李少博，賀稚非，李洪軍，任燦

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

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食源性沙門(mén)氏菌耐藥機(jī)制及藥敏性檢測(cè)方法研究現(xiàn)狀

李少博，賀稚非，李洪軍*，任燦

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

沙門(mén)氏菌作為常見(jiàn)的食源性致病菌之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來(lái)，由于抗生素的濫用，沙門(mén)氏菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，這更加深了沙門(mén)氏菌對(duì)人類的危害。文章概述了食源性沙門(mén)氏菌的耐藥機(jī)制，分析了目前較為有效的藥敏性檢測(cè)方法，期望對(duì)食源性沙門(mén)氏菌耐藥性的控制、評(píng)價(jià)抗生素的使用現(xiàn)狀以及研究抗性基因在種屬之間的轉(zhuǎn)移等方面提供理論依據(jù)。

沙門(mén)氏菌；耐藥機(jī)制；藥敏性檢測(cè)方法

沙門(mén)氏菌(Salmonella)作為一種食源性致病菌，給人類健康帶來(lái)了巨大的威脅。據(jù)報(bào)道，全球每年大約有9 380萬(wàn)例的沙門(mén)氏菌感染事件，并導(dǎo)致15.5萬(wàn)的感染者死亡[1]。近年來(lái)，由于抗生素的不規(guī)則使用以及耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，致使沙門(mén)氏菌的耐藥問(wèn)題層出不窮，沙門(mén)氏菌的耐藥性也引起了世界的關(guān)注。AMNA等[2]研究表明在巴基斯坦臨床分離的傷寒血清型沙門(mén)氏菌中，有58.7%沙門(mén)氏菌呈多重耐藥性；在印度加爾各答臨床分離的沙門(mén)氏菌中，耐藥性檢出率高達(dá)71.4%[3]；GETACHEW[4]研究顯示從埃塞俄比亞牛、羊、豬等動(dòng)物體內(nèi)分離出的沙門(mén)氏菌超過(guò)75%呈現(xiàn)耐藥性；在美國(guó)進(jìn)口香料中檢測(cè)到的沙門(mén)氏菌,大約有55.6%呈現(xiàn)多重耐藥性[5]；張?jiān)龇宓萚6]研究結(jié)果顯示，從廣東省的超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)零售的整雞樣品中分離出的沙門(mén)氏菌，對(duì)萘啶酮酸的耐藥率為71.06%。

因此，控制食源性沙門(mén)氏菌的耐藥性迫在眉睫。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于沙門(mén)氏菌的耐藥機(jī)制研究較多，但缺乏對(duì)食源性沙門(mén)氏菌的耐藥機(jī)制和耐藥性檢測(cè)方法系統(tǒng)性的分析與總結(jié)。本文以此為出發(fā)點(diǎn)，概述了食源性沙門(mén)氏菌的耐藥機(jī)制以及耐藥性檢測(cè)方法，期望對(duì)后續(xù)的研究提供一定的理論和實(shí)踐依據(jù)。

1　沙門(mén)氏菌概述

1.1生物學(xué)特性

沙門(mén)氏菌是一種革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科，無(wú)芽孢和菌膜，大多數(shù)有鞭毛，可以運(yùn)動(dòng)，它在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，需氧或兼性厭氧；除雞沙門(mén)氏菌和傷寒沙門(mén)氏菌發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、山梨醇和甘露醇不產(chǎn)氣外，其余都可以產(chǎn)氣；其抗原復(fù)雜，一般的沙門(mén)氏菌具有菌體抗原、表面抗原和鞭毛抗原3種抗原，它的菌屬種類繁多，可以感染豬、牛、羊等多種動(dòng)物?，F(xiàn)在已經(jīng)確認(rèn)的沙門(mén)氏菌血清型超過(guò)2 500個(gè)，且基本上都屬于腸道沙門(mén)氏菌和邦戈?duì)柹抽T(mén)氏菌這兩種[7-8]。

1.2致病機(jī)理

沙門(mén)氏菌作為一種食源性致病菌，經(jīng)口腔進(jìn)入到人體以后，在腸道內(nèi)進(jìn)行大量繁殖，后經(jīng)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入到血液，即感染過(guò)程。隨后，沙門(mén)氏菌由于在腸道和血液中受到機(jī)體免疫系統(tǒng)的抵抗而破裂，釋放出大量的內(nèi)毒素，致使人體中毒，出現(xiàn)中毒癥狀。根據(jù)感染菌體的不同，可引起傷寒、敗血癥和慢性腸炎等疾病[9]。

1.3耐藥現(xiàn)狀

人類在治療由沙門(mén)氏菌引起的疾病時(shí)，最初由于抗生素的不合理使用，致使沙門(mén)氏菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)、耐藥譜也越來(lái)越寬。BRIAN等[10]通過(guò)對(duì)DT104和DT193兩種類型鼠傷寒沙門(mén)氏菌的研究得出，它們對(duì)四環(huán)素都有耐藥性。AQSA等[11]證實(shí)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌內(nèi)部的特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白STY4874對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星以及卡那霉素等十種抗生素都有耐藥性。在印度北部的家禽養(yǎng)殖環(huán)境中分離出的沙門(mén)氏菌，對(duì)克林霉素、苯唑西林以及青霉素都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗性[12]。由此可見(jiàn)，沙門(mén)氏菌的耐藥現(xiàn)狀不容樂(lè)觀，需要我們采取積極的措施對(duì)其進(jìn)行控制，從而更好地確保人類健康。

2　食源性沙門(mén)氏菌的耐藥機(jī)制

2.1基因突變機(jī)制

該機(jī)制是由于編碼沙門(mén)氏菌某些成分的基因發(fā)生突變而使其產(chǎn)生耐藥性。主要包括3種類型：(1)由抗生素靶標(biāo)基因突變而引起的耐藥性。原理是沙門(mén)氏菌由于基因突變而改變了抗生素的作用靶位，使抗菌藥物不能發(fā)揮其作用，從而使沙門(mén)氏菌產(chǎn)生耐藥性。(2)由基因修復(fù)系統(tǒng)突變而引起的耐藥性。原理是甲基錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)主要是由mutD、mutH、mutL和uvrS基因組成，它們聯(lián)合作用不僅可以阻止外源抗性DNA的插入，而且也可以控制自身基因的突變。當(dāng)此修復(fù)系統(tǒng)發(fā)生基因突變時(shí)，它在DNA復(fù)制過(guò)程中的修復(fù)功能就會(huì)發(fā)生異常，致使外源抗性DNA的插入，從而使沙門(mén)氏菌產(chǎn)生耐藥性。(3)由操縱基因突變而引起的耐藥性。原理是當(dāng)沙門(mén)氏菌的吸收和外排泵系統(tǒng)的操縱基因發(fā)生突變時(shí)，將導(dǎo)致沙門(mén)氏菌的外排泵基因超量表達(dá)，使其產(chǎn)生耐藥性[13-14]。

當(dāng)沙門(mén)氏菌中編碼解旋酶的基因gyrA、gyrB或拓樸異構(gòu)酶parC、parE亞基中的氨基酸發(fā)生突變時(shí)，它對(duì)氟喹諾酮類抗生素的耐藥性就會(huì)發(fā)生改變[15]。COPRA等[16]研究證明，當(dāng)基因修復(fù)系統(tǒng)發(fā)生基因突變時(shí)，沙門(mén)氏菌對(duì)抗生素的敏感性就會(huì)發(fā)生變化。因此，沙門(mén)氏菌的基因突變對(duì)其耐藥性的產(chǎn)生有著重大影響。

2.2鈍化酶和滅活酶機(jī)制

食源性沙門(mén)氏菌對(duì)氨基糖苷類抗生素的主要耐藥機(jī)制就是產(chǎn)生了鈍化酶。其原理是經(jīng)過(guò)酶修飾后，抗生素的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致它的羥基和氨基不能與核糖體緊密結(jié)合，因此抗生素就不能繼續(xù)發(fā)揮它的抗菌作用,致使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[17]。常見(jiàn)的鈍化酶有磷酸轉(zhuǎn)移酶[18]、核苷轉(zhuǎn)移酶[19]、乙酰轉(zhuǎn)移酶[20]。沙門(mén)氏菌也可以產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，使β-內(nèi)酰胺類抗生素發(fā)生水解，失去藥性。另外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，沙門(mén)氏菌也可以產(chǎn)生紅霉素酯化酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶等滅活酶，使自身產(chǎn)生耐藥性[13]。

2.3外排泵機(jī)制

外排泵是一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，存在于細(xì)胞膜中，它可以降低菌體內(nèi)抗生素的有效濃度，致使細(xì)菌的耐藥性增加。LUNN等[20]研究證實(shí),當(dāng)有外排泵抑制劑苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺存在時(shí)，細(xì)菌對(duì)萘啶酸的敏感度明顯提高。根據(jù)CHEN等[21]的研究結(jié)果表明，acrAB-tolC外排泵系統(tǒng)與沙門(mén)氏菌的耐藥性有關(guān)。當(dāng)然，在沙門(mén)氏菌體內(nèi)或許還存在其它新的外排泵系統(tǒng)沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)[22]，需要我們繼續(xù)深入探討，解開(kāi)最終的謎團(tuán)。

2.4耐藥性基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制

與食源性沙門(mén)氏菌耐藥性有關(guān)的基因如表1[23-27]所示，當(dāng)這些抗性基因嵌入到包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、基因島等基因元件中時(shí)，它們就可以伴隨著這些基因元件通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)行傳播擴(kuò)散，從而導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)[28-29]。當(dāng)然，沙門(mén)氏菌也可以接受外來(lái)的抗性基因，提高自身的抗藥能力。ANTONIO等[23]研究證明了鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)磺胺甲惡唑的耐藥性與其含有sul2抗性基因有關(guān)。BENOIT等[26]也證實(shí)了沙門(mén)氏菌的多重耐藥性與其基因島中含有多種抗生素抗性基因相關(guān)。

表1　與食源性沙門(mén)氏菌耐藥性相關(guān)的基因

3　食源性沙門(mén)氏菌藥敏性的檢測(cè)方法

3.1肉湯稀釋法

肉湯稀釋法可以分為2種，即微量肉湯稀釋法和宏量肉湯稀釋法。它們的原理都是對(duì)一定濃度的抗菌藥物和含有待試菌的培養(yǎng)液進(jìn)行一系列稀釋，在適宜條件下培養(yǎng)之后，肉眼判斷培養(yǎng)液的濁度，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)器中所含的藥物的最低濃度就是最低抑菌濃度(其值越小，表明被試菌對(duì)此種抗菌藥物越敏感，反之，則表示受試菌對(duì)此種抗菌藥物的耐藥性越強(qiáng))。再將所有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)器中的培養(yǎng)液移接于適合被試菌生長(zhǎng)并且不含有任何抗菌藥物的瓊脂平板上，培養(yǎng)1夜后，觀察菌落生長(zhǎng)情況，其中，在沒(méi)有任何被試菌菌落生長(zhǎng)的瓊脂平板中，所含的最低藥物濃度就是最低殺菌濃度[30]。JOY等[31]用肉湯稀釋法檢測(cè)了從小牛身上分離的沙門(mén)氏菌的藥敏性，結(jié)果有80%的菌株對(duì)四環(huán)素和卡那霉素具有耐藥性；WU等[32]也用肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法測(cè)定了沙門(mén)氏菌對(duì)抗生素的藥敏性，并對(duì)這兩種方法作了簡(jiǎn)單的比較。

3.2瓊脂稀釋法

瓊脂稀釋法是通過(guò)測(cè)量最低抑菌濃度來(lái)判定被試菌的耐藥性，它被稱為藥敏測(cè)定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。該法的原理是將被試菌接種在含有不同濃度抗菌藥物的瓊脂平板物上，隨后在適宜條件下培養(yǎng)，觀察被試菌的生長(zhǎng)情況，被試菌不能生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為最低抑菌濃度[33]。LURDES等[34]用瓊脂稀釋法測(cè)定了葡萄牙地區(qū)從肉雞和飼養(yǎng)員身上分離的沙門(mén)氏菌的藥敏性；GORDANA等[35]則用瓊脂稀釋法測(cè)定了塞爾維亞地區(qū)臨床分離的沙門(mén)氏菌的耐藥性，都取得了很好的效果。

3.3紙片擴(kuò)散法

紙片擴(kuò)散法是一種使用較為廣泛的測(cè)定方法，此法的原理是將浸有抗菌藥物的紙片敷貼在涂有被試菌的瓊脂平板上，由于抗菌藥物會(huì)在瓊脂平板上進(jìn)行擴(kuò)散，因此其在瓊脂平板上的濃度也會(huì)呈現(xiàn)梯度遞減之態(tài)，則在紙片周圍一定距離內(nèi)的被試菌就會(huì)受到抑制，經(jīng)過(guò)一定條件下的培養(yǎng)后，在瓊脂板上會(huì)形成一個(gè)抑菌圈，根據(jù)抑菌圈直徑的大小就可判斷被試菌對(duì)此種抗菌藥物的藥敏性[36-37]。抑菌圈直徑越大，表明被試菌對(duì)此種抗菌藥物越敏感，反之，則表示受試菌對(duì)此種抗菌藥物的耐藥性就越強(qiáng)。HAIR等[38]用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定了從尼泊爾地區(qū)傷寒患者身上分離的沙門(mén)氏菌的藥敏性;DIANA等[39]通過(guò)用紙片擴(kuò)散法測(cè)定了沙門(mén)氏菌的多重耐藥性,研究了殺菌劑濃度對(duì)其耐藥性的影響，取得了理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.4E-test實(shí)驗(yàn)法

E-test實(shí)驗(yàn)法是在稀釋法與擴(kuò)散法這兩種實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)山建立的一種新型的細(xì)菌藥敏性檢測(cè)方法。E-test實(shí)驗(yàn)法所用的試紙條的長(zhǎng)為50mm、寬為5mm，它的內(nèi)部含有一系列預(yù)先制備好的抗菌藥物，并且抗菌藥物的濃度呈現(xiàn)連續(xù)指數(shù)遞增狀態(tài)。將E-test試紙條敷貼在接種有被試菌的瓊脂平板上，在適宜條件下培養(yǎng)一整夜之后，瓊脂平板上會(huì)出現(xiàn)呈橢圓形的抑菌圈，其抑菌圈的邊緣就會(huì)與試紙條交于一點(diǎn)，此點(diǎn)的刻度所標(biāo)示的濃度就是被試菌對(duì)此類抗菌藥物的最低抑菌濃度[40]。VINCENT等[41]用E-test方法研究了科威特地區(qū)沙門(mén)氏菌對(duì)環(huán)丙沙星的藥敏性；NOBTHAI等[42]用此種方法測(cè)定了沙門(mén)氏菌對(duì)頭孢曲松鈉、環(huán)丙沙星和氧氟沙星的藥敏性，確定了沙門(mén)氏菌的多重耐藥性。

3.5全自動(dòng)微生物分析儀測(cè)定法

全自動(dòng)微生物分析儀測(cè)定法是一種快速有效的藥敏性檢測(cè)方法，常用的藥敏性檢測(cè)儀器有VITEK、Sensititre ARIS、MicroScan、ATB等。以VITEK 2 Compact 為例，它的工作原理是采用比濁法，每隔15 min以660 nm的波長(zhǎng)檢測(cè)藥敏測(cè)定版反應(yīng)孔的透光度，通過(guò)對(duì)被試菌在含和不含抗菌藥物培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析，最終得到藥敏試驗(yàn)結(jié)果[43]。它還可以通過(guò)在藥敏檢測(cè)及綜合分析中篩選紅霉素誘導(dǎo)克林霉耐藥 、MRSA、ESBLs等多種耐藥表型，并對(duì)多種耐藥表型機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估與推斷，提示其耐藥模式[44]。ERIKA等[45]用MicroScan方法測(cè)定了柬埔寨人血液中沙門(mén)氏菌對(duì)環(huán)丙沙星和阿奇霉素的耐藥性。ABRO等[46]用VITEK 2微生物全自動(dòng)分析系統(tǒng)測(cè)定了沙門(mén)氏菌的藥敏性，分析了迪拜地區(qū)沙門(mén)氏菌的耐藥情況。

食源性沙門(mén)氏菌耐藥性的常規(guī)檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)如表2[47-49]所示。當(dāng)然，還有一些效果較好的檢測(cè)方法，如試卡法、mPCR[50]法等，其中mPCR法是一種基于微生物菌樣中抗性基因的分子檢測(cè)方法，具有快速、高效等特點(diǎn)[51]。正是因?yàn)檫@些先進(jìn)檢測(cè)方法的存在，才為控制食源性沙門(mén)氏菌的耐藥性、評(píng)價(jià)抗生素的使用現(xiàn)狀以及研究抗性基因在種屬之間的轉(zhuǎn)移等科研領(lǐng)域提供了技術(shù)保障。

表2　食源性沙門(mén)氏菌耐藥性的常規(guī)檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)

4　展望

食品安全問(wèn)題將會(huì)隨著社會(huì)的發(fā)展越來(lái)越被人類所關(guān)注，食源性沙門(mén)氏菌作為主要危害因素之一，其耐藥性必須得到有效的控制才能更好的確保人類的健康。因此，我們不僅需要嚴(yán)格的控制抗生素的使用，從源頭上控制其耐藥性的產(chǎn)生，更需要深入研究消除其耐藥性的方法。這就要求我們更加深入地了解其耐藥機(jī)制和探索更加科學(xué)有效的檢測(cè)方法，確保人類安全。

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Research progress on the mechanism of drug resistance of foodborneSalmonellaand test methods for its susceptibility

LI Shao-bo,HE Zhi-fei,LI Hong-jun*,REN Can

(College of Food Science,Southwest University, Chongqing 400715, China)

As one of the most common foodborne pathogens,Salmonellaposed a threat to human’s health badly. In recent years, the drug resistance ofSalmonellagradually increased due to the abuse of drugs. In this paper, the mechanisms of drug resistance ofSalmonellawere summarized and methods for detection of drug susceptibility were analyzed. It would provide a theoretical basis for control of drug resistance of foodborneSalmonella, evaluation of the use of antibiotics, transfer of resistance genes between species.

Salmonella；mechanism;methods of drug resistance detection

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609043

碩士研究生(李洪軍教授為通訊作者,E-mail:983362225@qq.com)。

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(兔)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-44-D-1)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303144)

2016-03-02, 改回日期：2016-04-01