高華聰 王曉明 張麗麗

[摘要] 目的 獲得具有典型生化特征、教學(xué)用的模擬患者血清標(biāo)本，并確定其貯存溫度和保質(zhì)時間。 方法 制備1%的酵母提取物溶液作為基底液。向基底液中添加14.0 mmol/L的葡萄糖和10.0 mmol/L的三酰甘油（TG），制備模擬的糖尿病血清標(biāo)本；向基底液中添加10.0 mmol/L的TG，制備模擬的高甘油三酯血癥血清標(biāo)本；向基底液中添加28.0 g/L的白蛋白和10.0 mmol/L的TG，制備模擬的腎病綜合征血清標(biāo)本；向基底液中添加28.0 g/L的白蛋白和60 U/L的谷草轉(zhuǎn)氨酶，制備模擬的肝硬化患者血清標(biāo)本。測定各標(biāo)本在室溫、4℃和-20℃條件下，存放1、7、30 d后各生化指標(biāo)的變化情況。 結(jié)果 模擬的患者血清標(biāo)本外觀與臨床血清標(biāo)本基本一致。模擬的糖尿病血清標(biāo)本具有葡萄糖、TG升高的特征；模擬的高甘油三酯血癥血清標(biāo)本具有TG升高的特征；模擬的腎病綜合征血清標(biāo)本具有TG升高、白蛋白降低的特征；模擬的肝硬化血清標(biāo)本具有谷草轉(zhuǎn)氨酶升高、白蛋白降低的特征。4種標(biāo)本均可在-20℃保存30 d，除了模擬腎病綜合征的白蛋白以外，其余各指標(biāo)的變化差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 獲得了4種可供實驗教學(xué)使用的模擬患者血清標(biāo)本，確定了它們的最適貯存溫度和保質(zhì)時間。

[關(guān)鍵詞] 生物化學(xué)；實驗教學(xué)；血清標(biāo)本；貯存溫度；保質(zhì)時間

[中圖分類號] R446.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（b）-0025-04

Preparation and evaluation of patient serum analogue for experimental teaching

GAO Huacong1 WANG Xiaoming2 ZHANG Lili2 WU Dachang1 SHA Shanshan1

1.College of Basic Medical Sciences， Dalian Medical University， Liaoning Province， Dalian 116044， China； 2.Medical College， Dalian University， Liaoning Province， Dalian 116622， China

[Abstract] Objective To obtain patient serum analogues with classic biochemistry properties and can be used for experimental teaching， acquire their optimum storage temperature and quality guarantee period. Methods The 1% yeast extract solution was firstly prepared as basal solution. To prepare patient serum analogue of diabetes， hypertriglyceridemia， nephrotic syndrome and cirrhosis， amount of 14.0 mmol/L glucose and 10.0 mmol/L tiacylg lycerol， 10.0 mmol/L tiacylg lycerol， 28 g/L albumin and 10.0 mmol/L tiacylg lycerol， and 28 g/L albumin and 60 U/L aspartate aminotransferase were added to basal solution， respectively. The changes of these additives were detected after storage at room temperature， -4℃ and -20℃ for 1， 7 and 30 days， respectively. Results The prepared patient serum analogues showed a similar appearance with the clinic serum. The patient serum analogue of diabetes， hypertriglyceridemia， nephrotic syndrome and cirrhosis showed its corresponding character of raised glucose and tiacylg lycerol， raised tiacylg lycerol， raised tiacylg lycerol and reduced albumin， and raised aspartate aminotransferase and reduced albumin， respectively. Except for albumin in nephritic syndrome， all additives had no changes within 30 days when storage at -20℃ （P > 0.05）. Conclusion This article obtains four kinds of patient serum analogues which can be used for experiment teaching， and their optimum storage temperature and quality guarantee period are confirmed.

[Key words] Biochemistry； Experiment teaching； Serum sample； Storage temperature； Quality guarantee period

血清是醫(yī)學(xué)院校生物化學(xué)和臨床生物化學(xué)檢驗課程實驗教學(xué)中應(yīng)用最多的標(biāo)本。學(xué)生通過檢測血清中蛋白質(zhì)、脂類、糖、酶等物質(zhì)的含量，學(xué)習(xí)相關(guān)的技術(shù)方法，并理解疾病發(fā)生時血清中各物質(zhì)含量的變化。目前，血清標(biāo)本主要來源于醫(yī)院檢驗科和血庫，且多為正常人血清標(biāo)本。而教學(xué)效果更加良好的患者血清標(biāo)本，常因醫(yī)院檢驗科需要重復(fù)檢測或生物安全問題而難以獲得[1-3]。即使獲得了少量的患者血清，有時也會因為其成份復(fù)雜、穩(wěn)定性差等原因，無法在運(yùn)送或存放一定時間后獲得穩(wěn)定的陽性檢測結(jié)果[4-6]。如能人工制備某些疾病的模擬血清，將很好地解決上述問題。目前，關(guān)于單一成分血清標(biāo)本（如高血糖血清標(biāo)本）已有制備方法[7-10]，但對于多組分血清標(biāo)本的配制尚無報道。本研究利用1%的酵母粉溶液中添加化合物或酶液的方法，人工制備4種具有典型生化特征、可用于生物化學(xué)實驗教學(xué)的模擬患者血清標(biāo)本，并確定它們的最適貯存溫度和時間，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄糖（Glu）、白蛋白（Alb）、三酰甘油（TG）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。酵母提取物購自O(shè)xoid。Glu、TG、Alb和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司。SPF級、體重（20±2）g雌性BALB/c小鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（遼）2008-0002。

1.2 基底液和各添加物標(biāo)準(zhǔn)液的配制

基底液的配制：稱取酵母提取物，配制成1%（W/V）酵母粉水溶液，高壓滅菌。鼠肝勻漿液（約含300 U/L AST）的制備：小鼠脫頸椎處死，立即剖腹取出肝臟，稱取0.7 g鼠肝，加入5 mL PBS，冰上勻漿，4000 r/min離心5 min，取上清液-20°C保存。另外，按常規(guī)方法配制1.0 mol/L Glu標(biāo)準(zhǔn)液和400 g/L Alb標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3 模擬患者血清標(biāo)本的配制和生化指標(biāo)檢測

模擬糖尿病患者血清的配制：在基底液中加入1.0 mol/L Glu標(biāo)準(zhǔn)液和1.035 mol/L TG，使其理論上終濃度分別達(dá)到14.0 mmol/L和10.0 mmol/L。模擬高甘油三酯血癥患者血清的配制：在基底液中加入1.035 mol/L TG，使其理論上終濃度達(dá)到10.0 mmol/L。模擬腎病綜合征患者血清的配制：在基底液中加入1.035 mol/L TG和400 g/L Alb標(biāo)準(zhǔn)液，使其理論上終濃度分別達(dá)到10.0 mmol/L和28 g/L。模擬肝硬化患者血清的配制：在基底液中加入鼠肝勻漿液和400 g/L Alb標(biāo)準(zhǔn)液，使其理論上終濃度分別達(dá)到60.0 U/L和28 g/L。根據(jù)檢測試劑盒的操作說明，檢測模擬患者血清標(biāo)本中各添加物實際可檢測到的含量。

1.4 模擬患者血清標(biāo)本保存條件的確定

將各模擬血清標(biāo)本分別置于室溫、4℃、-20℃條件下保存，分別于第1、7、30天，根據(jù)試劑盒的操作說明檢測模擬血清標(biāo)本中各添加物的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有測定設(shè)立3個實驗重復(fù)，采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并利用隨機(jī)區(qū)組單因素方差分析，將模擬血清標(biāo)本保存后的各指標(biāo)含量與配制當(dāng)天相比較，從而確定模擬血清的最適存貯溫度和保質(zhì)時間。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模擬患者血清標(biāo)本外觀及各指標(biāo)含量

配制的4種模擬患者血清目測均為澄清、淡黃色、具有一定黏度的溶液，與臨床血清外觀極為相似。配制當(dāng)天4種標(biāo)本中各生化指標(biāo)均偏離正常值范圍，體現(xiàn)相應(yīng)疾病發(fā)生時的變化特征（表1）。其中，糖尿病患者臨床常表現(xiàn)為尿糖、高血糖、高血糖化血紅蛋白，多數(shù)患者還出現(xiàn)TG和/或膽固醇升高[11-13]；制備的模擬血清體現(xiàn)了Glu和TG升高兩個顯著特征。高甘油三酯血癥患者臨床表現(xiàn)為膽固醇和/或TG含量升高[13-15]；制備的模擬血清具有TG升高的特點(diǎn)。腎病綜合征患者臨床常表現(xiàn)為多尿、水腫、低白蛋白血癥，很多患者會合并高脂血癥[13，16]；制備的模擬血清具有Alb降低、TG升高兩個顯著特征。肝硬化患者臨床常表現(xiàn)為水腫、胸腹腔積液、血液中轉(zhuǎn)氨酶活性和膽紅素升高、Alb含量降低[13，17-18]；制備的模擬血清具有谷草轉(zhuǎn)氨酶活性升高、Alb含量降低兩個顯著特征。

表1 模擬患者血清標(biāo)本的各指標(biāo)含量（x±s）

注：Glu：葡萄糖；TG：三酰甘油；Alb：白蛋白；AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶；“-”表示未檢測

2.2 模擬患者血清標(biāo)本貯存溫度和時間的確定

2.2.1 模擬糖尿病患者血清 制備的模擬糖尿病患者血清在室溫保存1 d后Glu和TG含量較血清配制當(dāng)天[Glu：（14.99±0.31）mmol/L，TG：（2.93±0.08） mmol/L]即開始下降（P < 0.05）；4℃保存7 d尚可，但保存30 d后Glu降至正常值范圍；-20℃保存30 d后，Glu和TG值與血清配制當(dāng)天差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。因此，此標(biāo)本不可在室溫保存，可在4℃短期保存，-20℃可保存至少30 d。見表2。

表2 模擬糖尿病患者血清保存后各指標(biāo)的變化（x±s）

注：Glu：葡萄糖；TG：三酰甘油

2.2.2 模擬高甘油三酯血癥患者血清 制備的模擬高脂血癥患者血清在室溫保存30 d后，TG含量下降至正常值范圍；在4℃和-20℃保存30 d后，TG含量雖然有所波動，但與血清配制當(dāng)天[（3.03±0.32）mmol/L]比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。這表明，此標(biāo)本在室溫只可保存7 d，但在4℃或-20℃至少可以保存30 d。見表3。

表3 模擬高甘油三酯血癥患者血清保存后三酰甘油濃度的變化（mmol/L，x±s）

2.2.3 模擬腎病綜合征患者血清 模擬腎病綜合征患者血清TG和Alb含量分別在室溫保存30 d和-20℃凍融后與血清配制當(dāng)天[TG：（2.08±0.37）mmol/L，Alb：（25.85±0.97）g/L]比較有所下降（P < 0.05）。除此之外，模擬標(biāo)本在各種條件下保存30 d后TG和Alb含量均無顯著性變化（P > 0.05）。是此標(biāo)本在4℃和-20℃可保存至少30 d，但盡量避免反復(fù)凍融。見表4。

表4 模擬腎病綜合征患者血清保存后各指標(biāo)的變化（x±s）

注：TG：三酰甘油；Alb：白蛋白

2.2.4 模擬肝硬化患者血清 模擬肝硬化患者血清在室溫保存時Alb與血清配制當(dāng)天[（27.66±0.86）g/L]比較，基本無變化（P > 0.05），但7 d后AST活性較血清配制當(dāng)天[（82.67±0.02）U/L]開始下降并接近正常值范圍。4℃保存血清時Alb相對穩(wěn)定，AST有所下降。-20℃保存時，Alb和AST活性一直偏離正常范圍值。因此，此標(biāo)本不能在室溫保存，在4℃可短期保存，在-20℃可保存至少30 d。見表5。

3 討論

物質(zhì)代謝及其規(guī)律是生物化學(xué)課程的授課重點(diǎn)，掌握疾病相關(guān)的血液生化特征是醫(yī)學(xué)生生物化學(xué)和臨床生物化學(xué)實驗教學(xué)的主要目的之一。近年，各醫(yī)學(xué)高等院校廣泛開展了以臨床案例為導(dǎo)向的生物化學(xué)CBL教學(xué)，并取得了良好教學(xué)效果[19-20]。也有少數(shù)院校將CBL教學(xué)方式引入至生物化學(xué)的實驗教學(xué)中，來提高學(xué)生對實驗課的興趣，并培養(yǎng)學(xué)生綜合分析問題的能力[21-23]。具有明顯疾病特征、檢測結(jié)果穩(wěn)定、使用安全的患者血清標(biāo)本是生物化學(xué)CBL實驗教學(xué)不可缺少的組成部分。為此，本研究根據(jù)糖尿病、高甘油三酯血癥、腎病綜合征和肝硬化的基本生化特征，利用基底液中添加標(biāo)準(zhǔn)液的方法，建立了模擬患者血清標(biāo)本的快速簡便制備方法。結(jié)果表明，配制的模擬血清各指標(biāo)均達(dá)到了預(yù)期的“升高”或“降低”的模擬目的。各模擬血清在-20℃均可保存至少30 d，但在4℃和室溫時情況各不相同。這些結(jié)果為學(xué)生實驗時模擬血清的配制時間和貯存條件提供了參考。

值得一提的是，在糖尿病患者、腎病綜合征患者模擬血清的制備過程中，TG標(biāo)準(zhǔn)液的水溶性較低，所以測定的穩(wěn)定性稍顯不足。但是，因為加入量較少，分散度尚可，所以仍可以檢測到高于正常值的TG含量，可以滿足實驗教學(xué)的基本要求。另外，對于含有多個指標(biāo)的模擬血清，各指標(biāo)均未檢測到理論添加的濃度，其原因可能與各生化指標(biāo)之間互相干擾有關(guān)。還有，筆者也曾嘗試在糖尿病、高甘油三酯血癥和腎病綜合征模擬血清中加入膽固醇，從而體現(xiàn)這些疾病血中膽固醇升高的特征。但是由于溶解膽固醇固體的有機(jī)溶劑（如吐溫、氯仿）會影響后續(xù)測定體系中的酶活性，因此無法取得準(zhǔn)確的實驗結(jié)果，需在以后的實驗中進(jìn)一步尋找改善方法。

總之，本研究確定了4種教學(xué)用模擬患者血清的制備方法，它們操作簡便且成本低廉。所得模擬血清無傳染性，具有臨床生化指標(biāo)特征，低溫條件下保存穩(wěn)定性良好，可充分滿足生物化學(xué)實驗教學(xué)的需要。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 劉曉平，邵小華，蔡朝陽，等.臨床實驗室生物安全管理[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2011，9（12）：1996-1997.

[2] 楊斌.二級醫(yī)院檢驗科生物安全隱患及管理措施[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20（4）：526-527.

[3] 顧自衛(wèi).基層醫(yī)院臨床檢驗科生物安全管理探討[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2010， 48（31）：100-102.

[4] 李建余.探討影響臨床化學(xué)檢驗分析前質(zhì)量的因素及對策[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2015，13（2）：156-157.

[5] 朱紅英.血液標(biāo)本存放時間對生化檢驗結(jié)果造成影響的分析[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2013，20（25）：101-102.

[6] 張俊鳳，崔翠翠，肖琛.血液標(biāo)本采集與處理的質(zhì)量控制[J].臨床輸血與檢驗， 2005，7（2）：145-146.

[7] 甘建華，裴鵬，王定坤，等.生物化學(xué)實驗教學(xué)用血清標(biāo)本替代物的制備[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006，23（6）：1011-1012.

[8] 陸京瓊.陽性血清模擬標(biāo)本的一些制作方法[J].衛(wèi)生職業(yè)教育學(xué)，2003，（4）：22.

[9] 李艷，朱辛為，梁兆祥，等.生物化學(xué)實驗教學(xué)血液標(biāo)本的制備[J].第四軍醫(yī)大學(xué)吉林軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，25（4）：210-212.

[10] 張志芬，伊德林，曾艷.模擬醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實驗血清標(biāo)本的探討[J].沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1997，11（1）：44-47.

[11] 錢建平.生化檢驗在糖尿病診斷中臨床應(yīng)用研究[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2013，19（32）：108.

[12] 楊曉曼.生化檢驗指標(biāo)在糖尿病診斷中的臨床價值分析[J].糖尿病新世界，2014，（24）：76-78.

[13] 府偉靈，徐克前.臨床生物化學(xué)檢驗[M].5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013.

[14] 蒙秋鎖.302例高脂血癥分型分析[J].西安交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，1981，（S4）：16-18.

[15] 莊德成，卞善述，錢衛(wèi)東，等.高脂血癥辨證分型與血脂指標(biāo)的相關(guān)性研究[J].江蘇中醫(yī)，2001，22（9）：18-19.

[16] 魏珉，宋紅梅.腎病綜合征高脂血癥的研究進(jìn)展[J].中華兒科雜志，2001，39（12）：757-760.

[17] 吳永岳，曹龍翎，吳華美.肝硬化疾病診斷中的生化檢驗項目價值探討[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2013，11（36）：10-11.

[18] 梁月英，溫韻潔.生化檢驗項目在肝硬化疾病診斷中的應(yīng)用價值[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2014，4（7）：121-123.

[19] 劉潔，輦曉峰，朱曉波，等.案例教學(xué)法在生物化學(xué)教學(xué)中應(yīng)用的探索[J].醫(yī)學(xué)教育與研究，2011，28（4）：101-103.

[20] 雷呈.臨床案例教學(xué)法在醫(yī)學(xué)生物化學(xué)教學(xué)中的應(yīng)用與分析[J].中國高等醫(yī)學(xué)教育，2012，（3）：117-118.

[21] 于婧文，李艷花，霍明章，等.CBL結(jié)合PBL教學(xué)法在生物化學(xué)實驗教學(xué)中的應(yīng)用[J].生物學(xué)通報，2014，49（2）：48-52.

[22] 韓麗紅，楊文杰，吳剛.醫(yī)學(xué)院校生物化學(xué)實驗教學(xué)改革探索[J].科技創(chuàng)新導(dǎo)報，2014，（14）：154-156.

[23] 陳國靜.案例教學(xué)法在醫(yī)學(xué)院校生物化學(xué)實驗教學(xué)中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)世界，2015，（10）：221.

（收稿日期：2015-11-11 本文編輯：程 銘）