水平的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

高遷移率蛋白B1C反應(yīng)蛋白肺癌慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD) 以可逆性不完全性氣流受限為特征，呈進(jìn)行性發(fā)展，是肺部非特異性炎癥性疾病[1]。COPD的病理基礎(chǔ)是氣道重塑，主要原因是小氣道的慢性炎癥刺激引起的局部反應(yīng)，COPD可引起肺血管的異常，早期的肺血管重構(gòu)是由慢性炎癥導(dǎo)致的[2]。高遷移率族蛋白B1 (high mobilitygroup protein B1, HMGB1) 廣泛存在于真核細(xì)胞核中，是一種非組蛋白，起到調(diào)控基因表達(dá)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，其作為細(xì)胞因子，廣泛參與炎癥反應(yīng)[3]。C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP) 是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，由肝臟產(chǎn)生，在急性炎正反應(yīng)時(shí)極為敏感[4]。本研究選取在我院住院的肺癌合并COPD患者，檢測(cè)HMGB1及CRP水平，分析其臨床意義。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇于2014年1月～2015年1月在我院住院的COPD伴肺癌患者40例作為觀(guān)察組，其中男20例，女20例，年齡40～80歲，平均年齡(64.3±6.7)歲。其中COPD急性加重期患者20例，男11例，女9例，平均年齡(65.3±9.1) 歲。COPD穩(wěn)定期患者20例，其中男14例，女6例，平均年齡(57.4±10.2)歲。選擇同期在我院住院的無(wú)COPD的肺癌患者40例作為對(duì)照組，其中男20例，女20例，年齡38～80歲，平均年齡(62.1±6.4) 歲。選擇同期在我院查體證實(shí)無(wú)肺功能異常的健康體檢者20例為正常組，其中男12例，女8例，年齡35～80歲，平均年齡(58.2±9.1) 歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：肺癌患者均經(jīng)病理診斷確診為肺癌；COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)、嚴(yán)重程度分級(jí)、穩(wěn)定期、急性加重期的定義均參考診療規(guī)范(2011年版)；無(wú)精神疾病史，可配合完成本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張、活動(dòng)性肺結(jié)核、心肌梗死、創(chuàng)傷、近2周有感染性疾病、伴發(fā)惡性腫瘤、伴有免疫性疾病、伴有血液系統(tǒng)疾病、伴有嚴(yán)重的心、肝、腎疾病及糖尿病。各組患者性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ，具有可比性。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑HMGB1、CRP、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒：中國(guó)南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；兔抗人HMGB1多克隆抗體、山羊抗人CRP多克隆抗體、山羊抗Action多克隆抗體、Anti-Rabbit lgG/HRP、Anti-Goat IgG/HRP、Western blotting 發(fā)光試劑盒、預(yù)染的低分子量SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)蛋白：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1收集外周靜脈血標(biāo)本。所有入組病例抽取前肘靜脈血5mL，置于干燥清潔試管中，調(diào)整轉(zhuǎn)速3000r/min，離心10分鐘，以毛細(xì)管吸取上清液，置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2ELISA檢測(cè)患者血液中血清HMGB1、CRP的水平。準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品：在含有不同量的HMGB1、CRP的小瓶中加入蒸餾水0.75mL，輕輕混搖，至少15分鐘，并標(biāo)記濃度以便于計(jì)算。準(zhǔn)備洗液：濃洗液40mL加入蒸餾水或去離子水960mL。準(zhǔn)備孵育液：Tracer 600μL加入抗CRP生物素12mL。洗板：用洗液洗鏈霉親合素包被的酶標(biāo)板1次。加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本25μL/孔。加孵育液100μL/孔，室溫下震蕩1小時(shí)。用洗液洗6次/孔。加底100μL/孔，室溫下震蕩30分鐘。加終止液100μL/孔，室溫下震蕩1分鐘。酶標(biāo)儀405nm處測(cè)各孔吸光度(OD)值，15分鐘內(nèi)測(cè)完。計(jì)算:以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，HMGB1、CRP濃度為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得待測(cè)標(biāo)本HMGB1、CRP的水平。

1.3.3Western blot檢測(cè)患者血液中HMGB1、CRP 的表達(dá)。 提取血清總蛋白并檢測(cè)濃度。取蛋白質(zhì)40μg/孔進(jìn)行8%SDS-PAGE，電泳分離蛋白質(zhì)；室溫下封閉1小時(shí)。棄封閉液，加入稀釋后的一抗，HMGB1為1:200，CRP為1:200，βaction為1:500，孵育半小時(shí)，4℃冰箱孵育過(guò)夜。棄去一抗，用TBS-T液沖洗，加入二抗稀釋液溫育，(HMGB1及βaction稀釋度為1:2000，CRP為1:2000)，孵育1小時(shí)。棄去二抗稀釋液，TBS-T清洗后加入顯色A、B液各2mL，化學(xué)發(fā)光顯影。掃描顯影條帶，進(jìn)行光密度分析。

2　結(jié)果

2.1各組血液中HMGB1、CRP的水平采用ELISA檢測(cè)各組患者血清中HMGB1、CRP含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀(guān)察組血清HMGB1為(1.26±0.245)ng/mL、CRP為(24.19±7.76)ng/mL，較對(duì)照組及正常組明顯升高，且對(duì)照組血清HMGB1、CRP的水平高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2Western blot檢測(cè)各組患者HMGB1、CRP蛋白的表達(dá)采用Western blot法對(duì)各組患者血液中HMGB1、CRP的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組HMGB1、CRP蛋白表達(dá)較對(duì)照組及正常組明顯升高，且對(duì)照組HMGB1、CRP的表達(dá)高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2，圖1。

表1　ELISA檢測(cè)各組患者血清中HMGB1、CRP水平

注：與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P<0.05(下同)；與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，#P<0.05(下同)

表2　Western blot檢測(cè)各組患者血液中HMGB1、CRP的表達(dá)

圖1Western blot檢測(cè)各組患者血液中HMGB1、CRP的表達(dá)

2.3實(shí)驗(yàn)組不同臨床特征患者血清HMGB1、CRP的水平比較對(duì)實(shí)驗(yàn)組不同臨床特征患者血清HMGB1、CRP的水平進(jìn)行檢測(cè)，從COPD分期、COPD病情嚴(yán)重程度、肺大泡情況、呼吸衰竭情況、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理學(xué)類(lèi)型、組織學(xué)類(lèi)型等方面進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COPD急性加重期的肺癌患者HMGB1、CRP的水平明顯高于COPD穩(wěn)定期的肺癌患者，并且，重度COPD、有多發(fā)肺大泡、有呼吸衰竭、III-IV期、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者血清HMGB1、CRP的水平較輕中度、無(wú)肺大泡、無(wú)呼吸衰竭、I-II期、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3　觀(guān)察組不同臨床特征患者血液中血清HMGB1、CRP水平的比較

表4　觀(guān)察組患者HMGB1、CRP表達(dá)與臨床病理特征的多因素分析

2.4觀(guān)察組患者HMGB1、CRP表達(dá)與臨床病理特征的多因素分析對(duì)單因素分析中的COPD分期、病情嚴(yán)重程度、有無(wú)肺大泡、有無(wú)呼吸衰竭、肺癌的臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)行Logistic多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COPD分期、COPD病情嚴(yán)重程度、有無(wú)肺大泡、有無(wú)呼吸衰竭、肺癌的臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均是影響實(shí)驗(yàn)組患者HMGB1、CRP表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其相對(duì)危險(xiǎn)度,見(jiàn)表4。

3　討論

氣道炎癥和氣管重構(gòu)是COPD的主要特點(diǎn)，在COPD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，持續(xù)發(fā)展的氣道炎癥是造成氣道重構(gòu)的主要因素[5]。HMGB1主要由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、垂體細(xì)胞等主動(dòng)釋放，由炎癥因子刺激引起，普遍存在于高度保守的核蛋白，參與DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、修復(fù)，主要分布于支氣管及肺泡上皮細(xì)胞，可見(jiàn)于細(xì)胞核、胞質(zhì)及胞膜[6]。HMGB1是新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，分泌到胞質(zhì)或胞外，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，產(chǎn)生趨化作用，其釋放較晚，維持時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等均具有調(diào)控作用[7,8]。CRP是一種非糖基化的聚合蛋白，從急性肺炎球菌患者血液中發(fā)現(xiàn)，作為一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在機(jī)體罹患急慢性感染、組織損傷、惡性腫瘤、手術(shù)、創(chuàng)傷時(shí)水平升高，正常人處于低水平表達(dá)[9]。

在本研究中，對(duì)三組采用ELISA檢測(cè)血清HMGB1、CRP的水平，Western blot檢測(cè)患者HMGB1、CRP蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組HMGB1、CRP水平較對(duì)照組及正常組明顯升高，且對(duì)照組HMGB1、CRP的水平高于正常組。這表明，肺癌患者血清HMGB1、CRP高于正常，肺癌合并COPD的患者，血清HMGB1、CRP的表達(dá)水平明顯升高。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1作用于單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞主要通過(guò)自分泌、旁分泌的形式，表達(dá)一系列炎性因子，炎癥因子促進(jìn)HMGB1釋放，反復(fù)循環(huán)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展[10]。COPD急性加重期患者血清中的HMGB1水平比COPD穩(wěn)定期患者高，重度COPD與多發(fā)肺大泡患者比輕中度與無(wú)肺大泡患者高，無(wú)呼吸衰竭患者的HMGB1明顯低于有呼吸衰竭患者，血清HMGB1水平可反映COPD炎性反應(yīng)與病理改變的嚴(yán)重程度[11]。同本研究結(jié)果類(lèi)似。

本研究對(duì)觀(guān)察組不同臨床特征患者血清HMGB1、CRP的水平進(jìn)行檢測(cè)，從COPD分期、COPD病情嚴(yán)重程度、有無(wú)肺大泡、有無(wú)呼吸衰竭、肺癌的臨床分期、是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等方面進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，COPD急性加重期的肺癌患者HMGB1、CRP的水平明顯高于COPD穩(wěn)定期的肺癌患者，對(duì)于COPD急性加重期的肺癌患者來(lái)說(shuō)，重度COPD、有多發(fā)肺大泡、有呼吸衰竭的III-IV期、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者血清HMGB1、CRP的水平較輕中度、無(wú)肺大泡、無(wú)呼吸衰竭、I-II期、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者高；多因素分析發(fā)現(xiàn)，COPD分期、COPD病情嚴(yán)重程度、有無(wú)肺大泡、有無(wú)呼吸衰竭、肺癌的臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均是影響肺癌合并COPD患者HMGB1、CRP表達(dá)水平的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。新近研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在多種不同類(lèi)型的腫瘤組織中高度表達(dá)，能夠評(píng)估腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的大小、轉(zhuǎn)移情況、臨床分期是影響惡性腫瘤患者預(yù)后的主要因素[12]。研究者用小干擾核糖核酸(RNA)抑制HMGB1基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，也達(dá)到了抑制肺癌L9981細(xì)胞體外增殖和侵襲的目的[13]。還有研究表明，人肺腺癌細(xì)胞A549釋放HMGB1，采用丙酮酸乙酯能夠抑制癌細(xì)胞HMGB1的釋放，從而抑制了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14]。在對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，患者血清HMGB1放入表達(dá)水平比正常對(duì)照組增加，并且臨床分期越高，HMGB1表達(dá)水平越高，且HMGB1的表達(dá)水平與腫瘤大小呈正相關(guān)[15]。這均與本研究結(jié)果相一致。

綜上所述，HMGB1、CRP在肺癌合并COPD患者中的表達(dá)水平升高，COPD分期、病情嚴(yán)重程度、有無(wú)肺大泡、有無(wú)呼吸衰竭、肺癌的臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均是影響肺癌合并COPD患者HMGB1、CRP表達(dá)水平的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。檢測(cè)患者血清HMGB1、CRP表達(dá)水平可能成為判斷疾病發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的新指標(biāo)，而通過(guò)抑制血清HMGB1、CRP的表達(dá)，可能成為治療肺癌合并COPD的新靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。

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(2015-12-25收稿)(庫(kù)雪飛編輯)

Expression level analysis of patients with C-reactive protein and high mobility protein B1 united in lung cancer merger with chronic obstructive pulmonary disease

SUNShushen,LIBaofu,WANGMaojun,etal

(Tianjinjinnansalt-watersellhospital,Tianjin300350,China)

ObjectiveTo select the lung cancer hospitalized in our hospital combined chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patients,to detect HMGB1 and CRP levels and to analyze its clinical significance.MethodsSelect hospitalized in our hospital patients with lung cancer combined COPD as experimental group,the without COPD patients with lung cancer hospitalized in our hospital for the same period as the control group,in the same period in our hospital healthy medical examination confirmed that no abnormal lung function as normal group,the patients serum HMGB1 enzyme-linked immunosorbent method,CRP levels,Western blot detection in patients with the expression of HMGB1,CRP protein,to analyze its clinical significance and influence factors.ResultsThe expression level of HMGB1,CRP in experimental group was obviously higher than the control group and normal group,HMGB1,CRP was higher than normal group and control group,the difference was statistically significant(P<0.05)；Acute aggravating period of COPD patients with lung cancer HMGB1,CRP level was significantly higher in lung cancer patients with COPD stabilization,and severe COPD,multiple pulmonary bullae,respiratory failure,III,IV,serum HMGB1 patients with distant metastasis,the level of CRP with mild-to-moderate,pulmonary bullae,respiratory failure,I-II,without distant metastases was high,the difference was statistically significant(P<0.05);COPD in installment,COPD severity conditions,and the presence of pulmonary bullae,presence of respiratory failure,lung cancer,distant metastasis,clinical stage were experimental group patients independent risk factors of HMGB1,CRP expression(P<0.05).ConclusionThe expression levels of HMGB1,CRP is higher in lung cancer patients merger with COPD,COPD in installment,disease severity,the presence of pulmonary bullae,presence of respiratory failure,lung cancer,distant metastasis,clinical stage are affected lung cancer merger HMGB1 COPD patients,CRP expression level of the independent risk factors.

High mobility protein B1. C-reactive protein. Lung cancer.Chronic obstructive pulmonary disease

孫樹(shù)申(1985-)，男，碩士研究生。研究方向：普內(nèi)科。

李寶福。

R 734.2

A

2095-2694(2016)04-271-06