張國良　王玲玲　詹森林　曹廷智　汪文斐　張紅梅　鄧群益　聶廣

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不同中醫(yī)證型肺結核患者外周血CD14+單核細胞IL-1β、IL-1Ra表達水平的差異

張國良王玲玲詹森林曹廷智汪文斐張紅梅鄧群益聶廣

目的探討肺結核患者不同中醫(yī)證型與CD14+單核細胞白介素-1β(interleukine-1β,IL-1β)、白介素-1受體拮抗劑(interleukine-1 receptor anlagenist,IL-1Ra)表達水平的相關性。 方法選取104例肺結核確診患者為研究對象，其中肺陰虧虛33例，陰虛火旺36例，氣陰兩虛35例。采集抗凝血并利用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，與CD14+免疫磁珠孵育后獲得單核細胞，使用結核桿菌裂解物刺激單核細胞，同時設立空白對照。12小時后收集細胞上清通過酶聯(lián)免疫吸附法測定IL-1β、IL-1Ra水平，同時裂解細胞提取總RNA，利用實時定量PCR技術測定IL1B、IL1RN基因相對表達量。通過方差分析比較不同證型肺結核患者IL-1β、IL-1Ra表達水平的差異。結果(1)成功建立檢測IL1B、IL1RN基因的實時定量PCR技術，靶基因可以被有效擴增，并且引物具有良好特異性;(2)結核菌刺激后IL-1β蛋白表達水平顯著升高，其中肺陰虧虛組顯著高于陰虛火旺組和氣陰兩虛組(P<0.05)，陰虛火旺組IL-1β分泌水平又顯著高于氣陰兩虛組(P<0.05)。IL-1B mRNA表達趨勢與蛋白表達趨勢一致，肺陰虧虛、陰虛火旺、氣陰兩虛三組中IL-1B基因表達水平依次降低，組與組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.01)；(3)結核菌刺激能夠顯著增加IL-1Ra分泌水平，氣陰兩虛組顯著高于其它兩組(P<0.05)，而肺陰虧虛組和陰虛火旺組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。同時，在mRNA層面氣陰兩虛組IL1RN表達水平顯著高于其它兩組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.01)；(4)在結核菌刺激后，IL-1β/IL-1Ra比值在肺陰虧虛和陰虛火旺組中明顯增高，顯著高于氣陰兩虛組(P<0.01、P<0.05)。 結論IL-1β、IL-1Ra表達水平與肺結核中醫(yī)病機演變密切相關，由此推測它們不僅可以作為肺結核中醫(yī)微觀辨證的生物標識，也可以作為未來結核病治療的有效分子靶點。

肺結核；中醫(yī)證型；白介素-1β；白介素-1受體拮抗劑；單核細胞

結核病(tuberculosis，TB)是由單一感染因素引起的死亡率最高的疾病，因本病每年全球死亡人數(shù)高達140萬，是嚴重危害人類健康的重大公共衛(wèi)生問題。經(jīng)過多年努力，中國結核病流行總體形勢有所好轉，但仍是結核病高負擔國家之一，并且耐多藥結核(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)的危害也日益凸顯[1]。肺結核(pulmonary tuberculosis，PTB)是結核病的主要表現(xiàn)形式，屬于中醫(yī)“肺癆”范疇，其病因外為感染癆蟲，內為正氣虛弱，且兩者相互為因。結核桿菌屬于胞內菌，可以在CD14+細胞來源的巨噬細胞中復制、存活[2]。白介素-1β(interleukine-1β，IL-1β)作為巨噬細胞分泌的重要前炎癥因子，在控制結核菌感染以及轉歸中扮演重要角色[3]。IL-1R拮抗劑(IL-1Ra)由IL1RN基因編碼，能特異性地與IL-1受體結合，拮抗IL-1而發(fā)揮其生物學效應[4]。本研究通過探討肺結核患者不同中醫(yī)證型與CD14+單核細胞IL-1β、IL-1Ra表達水平的相關性，以期明確肺結核病機演變過程中免疫應答變化特征，并為中醫(yī)微觀辨證提供新的生物標識。

1　對象與方法

1.1研究對象

選取于2014年6月至2015年6月期間在深圳市第三人民醫(yī)院就診的104例肺結核患者為研究對象，其中男性65例，女性39例，平均年齡(36.5±13.7)歲。所有患者均符合2005年中華醫(yī)學會《臨床診療指南·結核病分冊》中的診斷要求[5]，且痰涂片陽性，結核菌特異性IFN-γ Elispot檢測陽性，均為初治肺結核，無合并其它感染性疾病、遺傳代謝性疾病和自身免疫性疾病等。本研究經(jīng)深圳市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2試劑與儀器

人淋巴細胞分離液(批號：DKW-KLSH-0100)購自深圳達科微生物公司，RPMI 1640培養(yǎng)基(批號：11875-093)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號：10437-028)均購自美國Gibco公司，CD14免疫磁珠(貨號130-097-052)購自德國Miltenyi公司，總RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit，批號：74106)購買自德國Qiagen公司，SYBR Green實時定量PCR試劑(批號：RR820A)購自日本TAKARA公司，qPCR引物委托深圳華大基因研究院合成，IL-1β、IL-1Ra細胞因子ELISA檢測試劑盒(批號：DLB50、DRA00B)購自美國R&D公司。CO2細胞培養(yǎng)箱為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品，多功能酶標儀DTX880和細胞離心機為德國Beckman公司產(chǎn)品，ABI 7500實時定量PCR儀購自美國ABI公司，結核分枝桿菌裂解物由課題組前期自行制備并保存。

1.3中醫(yī)診斷標準

依據(jù)國家中醫(yī)藥管理局《中醫(yī)病證診斷療效標準》[6]，擬定肺陰虧虛、陰虛火旺、氣陰兩虛3個證型的主癥和次癥，根據(jù)其臨床證侯、舌象、脈象進行中醫(yī)辨證分型。所有病例的辨證分型均由兩名專科中醫(yī)師共同完成，分型結果不一致的病例予以剔除。由于陰陽兩虛多見于病程日久、遷延難愈患者，且合并艾滋病患者居多，為避免不同疾病中醫(yī)證型的相互干擾，本研究未納入陰陽兩虛患者。入選病例中肺陰虧虛33例、陰虛火旺36例、氣陰兩虛35例。不同中醫(yī)證型人群在年齡、性別分布中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.4外周血CD14+單核細胞的分選

用肝素鋰抗凝管采集外周血5 mL，然后使用磷酸鹽緩沖液(PBS)對比稀釋，緩慢加入Ficoll淋巴細胞分離液上方，采用密度離心法分離出外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，取1×107個PBMCs與CD14免疫磁珠5 μL置于4℃保存，孵育20分鐘，再使用MACS自動磁珠分選儀獲得CD14+單核細胞。

1.5結核桿菌刺激CD14+單核細胞

將來源于同一結核病患者的CD14+單核細胞一分為二，分別接種在24孔細胞培養(yǎng)板中兩個細胞孔，細胞密度為2×105個/孔，加入含10 %胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，并放置在5% CO2、37°C培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，12小時后，將其中一個細胞孔加入經(jīng)煮沸處理的結核菌裂解物(Mtb lysate，20 μg/mL)刺激。刺激12后分別收集細胞和培養(yǎng)上清，細胞裂解后提取總RNA，上清檢測炎癥因子IL-1β、IL-1Ra濃度。另外一個細胞孔則以無細菌刺激作為空白對照。

1.6總RNA的提取及實時定量PCR檢測

根據(jù)RNeasy Mini Kit的說明書操作步驟，從CD14+單核細胞中提取總RNA。RNA的質量及濃度檢測采用超微量分光光度計測定。取2 μL RNA，使用oligo-T通用逆轉錄引物，在逆轉錄酶的作用下生成cDNA。使用IL1B和IL1RN基因特異性引物進行qPCR反應，引物序列見表1，反應體系如下：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL， cDNA模板2 μL，加雙蒸水至20 μL。反應條件：95°C 30秒，隨后95°C 5秒，60°C 34秒，共40個循環(huán)。通過甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)內參基因Ct值進行標準化，最終以2-ΔΔCt值表示IL1B和IL1RN基因拷貝數(shù)。

1.7ELISA測定細胞上清IL-1β、IL-1Ra濃度

ELISA試劑盒測定IL-1β、IL-1Ra濃度。首先加入200 μL樣本至反應孔中，室溫孵育2小時后，PBS洗滌3次，然后加入200 μL酶標二抗室溫孵育1小時，PBS洗滌3次，最后加入200 μL底物顯色，使用DTX880酶標儀讀取光密度值(optical density，OD)，根據(jù)標準曲線計算炎癥因子濃度，然后比較不同中醫(yī)證型患者之間表達水平差異。

1.8統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1應用實時定量PCR技術檢測IL1B、IL1RN基因表達

如圖1所示，qPCR擴增曲線圖顯示IL1B、IL1RN和GAPDH基因可以被有效擴增，而熔解曲線圖顯示不同基因具有特異性熔解曲線，而且曲線峰值單一，提示前期設計的引物具有很好的敏感性和特異性。

2.2不同中醫(yī)證型肺結核患者CD14+單核細胞IL-1β表達水平差異

相對于空白對照，結核菌裂解物能顯著刺激IL-1β分泌，其中肺陰虧虛組表達水平最高，顯著高于陰虛火旺組和氣陰兩虛組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.01)，其中陰虛火旺組IL-1β分泌水平又顯著高于氣陰兩虛組(P<0.05)。同時利用qPCR技術檢測IL1B基因表達水平，與蛋白表達水平相一致，在肺陰虧虛、陰虛火旺、氣陰兩虛三組中IL1B基因表達水平依次降低，且組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.01)。詳見表2。

圖1　應用實時定量PCR技術檢測IL1B、IL1RN基因表達

表2　不同中醫(yī)證型肺結核患者CD14+單核細胞IL-1β及其mRNA表達水平比較

注： 與空白對照孔相比，aP<0.01 ；與肺陰虧虛組相比，bP<0.01；與陰虛火旺組相比，cP<0.05。

2.3不同中醫(yī)證型肺結核患者CD14+單核細胞IL-1Ra表達水平差異

在無結核菌刺激的條件下，IL-1Ra分泌水平在肺陰虧虛、陰虛火旺、氣陰兩虛三組患者中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而結核菌刺激能夠顯著增加IL-1Ra分泌水平，其中氣陰兩虛組升高最為明顯，顯著高于肺陰虧虛組和陰虛火旺組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而肺陰虧虛組和陰虛火旺組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。IL-1Ra的編碼基因為IL1RN，在mRNA水平，氣陰兩虛組IL1RN表達水平顯著高于其他兩組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.01)。詳見表3。

表3　不同中醫(yī)證型肺結核患者CD14+單核細胞IL-1Ra及其mRNA表達水平比較

注： 與空白對照孔相比，aP<0.01 ；與肺陰虧虛組相比，bP<0.05；與陰虛火旺組相比，cP<0.01。

2.4肺結核患者中醫(yī)證型與CD14+單核細胞IL-1β/IL-1Ra比值的相關性

根據(jù)上述細胞上清IL-1β和IL-1Ra濃度進一步計算IL-1β/IL-1Ra比值，如表4所示，與空白對照組比較，肺陰虧虛、陰虛火旺、氣陰兩虛三組IL-1β/IL-1Ra比值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而在結核菌刺激后，IL-1β/IL-1Ra比值在肺陰虧虛和陰虛火旺中顯著增高，顯著高于氣陰兩虛組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.01)。詳見表4。

表4　肺結核患者中醫(yī)證型與CD14+單核細胞上清中IL-1β/IL-1Ra比值的相關性

注： 與空白對照孔相比，aP<0.01 ；與肺陰虧虛組相比，bP<0.01；與陰虛火旺組相比，cP<0.05。

3　討論

中醫(yī)學對“肺癆”的認識歷史悠久，早在《內經(jīng)·靈樞》就有記載“咳，脫形，身熱，脈小以疾”，詳細描述了肺癆的主癥和慢性消耗性特征。晉代《肘后備急方》首次創(chuàng)立“鬼注”“尸注”之名，并認識到本病具有傳染性。宋代《三因極一病證方論》首次提出“癆瘵”之名，并與“虛勞”病證劃清界限?！镀諠臼路健酚涊d“肺蟲居肺葉之內，蝕人肺體，故成瘥疾，咯血聲嘶”，認為本病是由“肺蟲”引起?！夺t(yī)學正傳·勞極》確立了殺蟲與補虛兩大治療原則。肺癆病位在肺，肺喜潤惡燥，癆蟲蝕肺，首耗肺陰，陰不制陽，則現(xiàn)陰虛火旺之候，若陰傷及氣，或陰損及陽，則可出現(xiàn)氣陰兩傷或陰陽兩虛之候[7]。因此朱丹溪提出“癆瘵主乎陰虛”之說，并倡導“滋陰降火”這一治則應貫穿肺癆治療的始終。

多種微生物感染可以誘導IL-1β產(chǎn)生，如《Nature》報道[8]白色念珠菌通過激活NLRP3炎癥小體而促進IL-1β產(chǎn)生并介導宿主抗真菌免疫應答。Mishra等[9]發(fā)現(xiàn)結核桿菌效應分子ESAT-6同樣能夠被NLRP3炎癥小體識別并導致IL-1β分泌。動物實驗證實IL1B基因敲除小鼠在感染結核菌后表現(xiàn)出更高的死亡率和肺臟細菌載量[10]，提示IL-1β及其介導的信號通路在結核保護性免疫中發(fā)揮重要作用。IL-1Ra是一種有高度選擇性的競爭性受體拮抗劑，它與受體結合但并不能激活受體，從而抑制IL-1β的多種生物學活性[4]。IL-1β/IL-1Ra比值可以作為評估機體抗結核免疫應答的重要指標。

在本研究中，結核菌刺激能夠顯著誘導CD14+單核細胞分泌IL-1β和IL-1Ra，而以肺陰虧虛患者IL-1β表達水平最高，隨著病機演變，陰虛火旺患者逐漸降低，至氣陰兩傷階段，其表達水平最低，提示IL-1β表達水平與病機演變密切相關，而且IL-1β作為機體抗結核感染免疫的重要指標，也可以作為中醫(yī)正氣損傷的有效生物標識。此外，研究發(fā)現(xiàn)氣陰兩虛患者IL-Ra表達水平顯著升高，因此推測對于肺癆后期患者，IL-Ra升高競爭性抑制IL-1β介導的抗結核免疫應答，從而導致病情遷延難愈。IL-Ra不僅可以作為氣陰兩虛證型的微觀辨證標簽，也有希望作為未來結核病治療的分子靶點。

總而言之，本研究證實在肺結核早期(肺陰虧虛型)，主要表現(xiàn)為高IL-1β、低IL-Ra表達；在疾病中期(陰虛火旺型)，IL-1β水平逐漸降低；而在疾病后期(氣陰兩虛型)，則呈現(xiàn)低IL-1β、高IL-Ra的臨床表型。以上結果提示在肺結核病機演變過程中，IL-1β介導的宿主保護性免疫逐漸弱化，而IL-Ra介導的病理性免疫逐漸增強。根據(jù)本研究結果，在未來結核病治療中，需要在中醫(yī)辨證施治的基礎上，適當配伍合適的免疫調節(jié)劑，如黃芪多糖和黃芪皂苷已被證實可以促進巨噬細胞分泌IL-1β[11]，這是未來研究的主要方向。

[1]Chiang CY，Van Weezenbeek C，Mori T，et al. Challenges to the global control of tuberculosis [J]. Respirology，2013，18(4)：596-604.

[2]Monack DM，Mueller A，F(xiàn)alkow S. Persistent bacterial infections：the interface of the pathogen and the host immune system [J]. Nat Rev Microbiol，2004，2(9)：747-765.

[3]Jayaraman P，Sada-Ovalle I，Nishimura T，et al. IL-1β promotes antimicrobial immunity in macrophages by regulating TNFR signaling and caspase-3 activation [J]. J Immunol，2013，190(8)：4196-204.

[5]中華醫(yī)學會. 臨床診療指南·結核病分冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：7-9.

[6]國家中醫(yī)藥管理局. 中醫(yī)病證診斷療效標準[M].南京：南京大學出版社，1994：3.

[7]王梅，陳紅兵，王波，等. 肺結核合并支氣管結核中醫(yī)證候分布規(guī)律初探 [J]. 中醫(yī)中藥，2013，10(26)：116-118.

[8]Gross O，Poeck H，Bscheider M，et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence [J]. Nature，2009，459(7245)：433-436.

[9]Mishra BB，Moura-Alves P，Sonawane A，et al. Mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6 is a potent activator of the NLRP3/ASC inflammasome [J]. Cell Microbiol，2010，12(8)：1046-1063.

[10]Mayer-Barber KD，Andrade BB，Barber DL，et al. Innate and adaptive interferons suppress IL-1α and IL-1β production by distinct pulmonary myeloid subsets during Mycobacterium tuberculosis infection [J]. Immunity，2011，35(6)：1023-1034.

[11]陳丹，劉光陵，吳雪瓊. 具有抗結核作用中藥及其成分研究進展 [J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報，2015，17(1)：128-131.

(本文編輯： 韓虹娟)

Discrepancy between IL-1β and IL-1Ra expression in CD14+monocytes of different TCM syndrome types of pulmonary tuberculosis patients

ZHANGGuo-liang，WANGLing-ling，ZHANSen-lin，etal.

InstituteofHepatology，ShenzhenThirdPeople’sHospital，Shenzhen518112，China.

ZHANGGuo-liang，E-mail：szdsyy@aliyun.com

ObjectiveTo explore the discrepancy between IL-1β and IL-1Ra expression in CD14+ monocytes of different TCM syndrome types of pulmonary tuberculosis patients. MethodsTotally 104 pulmonary tuberculosis patients were recruited，the patients were divided into Lung-Yin deficiency(n=33)，Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity(n=36)，and Qi and Yin deficiency(n=35). The density gradient centrifugation was used to separate PBMCs from peripheral blood，then CD14+ monocytes were purified after incubation with magnetic beads. Monocytes were stimulated with or without Mtb lysate for 12 hours，the supernatant was collected to detect IL-1β and IL-1Ra levels using ELISA，and total RNA was purified from cells and gene expression of IL1B and IL1RN was determined with real-time qPCR assay. Finally，the discrepancy was compared with ANOVA analysis. Results(1)The expression of IL1B and IL1RN could be detected by real-time quantitative PCR assay with gene specific primers. (2)After Mtb stimulation，IL-1β level was the highest in Lung-Yin deficiency group compared to Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity group and Qi and Yin deficiency group(P<0.05、P<0.01), and it was higher in Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity group than that in Qi and Yin deficiency group(P<0.05). There was similar pattern observed in IL1B mRNA level, and IL1B level decreased in the order of Lung-Yin deficiency, Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity, and Qi and Yin deficiency(P<0.05、0.01). (3)IL-1 Ra expression increased significantly after Mtb stimulation, it was the highest in Qi and Yin deficiency group compared to other two groups(P<0.05), and there was no difference between Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity group and Qi and Yin deficiency group(P>0.05). Similar pattern was also observed in IL1RN level，which Qi and Yin deficiency group had the highest level(P<0.05,P<0.01). (4)After Mtb stimulation，IL-1β/IL-1Ra ratio increased in Lung-Yin deficiency and Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity groups，which was higher than that in Qi and Yin deficiency(P<0.01,P<0.05). ConclusionExpression of IL-1β and IL-1Ra was associated with TCM pathogenesis evolution of pulmonary TB patients，which could be considered as biomarkers of microcosmic syndrome differentiation and effectively therapeutic targets.

Pulmonary tuberculosis；TCM syndrome types；Interleukine-1β；Interleukine-1 receptor antagonist；Monocytes

國家自然科學基金(81501714)；廣東省自然科學基金(2014A030313789)；深圳市科技計劃項目(JCYJ20140411111718166)

518112深圳市第三人民醫(yī)院肝病研究所(張國良、詹森林、汪文斐、聶廣)，結核病科(王玲玲、曹廷智、張紅梅、鄧群益)

張國良(1982- )，博士，副主任醫(yī)師。研究方向：感染病中西醫(yī)結合診治研究。E-mail：szdsyy@aliyun.com

R249

Adoi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.10.003

2016-07-04)