聶相珍，申麗媛

（揚(yáng)州大學(xué) 旅游烹飪學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

葡萄皮渣多酚提取及其對五種食源性致病菌的抑制作用

聶相珍，申麗媛

（揚(yáng)州大學(xué) 旅游烹飪學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

以葡萄皮渣為原料，采用乙醇溶液對葡萄皮渣中的多酚類物質(zhì)進(jìn)行浸提，用Folin-Ciocalteu法測定多酚含量，通過單因素及正交試驗得出浸提的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，浸提溫度48℃，浸提時間8 h，料液比1∶15（g∶mL），多酚得率為：16.48 mg/g。采用濾紙片法進(jìn)行葡萄皮渣多酚的抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀氏菌（Shigella）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙門氏菌（Salmonella）、大腸桿菌（Escherichia coli）都有一定的抑菌作用，其中對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制效果最好。

葡萄皮渣；多酚；乙醇浸提；抑菌活性

葡萄皮渣中富含酚類物質(zhì)，如沒食子酸、原花青素、兒茶素、鞣酸及白藜蘆醇等［1-4］。近年來，很多研究證實了這些酚類物質(zhì)具有多種生物活性，如延緩衰老、抗癌、抗氧化、抑制微生物生長、抗病毒等［5-10］。我國葡萄產(chǎn)量位居世界水果產(chǎn)量的前列［11］，大部分釀酒葡萄皮渣用于生產(chǎn)飼料和肥料，有的釀酒廠則將葡萄皮渣直接丟棄，造成資源浪費，并且也給環(huán)境帶來沉重的壓力［12-13］。而法國、西班牙、意大利等葡萄酒大國其大部分葡萄酒渣都已被應(yīng)用到食品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，具有一定的市場規(guī)模，70%以上的釀酒葡萄廢棄物都得到了很好地利用［11］。研究和解決葡萄廢棄物的利用問題，不僅可產(chǎn)生很高的經(jīng)濟(jì)價值和社會價值［14］，而且有利于葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，葡萄皮渣中多酚類物質(zhì)的提取方法主要有溶劑提取法［15］、（主要包括浸漬法、煎煮法、滲漉法、回流提取法）、超聲波輔助提取法［16-17］、微波輔助提取法［18］、生物酶水解提取法［19］、超臨界流體萃取法［20］、大孔吸附樹脂純化法［21］等。其中，溶劑提取法由于對操作設(shè)備要求簡單、產(chǎn)品得率較高、低成本等原因成為目前應(yīng)用最為廣泛的方法；因此，本實驗采用溶劑提取法中的乙醇浸提法從釀酒剩余的赤霞珠葡萄皮渣中提取多酚物質(zhì)，優(yōu)化提取工藝，并探究其對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀氏菌（Shigella）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙門氏菌（Salmonella）、大腸桿菌（Escherichia coli）的抑制作用，以期為新型食品防腐劑的開發(fā)提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

赤霞珠葡萄皮渣：市售。

志賀氏菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：實驗室保存。

無水乙醇（分析純）：北京化工廠；福林酚（Folin-Ciocalteu）、沒食子酸（分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.2儀器與設(shè)備

BS2443電子分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；85-2A數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：上海璽袁科學(xué)儀器有限公司；FZ102微型植物粉碎機(jī)：上海書培實驗設(shè)備有限公司；722G可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；PYX-DHS-50×60-BS-Ⅱ隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.3方法

1.3.1乙醇浸提法提取葡萄皮渣中的多酚類物質(zhì)

原料預(yù)處理：將釀酒下腳料赤霞珠葡萄皮渣，經(jīng)分離、陰干后，將葡萄皮渣放入50℃的烘箱中干燥2 h，烘干后，粉碎得到葡萄皮渣干粉，備用。

單因素試驗：稱取一定量的葡萄皮渣粉末置于錐形瓶中，按一定的料液比加入適當(dāng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，封口，在適當(dāng)溫度下水浴浸提一段時間。分別考察料液比（1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15、1∶17（g∶mL））、乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%）、浸提溫度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）和浸提時間（3 h、5 h、7 h、9 h、11 h）對葡萄皮渣中多酚得率的影響。

1.3.2正交試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以葡萄皮渣中多酚物質(zhì)得率（Y）為評價指標(biāo)，對乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、浸提溫度（B）、浸提時間（C）和料液比（D）進(jìn)行優(yōu)化正交試驗，確定最佳的提取條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1　葡萄皮渣多酚提取工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction process optimization of grape pomace polyphenols

1.3.3Folin-Ciocalteu法測定多酚含量

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱10 mg沒食子酸于燒杯中，制成0.1g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取100μL、200 μL、400 μL、600 μL、800 μL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL的棕色容量瓶中，用雙蒸水補(bǔ)充至2.0mL。然后再加入福林酚試劑1.0 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.7%的Na2CO3飽和溶液4.0 mL，充分混勻，再加入蒸餾水定容至10 mL。在室溫條件下靜置2 h，在波長760 nm處測定吸光度值（A），最后以沒食子酸的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

葡萄皮渣多酚含量的測定：浸提液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，用蒸餾水定容至50mL，準(zhǔn)確移取50 μL浸提液于10 mL棕色容量瓶中，采用上述福林酚法測定吸光度值，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計算多酚含量及多酚得率。

1.3.4抑菌試驗

菌種的活化：將5種致病菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、沙門氏菌）分別接種至牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。

菌懸液的制備：在活化后的斜面培養(yǎng)基中注入1 mL無菌水，將斜面生長的細(xì)菌菌落刮下，振蕩搖勻，小心挑取一環(huán)接入到裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，振蕩、搖勻，制成菌懸液待用。

抑菌試驗：采用無菌操作將滅過菌的培養(yǎng)基傾注于培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿裝15～20 mL（培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基厚度約3～5 mm），待培養(yǎng)基凝固，用移液槍移取1 mL金黃色葡萄球菌的菌懸液于培養(yǎng)皿中，涂布均勻，靜置，菌液被充分吸收后，向4 mm滅菌濾紙圓片上注入20 μL配制好的3 mg/mL的葡萄皮渣多酚溶液，立即將濾紙片貼在培養(yǎng)基表面。按照十字形對稱貼4張濾紙圓片，其中3個是注入3 mg/mL的葡萄皮渣多酚溶液，另外的1個是注入20 μL無菌生理鹽水（對照），37℃培養(yǎng)24 h后，取出觀察抑菌圈大小，記錄結(jié)果。按照同樣的操作，分別在濾紙圓片上注入5 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL、12 mg/mL的不同質(zhì)量濃度葡萄皮渣多酚溶液，考察其抑菌效果。大腸桿菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、沙門氏菌重復(fù)同樣操作步驟。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

橫坐標(biāo)為沒食子酸的質(zhì)量濃度（x），縱坐標(biāo)為波長760 nm處的吸光度值（y），繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1　沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

由圖1可知，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.110 33x+ 0.014 26，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 040，在1～8 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，沒食子酸與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2單因素試驗結(jié)果

2.2.1料液比對葡萄皮渣多酚得率的影響

由圖2可知，隨著料液比的逐漸增大，葡萄皮渣中多酚得率整體呈上升的趨勢。當(dāng)料液比＜1∶15（g∶mL）時，多酚得率增加速度快，提取液體積較小時，葡萄皮渣可能與乙醇溶液接觸不充分，導(dǎo)致提取不完全；當(dāng)料液比到達(dá)1∶15（g∶mL）后繼續(xù)增大料液比，多酚得率增加緩慢。因此，選擇料液比為1∶15（g∶mL）進(jìn)行正交試驗。

圖2　料液比對葡萄皮渣多酚得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polyphenols in grape pomace

2.2.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對葡萄皮渣多酚得率的影響

圖3　乙醇體積分?jǐn)?shù)對葡萄皮渣多酚得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols in grape pomace

由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增大，葡萄皮渣中多酚類物質(zhì)的得率呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時，葡萄皮渣中多酚類物質(zhì)的得率達(dá)到最大；繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，葡萄皮渣中多酚得率則開始下降。原因可能為多酚類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)中存在著酚羥基、羥基等，在植物體內(nèi)通常與其他物質(zhì)通過氫鍵連接，而乙醇可以破壞這些氫鍵，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，水的含量相對較大，從而會浸出許多水溶性雜質(zhì)，多酚類物質(zhì)得率便較低。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，多酚類物質(zhì)得率也增加；而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時，可能會使多酚類物質(zhì)在乙醇溶液中的溶解性降低，反而不利于多酚類物質(zhì)溶解，導(dǎo)致得率降低。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%進(jìn)行正交試驗。

2.2.3浸提溫度對葡萄皮渣中多酚得率的影響

圖4　浸提溫度對葡萄皮渣多酚得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of polyphenols in grape pomace

由圖4可知，隨著浸提溫度的升高，葡萄皮中多酚類物質(zhì)的得率先呈上升趨勢，當(dāng)浸提溫度為45℃時，多酚得率達(dá)到最高；當(dāng)浸提溫度繼續(xù)提高時，葡萄皮中多酚類物質(zhì)的得率則呈下降趨勢。通常情況下，隨著溫度的升高，分子運(yùn)動速率會加快，多酚類物質(zhì)從葡萄細(xì)胞中溶到乙醇溶液中的速度就會加快，得率也會逐漸增大。但是當(dāng)溫度增大到一定程度時，多酚類物質(zhì)可能被破壞，致使多酚類物質(zhì)的得率下降。因此，選擇浸提溫度為45℃進(jìn)行正交試驗。

2.2.4浸提時間對葡萄皮渣多酚得率的影響

圖5　浸提時間對葡萄皮渣多酚得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of polyphenols in grape pomace

由圖5可知，隨著浸提時間的增加，葡萄皮渣中多酚類物質(zhì)得率先呈上升趨勢，當(dāng)浸提時間為7 h時，多酚得率達(dá)到最大。隨著浸提時間的繼續(xù)增大，葡萄皮渣中多酚類物質(zhì)得率逐漸下降。一般情況下，浸提時間越長，溶解于乙醇溶液中的多酚類物質(zhì)會越多，得率會越大。但是當(dāng)浸提時間達(dá)到一定值時，多酚類物質(zhì)已大體溶于溶劑乙醇溶液中，長時間加熱可能會使多酚類物質(zhì)縮合，進(jìn)而導(dǎo)致多酚得率下降。因此，選擇浸提時間7 h進(jìn)行正交試驗。

2.3正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計正交試驗因素水平表，采用L9（34）正交試驗設(shè)計，正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2　葡萄皮渣中多酚提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction process optimization of grape pomace polyphenols

表3　正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2極差R值可知，采用乙醇法提取葡萄皮渣中多酚類物質(zhì)時，各因素對葡萄皮渣多酚得率影響的大小順序是：B＞D＞C＞A，即浸提溫度＞料液比＞浸提時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)，最優(yōu)提取方案為A1B3C3D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，浸提溫度48℃，浸提時間8 h，料液比1∶15（g∶mL）。

由表3方差分析結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時間和料液比4個因素的F值均遠(yuǎn)高于6.23，對多酚得率均有極顯著影響。而從表中4個因素的F值大小可以看出，F(xiàn)B＞FD＞FC＞FA，即各因素對葡萄皮渣多酚類物質(zhì)得率影響的主次順序是浸提溫度＞料液比＞浸提時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)，方差分析結(jié)果與極差分析得出的結(jié)果一致。

2.4驗證試驗結(jié)果

正交試驗理論結(jié)果的最優(yōu)方案為A1B3C3D2，而表2中最優(yōu)方案為A1B3C3D3。對兩種方案通過3次平行試驗進(jìn)行驗證。在A1B3C3D3條件下葡萄皮渣多酚得率為15.71 mg/g，而驗證試驗中，在A1B3C3D2條件下葡萄皮渣多酚得率為16.48 mg/g，因此確定提取的最佳工藝為A1B3C3D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，浸提溫度48℃，浸提時間8 h，料液比為1∶15（g∶mL）。

2.5葡萄皮渣多酚物質(zhì)對供試菌的抑菌效果

按照試驗方法，分別測定了不同質(zhì)量濃度的葡萄皮渣多酚提取物對5種供試菌的抑菌圈大小，考察葡萄皮渣多酚類物質(zhì)對5種供試菌的抑制效果，試驗結(jié)果見表4。

表4　不同質(zhì)量濃度的葡萄皮渣多酚提取物對供試菌的抑菌效果Table 4 Inhibitory effect of different polyphenol extracts concentrations on tested bacteria

抑菌圈直徑越大，說明抑菌效果越明顯［22］。由表4可知，葡萄皮渣中多酚提取物質(zhì)量濃度越大，抑菌圈直徑越大，當(dāng)葡萄皮渣多酚提取物質(zhì)量濃度為12 mg/mL時，對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單增李斯特菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為17.7mm、18.3mm、13.7mm、13.3mm、14.7 mm。與空白對照相比，葡萄皮渣中多酚提取物對5種致病菌具有明顯的抑菌效果，其中對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制效果最好，其次是大腸桿菌。

3　結(jié)論

本實驗采用乙醇浸提法提取葡萄皮渣中多酚類物質(zhì)，利用單因素和正交試驗對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對葡萄皮渣多酚提取物的抑菌效果進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，葡萄皮渣多酚的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%，浸提溫度為48℃，浸提時間為8 h，料液比為1∶15（g∶mL）。在此條件下，多酚得率為16.48 mg/g。抑菌效果結(jié)果表明，葡萄皮渣中的多酚提取物對金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、沙門氏菌和大腸桿菌都表現(xiàn)了明顯的抑菌作用，并且隨著多酚物質(zhì)質(zhì)量濃度的增大抑制作用增強(qiáng)，其中對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制效果最好。為葡萄皮渣多酚提取物作為新型天然食品防腐劑的開發(fā)和綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

［1］高學(xué)峰，楊繼紅，王華.葡萄及葡萄酒生產(chǎn)過程中副產(chǎn)物的綜合利用研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2015，36（7）：298-304.

［2］令博.葡萄皮渣膳食纖維的改性及其生理功能和應(yīng)用研究［D］.重慶：西南大學(xué)，2012.

［3］黨艷艷，郭禹熙，曹文靜，等.葡萄籽多酚類物質(zhì)的鹽析萃?。跩］.化工學(xué)報，2014，65（8）：3048-3053.

［4］張昂.葡萄冬剪枝條抗氧化特性及活性酚類成分的研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

［5］賈榮.山葡萄籽多酚提取物及抗氧化活性的研究［D］.長春：吉林大學(xué)，2010.

［6］李焱，劉仲華.葡萄多酚提取及抗氧化研究進(jìn)展［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2013（2）：52-55.

［7］呂昕澤，吳秀禎，張衛(wèi).葡萄多酚對心肌保護(hù)作用研究進(jìn)展［J］.藥物評價研究，2012（1）：46-52.

［8］朱美蓉，房玉林.葡萄多酚研究進(jìn)展及其開發(fā)利用［J］.中國釀造，2015，34（12）：1-4.

［9］李黔柱.以沒食子酸為先導(dǎo)合成1，2，4-三唑衍生物及抗菌和抗病毒活性研究［D］.貴陽：貴州大學(xué)，2009.

［10］王華，劉霞，楊繼紅，等.葡萄籽原花青素抗癌活性及其機(jī)制研究進(jìn)展［J］.安徽大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，36（4）：101-108.

［11］閆瑜.中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)國際競爭力分析［D］.青島：中國海洋大學(xué)，2011.

［12］米雪.釀酒葡萄的綜合開發(fā)利用價值［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2009.

［13］呂慶峰.近現(xiàn)代中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

［14］李鵬.農(nóng)業(yè)廢棄物循環(huán)利用的績效評價及產(chǎn)業(yè)發(fā)展機(jī)制研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

［15］LAFKA T，SINANOGLOU V，LAZOS E S.On the extraction and antioxidant activity of phenolic compounds from winery wastes［J］.Food Chem，2007，104（3）：206-1214.

［16］令博，王捷，吳洪斌.等.葡萄皮渣多酚超聲波輔助提取工藝響應(yīng)面法優(yōu)化及抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2011，32（18）：24-29.

［17］DENG Q，PENNER M H，ZHAO Y.Chemical composition of dietary fiber and polyphenols of five different varieties of wine grape pomace skins［J］.Food Res Int，2011，44（9）：2712-2720.

［18］李鳳英.葡萄皮籽多酚物質(zhì)的提取技術(shù)研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［19］CHAMORRO S，VIVEROS A，ALVAREZ I，et al.Changes in polyphenol and polysaccharide content of grape seed extract and grape pomace after enzymatic treatment［J］.Food Chem，2012，33（2）：308-314.

［20］PINELO M，RUIZ-RODRíGUEZ A，SINEIRO J，et al.Supercritical fluid and solid-liquid extraction of phenolic antioxidants from grape pomace：a comparative study［J］.Eur Food Res Tech，2007，226（1）：199-205.

［21］郭雄飛，倪慧，卿德剛，等.葡萄籽中多酚類物質(zhì)的提取和純化工藝［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009（4）：41-44.

［22］黃和，林曉霞，鄺高波，等.番石榴多酚成分分析及抑菌活性研究［J］.熱帶作物學(xué)報，2014，35（12）：2482-2487.

Extraction of polyphenols in grape pomace and their inhibition on five kinds of food-borne pathogenic bacteria

NIE Xiangzhen，SHEN Liyuan
（School of Tourism and Culinary Science，Yangzhou University，Yangzhou 225127，China）

With the grape pomace as raw material，the polyphenols in grape pomace were extracted by ethanol method，and the polyphenols content was determined by Folin-Ciocalteu method.Through single factor and orthogonal experiments，the optimum process conditions were ethanol 45%，extraction temperature 48℃，extraction time 8 h and solid-liquid ratio 1∶15（g∶ml）.Under the conditions，the polyphenols yield was 16.48 mg/g.The antibacterial activity of grape pomace polyphenols was researched by filtering paper method.Results showed that the polyphenols had a certain inhibitory effect onStaphylococcus aureus，Shigella，Listeria monocytogenes，SalmonellaandEscherichia coli，and the inhibitory effect of the polyphenols onS.aureusandSalmonellawas the optimal.

grape pomace；polyphenols；ethanol extraction；antimicrobial activity

TS262.6

0254-5071（2016）09-0101-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.023

2016-05-23

江蘇省高校自然科學(xué)研究計劃項目（No.05KJB150148）

聶相珍（1991-），女，碩士研究生，研究方向為食物成分與人體健康的研究。