姜建湖　陳建明　沈斌乾　潘　茜　孫麗慧　黃愛霞

(浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州313001)

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草魚幼魚對飼料中核黃素的需要量

姜建湖陳建明*沈斌乾潘茜孫麗慧黃愛霞

(浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州313001)

配制核黃素含量分別為0.54、2.32、4.08、5.78、9.28和19.35 mg/kg的6種純化飼料，投喂初始均重為(11.21±0.16) g的草魚幼魚8周，通過研究核黃素對其生長性能、肝胰臟中D-氨基酸氧化酶(D-AAO)與腸道中消化酶活力及體成分的影響，以確定草魚幼魚對飼料中核黃素的需要量。每種飼料設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)放養(yǎng)20尾魚。結(jié)果表明：0.54和2.32 mg/kg組草魚幼魚的成活率顯著低于其他各組(P<0.05)；隨著飼料中核黃素含量的增加，草魚幼魚的增重率、特定生長率、飼料效率、肝胰臟中D-AAO及腸道中消化酶活力均先升高后趨于穩(wěn)定，當(dāng)飼料中核黃素含量為5.78 mg/kg時，以上指標(biāo)均達(dá)到最大值；5.78 mg/kg組的肝體比顯著高于0.54 mg/kg組(P<0.05)，但飼料中核黃素含量對臟體比、肥滿度及全魚的水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量無顯著影響(P>0.05)。折線模型回歸分析表明，草魚幼魚獲得最佳生長時對飼料中核黃素的需要量為5.54 mg/kg；肝胰臟中D-AAO活力達(dá)到最佳時對飼料中核黃素的需要量為5.99 mg/kg。

草魚；核黃素；需要量；生長；D-氨基酸氧化酶

核黃素(即維生素B2)是動物必需的一種水溶性維生素，在體內(nèi)以黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的組分形式存在。而FMN和FAD是體內(nèi)許多氧化還原酶(如黃素蛋白酶)的輔基，廣泛參與體內(nèi)各種氧化還原反應(yīng)，起到遞氫的作用。因此，核黃素能促進(jìn)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝，對維持皮膚、黏膜和視覺的正常機(jī)能均有一定作用。當(dāng)飼料中核黃素供應(yīng)不足時，魚體會出現(xiàn)缺乏癥。魚類缺乏核黃素后的癥狀不盡相同，僅有的共同癥狀為生長不良和厭食，其他的一些缺乏癥狀為特定研究對象所特有，包括高死亡率、游泳不協(xié)調(diào)、畏光、白內(nèi)障、觸鰭、短體和皮膚顏色變黑等[1]。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)飼料

本試驗(yàn)以無維生素酪蛋白和明膠為蛋白質(zhì)源，魚油及玉米油為脂肪源，糊精為糖源配制成基礎(chǔ)飼料(表1)。在每千克基礎(chǔ)飼料中分別添加0、2、4、6、10和20 mg的核黃素(Sigma，美國)，共配制6種等氮等能的純化飼料。經(jīng)高效液相色譜法[15]實(shí)測飼料中核黃素含量分別為0.54、2.32、4.08、5.78、9.28和19.35 mg/kg。試驗(yàn)飼料制作時，先將原料充分粉碎，全部能通過60目篩，再按配方比例配制，用攪拌機(jī)充分混勻，加適量水，用絞肉機(jī)擠壓成徑粒為1.2 mm的長條，在常溫下風(fēng)干，最后再制成粒徑為0.5～1.2 mm的顆粒料，置-20 ℃冰柜中備用。

1.2飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在室內(nèi)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。試驗(yàn)用魚為自行培育的苗種，先用基礎(chǔ)飼料(不添加核黃素)馴養(yǎng)2周后再挑選體格健壯、大小均勻、初始均重為(11.21±0.16) g的草魚幼魚360尾，隨機(jī)放養(yǎng)到18個圓柱形玻璃鋼水槽中，每只水槽放魚20尾，內(nèi)盛水200 L，每種試驗(yàn)飼料飼喂3個水槽，試驗(yàn)期為8周。早(09:00)、晚(15:00)各投喂1次，日投喂量為魚體重的4%～6%，視攝食和幼魚生長情況作適當(dāng)調(diào)整。整個飼養(yǎng)期間采用流水養(yǎng)殖，每個水槽水流量約為1.0 L/min，水溫25～30 ℃，pH 7.3～7.6，溶解氧濃度6.2～7.4 mg/L，氨氮濃度0.05～0.10 mg/L，亞硝酸鹽氮濃度0.02～0.07 mg/L。

1.3樣品采集及分析

試驗(yàn)結(jié)束后停喂24 h，然后稱量各水槽內(nèi)的魚總重和記錄剩余尾數(shù)，并從各水槽內(nèi)隨機(jī)取5尾用于全魚營養(yǎng)成分分析。剩余魚逐一測量體長和體重后，置冰盤上解剖取其內(nèi)臟、肝胰臟及全腸，用于計(jì)算臟體比、肝體比及肥滿度等指標(biāo)；保留肝胰臟及全腸樣品，剔除脂肪和腸道內(nèi)容物，置-70 ℃冰箱中保存，用于測定肝胰臟中D-AAO及全腸中消化酶活力。

試驗(yàn)飼料和全魚營養(yǎng)成分測定參照AOAC(1984)[16]的方法進(jìn)行：105 ℃常壓干燥法測定水分含量；凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量；用無水乙醚為溶劑，索氏抽提法測定粗脂肪含量；箱式電阻爐550 ℃灼燒法測定粗灰分含量。

表1　基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)每千克維生素預(yù)混料含有One kilogram of vitamin premix contained the following：VA 0.80 g，VD30.06 g，VE 4.00 g，VK38.00 g，包膜維生素C coated VC 20.00 g，硫胺素 thiamin 2.00 g，泛酸 pantothenic acid 6.00 g，吡哆醇 pyridoxine 2.00 g，葉酸 folic acid 0.50 g，尼克酸 niacin 15.00 g，VB120.02 g，肌醇 inositol 40.00 g，微晶纖維素 microcrystalline cellulose 901.62 g。

2)每千克礦物質(zhì)預(yù)混料含有One kilogram of mineral premix contained the following：FeSO4·7H2O 15 g，CuSO4·H2O 0.3 g，ZnSO4·7H2O 10 g，MnSO4·H2O 0.5 g，NaCl 30 g，MgSO440 g，Ca(H2PO4)2400 g，KI 0.05 g，Na2SeO30.005 g，CoCl2·6H2O 0.5 g，沸石粉 zeolite powder 503.645 g。

解凍肝胰臟和全腸，用濾紙吸干水分后稱重，加入10倍的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，用玻璃勻漿器在冰浴中手工勻漿。隨后在4 ℃下10 000 r/min離心10 min，獲得的上清液即為粗酶液，置于4 ℃冰箱中待用。D-AAO活力參照Nagata等[17]的酮酸法測定，定義為：在pH 8.3、37 ℃條件下，每克組織蛋白質(zhì)中每分鐘生成1 μmol的丙酮酸為1個活力單位(U)，以U/g prot表示。蛋白酶活力采用福林試劑法[18]測定，定義為：在pH 7.5、37 ℃條件下，每分鐘酶解酪蛋白生成1 μg酪氨酸為1個活力單位(U)，以U/mg prot表示。淀粉酶活力采用Bernfeld法[19]測定，定義為：在pH 6.9、25 ℃條件下，每分鐘酶解可溶性淀粉生成1 μmol麥芽糖為1個活力單位(U)，以U/mg prot表示。脂肪酶活力采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定，定義為：在37 ℃條件下，每分鐘酶解1 μmol底物為1個活力單位(U)，以U/g prot表示。粗酶液中蛋白質(zhì)濃度的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[20]，以牛血清白蛋白為基準(zhǔn)物。

1.4計(jì)算公式

增重率(weight gain ratio，WGR，%)=

100×(終末均重-初始均重)/初始均重；

特定生長率(specific growth rate，SGR，%/d)=

100×(ln終末均重-ln初始均重)/試驗(yàn)天數(shù)；

成活率(survival rate，SR，%)=

100×終末魚尾數(shù)/初始魚尾數(shù)；

飼料效率(feed efficiency rate，F(xiàn)ER)=

(終末魚總重+死魚總重-初始魚總重)/總投喂量；

臟體比(viscerasomatic index，VSI，%)=

100×內(nèi)臟重/體重；

肝體比(hepatosomatic index，HSI，%)=

100×肝胰臟重/體重；

肥滿度(condition factor，CF，g/cm3)=

100×體重/體長3。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若差異顯著再采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。以增重率及肝胰臟中D-AAO活力為評價指標(biāo)進(jìn)行折線回歸模型分析，確定草魚幼魚對飼料中核黃素的需要量。

2　結(jié)果與分析

2.1飼料中核黃素含量對草魚幼魚生長性能、飼料效率及形體指標(biāo)的影響

投喂核黃素含量為0.54和2.32 mg/kg飼料

的草魚幼魚，在養(yǎng)殖中后期出現(xiàn)游泳失調(diào)、不正常抽搐，繼而死亡，且攝食差、生長相對緩慢。由表2可知，隨著飼料中核黃素含量的升高，草魚幼魚的成活率先顯著升高(P<0.05)，后趨于穩(wěn)定(P>0.05)。增重率、特定生長率及飼料效率均隨著飼料中核黃素含量的增加而呈現(xiàn)出先升高后穩(wěn)定的趨勢，且當(dāng)飼料中核黃素含量為5.78 mg/kg及以上時，以上指標(biāo)均無顯著變化(P>0.05)。以核黃素含量為5.78 mg/kg時肝體比最大，其值顯著高于0.54 mg/kg組(P<0.05)。飼料中核黃素含量對草魚幼魚的臟體比和肥滿度無顯著影響(P>0.05)。以增重率為評價指標(biāo)，應(yīng)用折線回歸模型分析得出草魚幼魚對飼料中核黃素的需要量為5.54 mg/kg(圖1)。

2.2飼料中核黃素含量對草魚幼魚肝胰臟中D-AAO及腸道中消化酶活力的影響

由表3可知，草魚幼魚肝胰臟中D-AAO與腸道中蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活力均隨飼料中核黃素含量的增加呈先升高后穩(wěn)定的趨勢，當(dāng)飼料中核黃素含量為5.78 mg/kg時，以上酶活指標(biāo)均達(dá)到最大值。以肝胰臟中D-AAO活力為評價指標(biāo)，應(yīng)用折線回歸模型分析得出草魚幼魚對飼料中核黃素的需要量為5.99 mg/kg(圖2)。

2.3飼料中核黃素含量對草魚幼魚體成分的影響

由表4可知，飼料中核黃素含量對草魚幼魚全魚水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪及粗灰分含量均無顯著影響(P>0.05)。

3　討　論

本試驗(yàn)中核黃素缺乏的草魚幼魚出現(xiàn)了厭食及生長相對緩慢的癥狀，這與已報(bào)道的大多數(shù)魚類研究結(jié)果[1]相一致，該結(jié)論進(jìn)一步證實(shí)了生長不良和厭食可能為魚類核黃素缺乏的典型癥狀。核黃素以FMN及FAD形式廣泛參與體內(nèi)各種氧化還原反應(yīng)，當(dāng)其缺乏時，會影響糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝，從而可能影響魚類的攝食和生長。在養(yǎng)殖中后期，草魚幼魚出現(xiàn)游泳失調(diào)、不正常抽搐，繼而引發(fā)死亡，類似癥狀曾在虹鱒[4]中有過報(bào)道，其他諸如畏光、白內(nèi)障、觸鰭、短體和皮膚顏色變黑等癥狀尚未在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，這可能與魚的種類、規(guī)格和試驗(yàn)條件的不同有關(guān)。

表2　飼料中核黃素含量對草魚幼魚生長性能、飼料效率及形體指標(biāo)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values with different letter superscripts in the same row mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖1　飼料中核黃素含量與草魚幼魚增重率的關(guān)系

表3　飼料中核黃素含量對草魚幼魚肝胰臟中D-AAO及腸道中消化酶活力的影響

圖2　飼料中核黃素含量與草魚幼魚肝胰臟中D-AAO活力的關(guān)系

D-AAO作為一種黃素蛋白酶，其活力已被很多研究者用于確定魚類核黃素的需要量[4-5,7,9-12]。

表4　飼料中核黃素含量對草魚幼魚體成分的影響

腸道在無胃魚的營養(yǎng)消化和吸收中扮演著重要角色，而其消化能力與消化酶活力密切相關(guān)[21]。草魚作為無胃魚，本試驗(yàn)特此研究了飼料核黃素含量對草魚幼魚腸道中蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活力的影響。截止目前，僅有Li等[22]在建鯉(Cyprinuscarpiovar. Jian)的研究中有相關(guān)報(bào)道，本試驗(yàn)研究結(jié)果基本與其一致，即隨著飼料中核黃素含量的增加，腸道中蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活力均先升高而后趨于穩(wěn)定。Li等[22]認(rèn)為這可能是核黃素含量增加導(dǎo)致魚體肝胰臟生長和發(fā)育的結(jié)果，因?yàn)閷τ诖蠖鄶?shù)魚類來說都不存在腺窩，其消化酶均產(chǎn)自于肝胰臟，故而消化酶活力與肝胰臟的生長和發(fā)育是密切相關(guān)的，本試驗(yàn)中草魚幼魚肝體比隨飼料中核黃素含量的增加先升高后趨于穩(wěn)定也印證了此點(diǎn)。水產(chǎn)動物對食物的消化主要是依賴消化酶的催化分解作用，因而消化酶活力直接影響到飼料的轉(zhuǎn)化效率，進(jìn)而影響魚體的生長[23]。本試驗(yàn)中草魚幼魚腸道中3種消化酶的活力變化趨勢與生長趨勢基本一致，這可能是飼料核黃素含量對消化酶產(chǎn)生影響后間接影響到了草魚幼魚的生長。

4　結(jié)　論

在本試驗(yàn)條件下，飼料中核黃素含量可以提高草魚幼魚的生長性能，改善飼料利用效率，其獲得最佳生長時對飼料中核黃素的需要量為5.54 mg/kg，而以肝胰臟中D-AAO活力為評價指標(biāo)時，其對飼料中核黃素的需要量為5.99 mg/kg。

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*Corresponding author, professorate senior engineer, E-mail: aqua_labjm@163.com

(責(zé)任編輯菅景穎)

Dietary Riboflavin Requirement of Juvenile Grass Carp (Ctenopharyngodonidellus)

JIANG JianhuCHEN Jianming*SHEN BinqianPAN QianSUN LihuiHUANG Aixia

(Agriculture Ministry Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture, Key Laboratory of Fish Health and Nutrition of Zhejiang Province, Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, China)

A feeding trial was carried out to estimate the dietary riboflavin requirement of juvenile grass carp (Ctenopharyngodonidellus) based on growth performance, hepatopancreasD-amino acid oxidase (D-AAO) and intestinal digestive enzyme activities and body composition. Six purified diets were formulated to contain 0.56, 2.32, 4.08, 5.78, 9.28 and 19.35 mg/kg riboflavin, respectively. Juvenile grass carp with an average initial body weight of (11.21±0.16) g were fed the diets for 8 weeks, and each diet had 3 replicates with 20 fish per replicate. The results showed as follows: survival rate in 0.56 and 2.32 mg/kg groups was significantly lower than that in other groups (P<0.05). Weight gain rate (WGR), specific growth rate (SGR), feed efficiency rate (FER), hepatopancreasD-AAO and intestinal digestive enzyme activities of fish were firstly increased and then seemed to stabilize with increasing dietary riboflavin content, and the biggest values of them appeared when dietary riboflavin content was 5.78 mg/kg. Hepatosomatic index (HSI) in 5.78 mg/kg group was significantly higher than that in 0.54 mg/kg group (P<0.05). Viscerasomatic index (VSI), condition factor (CF) and the contents of whole body moisture, crude protein, crude lipid and ash were not significantly affected by dietary riboflavin content (P>0.05). Broken line regression analysis shows that dietary riboflavin requirement of juvenile grass carp with the best growth and hepatopancreasD-AAO activity is 5.54 and 5.99 mg/kg, respectively.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(9)：2771-2777]

grass carp (Ctenopharyngodonidellus); riboflavin; requirement; growth;D-amino acid oxidase

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.09.015

2016-03-18

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(CARS-46-21)

姜建湖(1986—)，男，浙江建德人，工程師，碩士，從事水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料研究。E-mail： realjiangjianhu@126.com

陳建明，教授級高級工程師，E-mail： aqua_labjm@163.com

S963

A

1006-267X(2016)09-2771-07