喻時(shí)周楊成龍郭建春段瑞軍

1貴州省油菜研究所， 貴州貴陽(yáng)550008；2貴州省亞熱帶作物研究所， 貴州興義 562400；3中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 /農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南?？?571101；4貴州禾睦福種子有限公司， 貴州貴陽(yáng) 550008

研究簡(jiǎn)報(bào)

海馬齒甜菜堿醛脫氫酶基因克隆、高效表達(dá)及酶學(xué)特性分析

喻時(shí)周1，4楊成龍2，*郭建春3段瑞軍3

1貴州省油菜研究所， 貴州貴陽(yáng)550008；2貴州省亞熱帶作物研究所， 貴州興義 562400；3中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 /農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南?？?571101；4貴州禾睦福種子有限公司， 貴州貴陽(yáng) 550008

在許多滲透調(diào)節(jié)劑中， 甜菜堿是最理想的有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。甜菜堿在植物體內(nèi)大量積累不會(huì)帶來(lái)危害，同時(shí)能提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗性。將海馬齒中克隆到的甜菜堿醛脫氫酶基因構(gòu)建到表達(dá)載體pET-28a（+）上， 獲得重組載體pET-SpBADH并將其成功地轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中得到重組工程菌， 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)能高效表達(dá)55 kD目的蛋白， 表達(dá)量可以達(dá)到301 μg mL-1。酶學(xué)特征分析表明， 該蛋白最適pH值為7.2， 在偏堿條件下能維持較高的催化活性； SpBADH蛋白對(duì)高溫敏感， 且溫度對(duì)催化活性影響較大， 超過(guò) 55℃時(shí)酶活性只有 20%， 最適酶催化活性溫度為 37℃； 而有機(jī)小分子醇類對(duì)酶的催化活性有保護(hù)作用， 可以通過(guò)自身特征維持酶催化活性的微環(huán)境。

海馬齒； 甜菜堿醛脫氫酶； 原核表達(dá)； 酶活測(cè)定

低溫、高溫、高鹽和干旱等環(huán)境脅迫是限制植物生長(zhǎng)和分布的主要因素之一。植物在應(yīng)答環(huán)境脅迫時(shí)， 甜菜堿是無(wú)毒害快速增加的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。同時(shí)在細(xì)菌、真細(xì)菌和動(dòng)植物中， 甜菜堿是許多組織生理缺水時(shí)的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)［1-3］。在植物體內(nèi)， 甜菜堿以膽堿為底物， 經(jīng)兩步催化合成， 即乙酰膽堿→甘氨酸甜菜堿醛→甘氨酸甜菜堿， 其中甜菜堿醛在甜菜堿醛脫氫酶（betaine aldehyde dehydrogenase， BADHase） 的作用下氧化生成甜菜堿。甘氨酸甜菜堿（GB）作為季胺堿， 是植物的一種重要的滲透保護(hù)劑， 不僅在植物受到環(huán)境脅迫時(shí)積累于細(xì)胞內(nèi)以降低滲透勢(shì)， 還能對(duì)有氧呼吸、能量代謝過(guò)程和光呼吸生理功能具有良好保護(hù)和促進(jìn)作用［4-6］。

海馬齒（Sesuvium portulacastrum L.）是一種真鹽生紅樹(shù)林植物， 該屬共有8個(gè)種， 中國(guó)只有1個(gè)種， 多生長(zhǎng)于熱帶和亞熱帶海岸。海馬齒具有很強(qiáng)的生命力， 逆境生活能力非常強(qiáng)； 具有耐鹽， 耐旱和抗重金屬等作用， 且在淡水和海水澆灌下均能完成其生活史［7-8］。本文系統(tǒng)研究了甜菜堿脫氫酶基因的表達(dá)特性、酶的生物學(xué)特性， 以期了解 SpBADH基因的功能以及在海馬齒抗鹽過(guò)程中作用機(jī)理， 為培育理想的耐鹽植物新品系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海馬齒采自海南省?？谑邪咨抽T(mén)濱海， pMD18-T Vector （貨號(hào)為 D101A）購(gòu)自寶生物公司； 表達(dá)載體pET-28a（+）、大腸桿菌DH5α菌株及大腸桿菌BL21（DE3）plys由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 工具酶及主要試劑

DNA Marker和蛋白質(zhì)Marker、小量質(zhì)粒提取試劑盒、T4 DNA連接酶、BamH I和Sal I限制性內(nèi)切酶購(gòu)自上海生工生物工程有限公司； DNA回收試劑盒購(gòu)自申能博彩有限公司； IPTG、丙烯酰胺（Acr）及甲叉雙丙烯酰胺（Bis）和 Ni-NTA-Sefinose Colum 蛋白純化試劑盒購(gòu)自BioBasic公司。四甲基乙二胺（TEMED）購(gòu)自Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 重組載體pET-SpBADH的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)海馬齒甜菜堿醛脫氫酶全長(zhǎng)基因 SpBADH的cDNA序列（GenBank登錄號(hào)為 JN192464）， 設(shè)計(jì)擴(kuò)增SpBADH 開(kāi)放閱讀框引物。上游引物為 5′-ATC GGATCC ATGGCGTTCCCTATACCT-3′， 引入BamH I酶切位點(diǎn)（下畫(huà)線部分）， 下游引物為 5′-ATCGTCGAC TCAAGGAGACTTGTAC-3′， 引入Sal I酶切位點(diǎn)（下畫(huà)線部分）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。以海馬齒 cDNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增， PCR體系（50 μL）含：5×Prime STAR緩沖液（Mg2+plus） 10 μL、2.5 mmol L-1dNTPs 3 μL、引物各 2 μL、模板 2 μL、2.5 U mL-1PrimeSTAR HS DNA聚合酶1 μL、ddH2O 30 μL。PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min； 94℃變性45 s， 60℃退火45 s， 72℃延伸l.5 min， 35個(gè)循環(huán)： 72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析， 其大小與預(yù)期一致。將目的片段切膠回收， 加尾連接pMD18-T Vector， 送上海生工生物工程有限公司測(cè)序， 陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒， 將 pMD18-SpBADH和pET-28a（+）質(zhì)粒分別用BamH I和Sal I雙酶切，目的片段切膠回收， 回收產(chǎn)物以摩爾比 3∶1混合， 然后加入 T4 DNA連接酶， 16℃下連接過(guò)夜， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞， 在含有Amp抗性的平板上培養(yǎng)， 挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR及BamH I和Sal I雙酶切初步鑒定， 鑒定正確后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.4 重組SpBADH基因工程菌的構(gòu)建及目的基因的表達(dá)

將已經(jīng)鑒定的重組表達(dá)載體 pET-SpBADH轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21（DE3）plys， 篩選陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆活化過(guò)夜后， 以1∶100濃度加到液體LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)， 使OD600為0.6左右， 加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)， 取菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 重組SpBADH基因工程菌誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

1.5.1 菌株最佳誘導(dǎo)起始生長(zhǎng)量的確定 工程菌分別培養(yǎng)至OD值為0.1、0.2、0.5、0.6、0.8、1.0和1.2時(shí)向培養(yǎng)液中添加最佳濃度的IPTG， 37℃下誘導(dǎo)6 h， 取菌液作SDS-PAGE分析。

1.5.2 最適IPTG濃度的確定 在重組菌株生長(zhǎng)至OD 為0.6時(shí)， 分別向6個(gè)搖瓶中加入不同量的IPTG， 使其終濃度分別為0.1、0.2、0.5、0.6、0.8和1.0 mmol L-1， 37℃下誘導(dǎo)6 h， 取菌液作SDS-PAGE分析。

1.5.3 最佳誘導(dǎo)溫度的確定 向處于最佳誘導(dǎo)起始生長(zhǎng)量的搖瓶中添加最適濃度的IPTG， 分別在28℃、30℃、33℃和37℃下誘導(dǎo)6 h， 取菌液作SDS-PAGE分析。

1.5.4 最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定 培養(yǎng)菌液至 OD=0.6時(shí)，向菌液中添加最適濃度的IPTG， 于誘導(dǎo)1、2、3、4、5、6、7和8 h后取菌液作SDS-PAGE分析。

1.6 重組SpBADH的純化

將大規(guī)模誘導(dǎo)的菌液于4℃， 6000 ×g離心10 min收集菌體， 用細(xì)胞破碎緩沖液（50 mmol L-1NaH2PO4、300 mmol L-1NaCl、10 mmol L-1咪唑， pH 8.0， 不含EDTA）洗2次， 加入破碎緩沖液重懸菌體后置冰上預(yù)冷， 以超聲波破碎菌體。待菌體完全破碎后以17 000 ×g離心30 min，上清液中的蛋白溶液含有可溶表達(dá)的重組SpBADH。再按照Ni-NTA-Sefinose Colum蛋白純化試劑盒說(shuō)明書(shū)純化重組 SpBADH， 將純化的重組SpBADH進(jìn)行SDS-PAGE，并測(cè)定重組SpBADH蛋白質(zhì)的濃度， 余下的緩沖液于4℃保存。

1.7 甜菜堿醛脫氫酶酶活的測(cè)定和酶活力的計(jì)算

參照羅笛等［9］所述略有修改， l mL反應(yīng)體系中， 取0.9 mL反應(yīng)緩沖液（50 mmol L-1HEPES， 0.5 mmol L-1NAD+，5 mmol L-1DTT， pH 9.5）， 加入0.05 mL純化蛋白溶液于紫外分光光度計(jì)比色杯中。反應(yīng)從加入0.05 mL甜菜堿醛（betaine aldehyde， BA） （0.5 mmol L-1）起， 以未加入甘氨酸甜菜堿醛的反應(yīng)液作對(duì)照， 25℃下反應(yīng) 15 min， 測(cè)定OD340。試驗(yàn)重復(fù)3次， 取平均值。

參照崔喜艷等［10］方法， 酶活力單位定義為 25℃下每分鐘轉(zhuǎn)化生成1 nmol NADH所需甜菜堿醛脫氫酶的量為一個(gè)活性單位（U）， 比活力為每毫克蛋白的活力數(shù)。比活力（nmol min-1mg-1）= ΔOD×10-3/ （εmax×C）×10-9。式中ΔOD為吸光值每分鐘增加的平均值； εmax為NADH OD340摩爾消光系數(shù)（6220）； C為測(cè)定時(shí)加入的蛋白酶量， 單位為mg；10-3為1 mL反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化為升的系數(shù)； 10-9為摩爾轉(zhuǎn)化為納摩爾的系數(shù)?？扇苄缘鞍缀恳?BSA為標(biāo)準(zhǔn)品， 按照Bradford法定量。

1.8 甜菜堿醛脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.8.1 最適pH值及pH值的穩(wěn)定性 配制pH 4.0～12.0的反應(yīng)緩沖液， 37℃下將酶液分別與不同pH值的緩沖液反應(yīng)， 測(cè) SpBADH在不同緩沖液中反應(yīng)時(shí)的酶活性， 確定酶反應(yīng)的最適pH值。

將反應(yīng)體系中的一定酶液加入不同 pH值的緩沖液中（不含有底物和輔酶）， 在 37℃溫浴 1 h， 測(cè)剩余的酶活力，觀察SpBADH在不同pH值下的穩(wěn)定性。

1.8.2 最適溫度和熱穩(wěn)定性 采用pH值為7.2的反應(yīng)體系， 分別在16～80℃下反應(yīng)10 min， 測(cè)定其酶活力， 觀察不同溫度下對(duì)酶促反應(yīng)的影響。將一定量的酶液置于以上不同溫度下1 h， 測(cè)定其剩余酶活力， 觀察SpBADH在不同溫度下的穩(wěn)定性。

1.8.3 不同醇類對(duì)酶活力的影響和熱穩(wěn)定性 選擇酶的最適溫度和pH值條件下， 在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為2%的乙二醇、丙二醇、丙三醇、甘露醇、山梨醇和聚乙二醇， 測(cè)定 SpBADH的活性， 以不加醇類的初始酶液的酶活力為對(duì)照， 測(cè)定不同醇類對(duì)酶促反應(yīng)的影響。

將酶液分別置于以上6種醇類中于42℃保溫1 h， 測(cè)定保溫后的剩余酶活力。觀察不同酶類對(duì) SpBADH穩(wěn)定性的影響。以初始酶液的活力為 100%， 以不加保護(hù)劑的酶液經(jīng)同樣熱處理為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 SpBADH的克隆與重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù) NCBI登錄的海馬齒甜菜堿醛脫氫酶基因（SpBADH）序列克隆出全長(zhǎng) cDNA， 將克隆到的序列測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI登錄序列相似性100%。將連有SpBADH基因片段的pMD18-SpBADH的質(zhì)粒和pET-28a（+）分別用BamH I和Sal I雙酶切， 將2片段割膠回收并連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α， 得到重組pET-SpBADH質(zhì)粒， 經(jīng)PCR和雙酶切鑒定表達(dá)載體正確（圖1）。并將鑒定正確的克隆測(cè)序， 測(cè)序結(jié)果與 NCBI比對(duì)結(jié)果一致， 說(shuō)明pET-SpBADH表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 重組SpBADH大腸桿菌表達(dá)工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)分析

對(duì)重組大腸桿菌表達(dá)工程菌 BL21（DE3）/pETSpBADH進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。取誘導(dǎo)后的工程菌進(jìn)行菌體蛋白制樣， 以相同的量上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析， 以未誘導(dǎo)重組BL21（DE3）/pET-SpBADH工程菌為對(duì)照，SDS-PAGE結(jié)束后以考馬斯亮藍(lán)染色。

圖2表明， 重組大腸桿菌表達(dá)工程菌 BL21（DE3）/pET-SpBADH經(jīng)誘導(dǎo)后在55 kD處比對(duì)照多一條蛋白條帶， 這與試驗(yàn)預(yù)測(cè)大小一致。這說(shuō)明重組大腸桿菌表達(dá)工程菌 BL21（DE3）/pET-SpBADH可以按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)正確表達(dá)目的蛋白。

2.3 重組SpBADH大腸桿菌表達(dá)工程菌的誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

圖1 pET-SpBADH的PCR和酶切鑒定Fig.1 Identifications of pET-SpBADH by PCR and double digestion

圖2 重組SpBADH在大腸桿菌工程菌中的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.2 Induction expression of the recombination SpBADH proteins in E.coli

2.3.1 最佳IPTG濃度 取工程菌8個(gè)濃度梯度誘導(dǎo)的菌體制樣， 并經(jīng)SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色和脫色， 表明重組大腸桿菌表達(dá)工程菌BL21（DE3）/pET-SpBADH的表達(dá)量與 IPTG濃度關(guān)系相關(guān)性不緊密， 工程菌在不同IPTG濃度的表達(dá)量差異不顯著， 考慮到IPTG對(duì)菌體有毒害作用， 所以選擇最佳IPTG濃度為0.2 mmol L-1。

2.3.2 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 取7個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間1、2、3、4、5、6和 7 h的工程菌全蛋白制樣， 取相同量的樣品經(jīng)SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色和脫色， 表明重組大腸桿菌表達(dá)工程菌BL21（DE3）/pET- SpBADH誘導(dǎo)4 h時(shí)表達(dá)量最高， 隨著時(shí)間的增加工程菌的蛋白表達(dá)量不變。所以對(duì)重組大腸桿菌表達(dá)工程菌BL21（DE3）/pET-SpBADH最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。

2.3.3 最佳起始濃度優(yōu)化 取9個(gè)起始OD6000.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5誘導(dǎo)的工程菌全蛋白制樣， 取相同量的樣品SDS-PAGE凝膠電泳， 通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色和脫色， 表明重組大腸桿菌表達(dá)工程菌BL21（DE3）/pET-SpBADH誘導(dǎo)起始OD600為0.6時(shí)表達(dá)量最高， 隨著OD600的增加工程菌的表達(dá)量差異也不明顯。所以對(duì)重組大腸桿菌表達(dá)工程菌 BL21（DE3）/pET-Sp BADH最佳誘導(dǎo)起始OD600為0.6。

2.3.4 最佳誘導(dǎo)溫度 對(duì)重組 SpBADH大腸桿菌表達(dá)工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)溫度優(yōu)化表明， 重組大腸桿菌表達(dá)工程菌BL21（DE3）/pET-SpBADH在其他溫度時(shí)均也可誘導(dǎo)表達(dá)， 但在37℃下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)量最高。所以重組大腸桿菌表達(dá)工程菌BL21（DE3）/pET-SpBADH的誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度為37℃。

2.4 重組SpBADH的分離純化

分別取咪唑濃度洗脫液制樣， 經(jīng) SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色， 最后根據(jù)OD值測(cè)定重組SpBADH相對(duì)含量。圖3表明， 通過(guò)Ni-NTA-Sefinose Column分離純化重組SpBADH的含量為301 μg mL-1。

2.5 重組SpBADH的酶學(xué)特性

2.5.1 最適 pH 值和 pH 值穩(wěn)定性 將重組純化的SpBADH加入pH為4.0～10.0的反應(yīng)體系中， 測(cè)定不同pH值下的酶活力表明， 重組SpBADH在pH為7.2時(shí)酶活力最大， 達(dá)到84.6 U mg-1。在pH為7.0左右時(shí)， SpBADH的酶活力較快上升并基本維持一個(gè)上升趨勢(shì)， 在超過(guò)最適pH值后其變化趨勢(shì)較為緩慢， 相對(duì)酶活力維持在 50%左右。表明該酶在pH值相對(duì)偏堿性的環(huán)境較穩(wěn)定。

圖3 重組SpBADH的分離純化Fig.3 Purification of the recombinant SpBADH protein

2.5.2 最適溫度及熱穩(wěn)定性 SpBADH在37℃范圍內(nèi)的酶活力最高， 最大比酶活力100 U mg-1。由此可知， 37℃范圍是該酶反應(yīng)的最適溫度。該酶對(duì)溫度變化敏感， 尤其對(duì)高溫表現(xiàn)最為顯著， 超過(guò)最適溫度以后的相對(duì)酶活力迅速下降到一半， 55℃以后的相對(duì)酶活力不足最高酶活力的20%。說(shuō)明SpBADH對(duì)高溫很敏感， 在高溫條件下對(duì)酶活力影響最大。

2.5.3 不同醇類對(duì)酶活力的影響 在 37℃下測(cè)定SpBADH的活性， 以不加入醇類的初始酶活力為 100%，觀察各種醇類對(duì)酶活力的影響。從表1可以看出， 各種醇類對(duì)SpBADH的比酶活力影響不大。說(shuō)明醇類在SpBADH的催化過(guò)程中起到緩沖液的作用。

2.5.4 不同醇類對(duì)酶熱穩(wěn)定性的影響 由以上試驗(yàn)可知 SpBADH表現(xiàn)出熱不穩(wěn)定性， 醇類小分子有機(jī)物對(duì)酶的穩(wěn)定性有一定的作用。從表2可以看出醇類小分子有機(jī)物對(duì) SpBADH具有熱穩(wěn)定性， 特別在反應(yīng)體系中加入丙三醇后SpBADH的酶活力最高。

3 討論

鹽脅迫是影響植物分布和農(nóng)作物產(chǎn)量及品質(zhì)的重要因素之一， 植物通常以許多保護(hù)機(jī)制來(lái)維護(hù)自身正常的生理代謝。植物在受到脅迫時(shí)， 迅速合成并積累大量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)維持植物細(xì)胞內(nèi)正常生理功能， 免受脅迫傷害［11-13］。甜菜堿是最理想的有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。本研究將海馬齒甜菜堿醛脫氫酶基因克隆到表達(dá)載體pET-28a中， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3） plys， 得到能夠表達(dá) SpBADH基因的重組菌株， 經(jīng) IPTG誘導(dǎo)， 重組SpBADH的蛋白的大腸桿菌重組工程菌能夠高效表達(dá)目的蛋白。它們的最優(yōu)表達(dá)條件為菌體培養(yǎng)溫度37℃， 蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)菌體起始OD600為0.6， 誘導(dǎo)劑IPTG最佳濃度為0.2 mmol L-1， 誘導(dǎo)時(shí)間為6 h， 重組菌株SpBADH表達(dá)量達(dá)301 μg mL-1。通過(guò)Ni-NTA-Sefinose Column將重組SpBADH的可溶性蛋白分離純化， 以酶學(xué)特性分析表明SpBADH酶活性的最適pH值、最適溫度及熱穩(wěn)定性、醇類對(duì)酶活力和熱穩(wěn)定的影響。BADH蛋白的輔酶是NAD+，可以催化甜菜堿醛、4-三甲基氨基丁醛和4-氨基正丁醛［14］等醛類物質(zhì)生成甜菜堿。本研究用甘氨酸甜菜堿醛作為底物與大腸桿菌中表達(dá)的 SpBADH基因的分離純化物反應(yīng)表明， SpBADH全長(zhǎng)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)其酶活性可以達(dá)到87 U mg-1， 說(shuō)明我們從海馬齒植物中分離的SpBADH基因具有催化甘氨酸甜菜堿醛的功能， 所以該基因?yàn)樘鸩藟A醛脫氫酶基因。SpBADH酶活力的最適pH值為7.2； 最適反應(yīng)溫度為37℃； SpBADH對(duì)高溫十分敏感， 溫度超過(guò)55℃時(shí)酶活性只有 20%。李秋莉等［15］在研究遼寧堿蓬SlBADH純化蛋白性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)， SlBADH純化蛋白在超過(guò)40℃后， 其活性迅速下降。本研究建立了重組 SpBADH蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的完全可溶性表達(dá)及純化體系， 獲得了純度較高的重組 SpBADH蛋白， 并分析了甜菜堿醛脫氫酶的基本生物特性。本研究為重組 SpBADH蛋白在其他微生物表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)提供了參考依據(jù)，為研究其在抗逆過(guò)程中的作用提供了技術(shù)支撐。海馬齒作為海濱鹽生植物具有很強(qiáng)的抗鹽能力， 因此研究海馬齒中的甜菜堿合成途徑， 及相關(guān)基因的分子特性等， 對(duì)揭示甜菜堿抗鹽機(jī)理具有重要意義。

表1 不同醇類對(duì)酶活力的影響Table1 Effect of alcohols on the activity of SpBADH

表2 不同醇類對(duì)酶熱穩(wěn)定性的影響Table2 Effect of alcohols on the thermal stability of SpBADH

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Cloning， Expression， and Enzymatic Characteristics of Betaine Aldehyde Dehydrogenase Gene in Sesuvium portulacastrum L.

YU Shi-Zhou1，4， YANG Cheng-Long2，*， GUO Jian-Chun3， and DUAN Rui-Jun31Guizhou Rape Institute， Guiyang 550008， China；2Guizhou Institute of Subtropical Crops， Xingyi 562400， China；3Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture / Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， China；4Guizhou Hemufu Seed Co.Ltd， Guiyang 550008， China

Among many osmotic materials， glycine betaine is a best organic micro-molecular， and functionally works for osmotic regulation in plants， which is non-toxic to plant growth.A lot of glycine betaine accumulated in plant can enhance the resistance of plants to environmental stresses.In the study， a full-length sequence of betaine aldehyde dehydrogenase gene from Sesuvium portulacastrum was ligated with the vector pET-［28a］（+）， named pET-SpBADH， and successfully transformed into BL21（DE3） to obtain the corresponding recombinant engineering bacteria， which could highly express 55 kD protein induced by IPTG， with the expression level to 301 μg mL-1.The purified protein was obtained， showing the optimum pH value of 7.2， and maintain high catalytic activity the enzyme under slightly alkaline conditions.SpBADH protein very sensitive to high temperature effected the enzyme activity， with the optimum temperature to 37℃.The enzyme activity was only 20% when temperature was over 55℃.The small organic molecules of the reveral compounds of alcohol had a protective effect on the catalytic activity of the enzyme.The microenvironment of catalytic activity could be maintained by its own characteristics.

Sesuvium portulacastrum L.； Betaine aldehyde dehydrogenase； Prokaryotic expression； Enzyme activity assay

10.3724/SP.J.1006.2016.01569

本研究由國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2014GB2F200240）， 國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAD01B07）， 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新專項(xiàng)［（2014）014］， 貴州省科研機(jī)構(gòu)服務(wù)企業(yè)行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目黔科合服企［（2015）4001］， 貴州省科技廳重大專項(xiàng)［黔科合重大專項(xiàng)字（2013）6005］， 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院專項(xiàng)［黔農(nóng)科院院專項(xiàng)（2015）16］， 貴州省科技廳‘百層次’人才項(xiàng)目［黔科合人才（2015） 4018］和貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院人才團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目［黔農(nóng)科合CR合字（2014）64］資助。

This study was supported by the National Agricultural Science and Technology Achievements Transformation Fund Project （2014GB2F200240），the National Key Technology Support Program of China （2014BAD01B07）， the Special Project of Independent Innovation Project［（2014）014］， the Project of Guizhou Province for Service Enterprise by Scientific Research Institution ［（2015）4001］， the Key Special Project for Guizhou Science and Cooperation ［（2013）6005］， the Special Project of Guizhou Academy of Agricultural Sciences ［（2015）16］， Guizhou Top 100 Talents Hierarchy Project of Science and Technology Department of Guizhou Province ［（2015）4018］， and the Talent Team Project of Guizhou Academy of Agricultural Sciences ［CR（2014）64］.

（Corresponding author）： 楊成龍， E-mail： yangchenglong208@163.com， Tel： 0859-3911295

聯(lián)系方式： E-mail： yushizhou2008@163.com

Received（）： 2016-02-19； Accepted（接受日期）： 2016-07-11； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）： 2016-07-28.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160728.0817.022.html