陳小華　邱華云　施珊珊　吳　莎　林　晨　李揚(yáng)秋

(韶關(guān)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，韶關(guān)512000)

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伊馬替尼誘導(dǎo)原代T細(xì)胞凋亡作用機(jī)制研究①

陳小華邱華云施珊珊②吳莎②林晨②李揚(yáng)秋③

(韶關(guān)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，韶關(guān)512000)

目的：研究伊馬替尼(IM)誘導(dǎo)正常人原代CD3+T細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。方法：0～100 nmol/L的IM作用原代T細(xì)胞24 h后,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Caspase-3、Caspase-8、A20和NF-κB基因表達(dá)變化；應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)A20和NF-κB蛋白表達(dá)變化。結(jié)果：IM具有明顯促T細(xì)胞凋亡能力，其凋亡分子Caspase-3 和A20基因表達(dá)水平均上調(diào)，而NF-κB的基因和蛋白水平均下調(diào)。結(jié)論：IM通過(guò)上調(diào)A20的表達(dá)誘導(dǎo)了T細(xì)胞的凋亡。

伊馬替尼；原代CD3+T細(xì)胞；TNF-α誘導(dǎo)蛋白3;核轉(zhuǎn)錄因子

慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是一類髓系增生性血液腫瘤，染色體異常是CML的直接病因，由9、22號(hào)染色體轉(zhuǎn)位而成并含有bcr/abl融合基因，該基因轉(zhuǎn)錄翻譯為BCR/ABL融合蛋白，而該融合蛋白的靶向藥物伊馬替尼(Imatinib mesylate,IM)，是目前臨床上用于治療CML慢性期的一線藥物[1,2]。但臨床研究報(bào)道其具有抑制機(jī)體免疫功能的副作用，尤其是抑制T細(xì)胞的能力[2-4]。細(xì)胞免疫在抗腫瘤中發(fā)揮重要的作用，T細(xì)胞的凋亡活動(dòng)與細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，如Caspase-3、Caspase-8、A20和NF-κB等[5]。

1　材料與方法

1.1材料1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；小牛血清購(gòu)自Hyclone；TRIzol購(gòu)自康為世紀(jì)公司；伊馬替尼購(gòu)自Sigma；逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Toyobo；細(xì)胞裂解液和BCA試劑盒購(gòu)自凱基生物公司；A20抗體購(gòu)自Abcam、NF-κB p65抗體購(gòu)自CST；凋亡試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物公司；引物由上海生工公司合成。

1.2方法

1.2.1分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所需人外周血在征得本人同意后，采自5位正常人。步驟如下：靜脈抽血10 ml，加到準(zhǔn)備好的抗凝管中，混勻。將血液轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，用PBS將血稀釋一倍[6]。稀釋好的血液沿管壁緩慢加到淋巴細(xì)胞分離液中，2 000 r/min水平離心×20 min。小心吸取單個(gè)核細(xì)胞至新離心管。PBS洗細(xì)胞2次，每次1 000 r/min×10 min。

1.2.2CD3+T細(xì)胞分選取得到的PBMCs細(xì)胞，應(yīng)用MACS技術(shù)分選CD3+T:分離緩沖液(含2 mol/L EDTA和0.5%胎牛血清)洗滌PBMCs 2次，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×107個(gè)/ml；將懸浮細(xì)胞離心棄上清，按107個(gè)總細(xì)胞加入40 μl PBS緩沖液和10 μl CD3磁珠單抗，充分混勻，4 ℃孵育15～30 min；加入1 ml緩沖液混勻，1 500 r/min離心10 min，棄上清；加入500 μl緩沖液混勻配制細(xì)胞懸液；將500 μl緩沖液緩慢流過(guò)磁柱，沖洗磁柱一遍,500 μl總細(xì)胞懸液緩慢通過(guò)磁柱，收集非CD3+細(xì)胞，將500 μl緩沖液緩慢沖洗并收集流出液，重復(fù)洗滌2遍；將磁柱從磁座移開(kāi)，更換離心管。將500 μl緩沖液加入磁柱，用推進(jìn)器用力加壓，收集CD3+T細(xì)胞。加入500 μl緩沖液重復(fù)洗滌2次，收集CD3+T細(xì)胞，將收集的CD3+T細(xì)胞計(jì)數(shù)。

表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

Tab.1Primers for Real-time fluorescence quantitative PCR

TargetAccessionNo.ForwardReverseLength(bp)β2mNMOL/L_004048.2TACACTGAATTCACCCCCACCATCCAATCCAAATGCGGCA145A20NMOL/L_001270508.1CTGGGACCATGGCACAACTCCGGAAGGTTCCATGGGATTC182NF-κBp65NMOL/L_001165412.1CCACAAGACAGAAGCTGAAGAGATACTATCTGTAAGTGAACC149Caspase-3NM_004346.3TCCTTTTCCTTTGACGCTACTTCCACCAACCAACCATTTCTTTA109Caspase-8NM_001080124.1GATTCAGAGGAGCAACCCTATTTCATCCCCAGCAGAAAGTCAG90

1.2.3細(xì)胞凋亡測(cè)定(Annexin V- PI雙染)調(diào)整原代T細(xì)胞數(shù)量為4×106個(gè)/ml，細(xì)胞懸液加入24孔板中，每孔100 μl；IM刺激組(25～100 nmol/L)；SEA聯(lián)合IM組：SEA(10 ng/ml)預(yù)處理4 h，接著IM處理24 h;同時(shí)設(shè)空白對(duì)照,每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，離心收集細(xì)胞。PBS洗一遍后重懸，送樣，正常細(xì)胞分出200 μl不染色。1 000 r/min離心5 min離心棄上清，加200 μl Binding Buffer混勻。加5 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。離心棄上清，加200 μl Binding Buffer混勻后再染色，上機(jī)。

1.2.4RNA提取將原代T細(xì)胞置于完全培養(yǎng)液中，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期的原代T細(xì)胞離心、洗滌、細(xì)胞計(jì)數(shù)后，分別接種于24孔板中，每孔2 ml，含4 × 106個(gè)細(xì)胞。分組：50 nmol/L IM刺激原代T細(xì)胞組，陰性對(duì)照組。各組復(fù)孔。持續(xù)刺激24 h后，采用異硫氰酸胍-苯酚-氯仿法提取RNA，并依據(jù)試劑盒說(shuō)明書，用隨機(jī)引物合成cDNA 第一鏈。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCRβ2m、A20和NF-κB p65亞單位基因序列根據(jù)文獻(xiàn)提取[7]，Caspase-3和Caspase-8則自己設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為20 μl，其中含上下游引物濃度為0.3 μmol/L，cDNA 1.0 μl，去離子水12.8 μl ，MasterMix 10 μl。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 3 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每循環(huán)包括95℃變性1 min，60℃退火30 s，72℃，于68℃讀板一次，最后以0.15℃/s的速度從55℃到95℃每隔1 s記錄一次熒光值，獲得融解曲線。所有反應(yīng)均在Bio-Rad實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行[7]。

1.2.6相對(duì)定量分析采用相對(duì)定量法分析各組基因表達(dá)水平的差異，以β2m為內(nèi)參對(duì)照，計(jì)算公式為相對(duì)表示量=2-ΔΔCt，其中Ct值為擴(kuò)增曲線達(dá)到閾值所需循環(huán)數(shù)，ΔCt為組內(nèi)目的基因與內(nèi)參Ct值之差，ΔΔCt為組間ΔCt之差。2-ΔΔCt<1表示基因表達(dá)減少，2-ΔΔCt>1則表示基因表達(dá)增高。

1.2.7Western blot

1.2.7.1蛋白提取反應(yīng)體系分為兩組：對(duì)照組和IM 處理組，各組復(fù)孔，24 h后收集細(xì)胞并離心，加入200 μl細(xì)胞裂解液，置冰上裂解30 min，每隔10 min輕輕振蕩1次,4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，保留上清，用BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度。

1.2.7.2SDS-PAGE電泳等量蛋白上樣(50 μg)，10% SDS-PAGE電泳,采用半干轉(zhuǎn)的方式將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜室溫封閉30 min,PBST洗滌3次，每次10 min。將膜放入新配置一抗溶液中4 ℃過(guò)夜。PBST洗3次，每次10 min，將膜放入新配置二抗溶液中，室溫下2～4 h，PBST洗3次，每次10 min，ECL室溫顯色。

2　結(jié)果

2.1IM對(duì)T細(xì)胞凋亡影響不同濃度的IM(10、50、100 nmol/L)刺激CD3+T細(xì)胞24 h后，利用Annexin V-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，50和100 nmol/L IM均可促進(jìn)T細(xì)胞凋亡，而超抗原SEA則可抑制IM對(duì)T細(xì)胞的促凋亡作用，見(jiàn)圖1。

圖1　不同濃度IM刺激CD3+T細(xì)胞24 h的凋亡作用Fig.1　Apoptosis of CD3+T cells stimulated with different concentrations of IMNote: *.P<0.05 vs control;#.P<0.05.

圖2　實(shí)時(shí)熒光定量基因融解曲線Fig.2　Real-time fluorescence quantitative PCR melt-ing curves

圖3　實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物鑒定Fig.3　Identification of RT-PCR products

2.2PCR產(chǎn)物的鑒定分析為了評(píng)估PCR反應(yīng)的特異性，對(duì)各基因(Caspase-3、Caspase-8、A20、NF-κB p65亞單位、β2m)融解曲線進(jìn)行分析，結(jié)果顯示各基因分別在80.0℃、81.5℃、85.5℃、85.0℃和85.0℃均只有一個(gè)單峰(圖2)。10 g/L瓊脂糖電泳隨機(jī)標(biāo)本中Caspase-3、Caspase-8、A20、NF-κB p65亞單位和β2m，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物片段大小分別為109、90、182、149和145 bp，說(shuō)明PCR結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤(圖3)。

2.3對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響5例正常人外周血CD3+T細(xì)胞，在50 nmol/L濃度IM作用下，Caspase-3 和A20基因的表達(dá)水平>1，表示兩者基因表達(dá)均上調(diào)；NF-κB p65亞單位基因的表達(dá)水平<1，表示NF-κB p65亞單位基因表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖4。

圖4　IM刺激T細(xì)胞24 h后基因表達(dá)情況Fig.4　Changes of gene expression after T cells stimulated by 50 nmol/L IMNote: *.P<0.05 vs control.

圖5　50 nmol/L IM刺激T細(xì)胞24 h后NF-κB p65和A20蛋白表達(dá)情況Fig.5　NF-κB and A20 protein expression after stimulated by 50 nmol/L IM for 24 h

2.4 NF-κB p65亞單位 、A20蛋白表達(dá)的情況考慮NF-κB與凋亡的關(guān)聯(lián)性，我們使用50 nmol/L濃度IM作用 T細(xì)胞24 h，與對(duì)照組相比，NF-κB p65亞單位蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)，而A20蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，這與其基因表達(dá)變化一致，見(jiàn)圖5。

3　討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是通過(guò)檢測(cè)靶基因轉(zhuǎn)錄水平，間接反映目標(biāo)蛋白表達(dá)的方法。盡管，近來(lái)有學(xué)者對(duì)該技術(shù)檢測(cè)的結(jié)果提出質(zhì)疑，但一直以來(lái)仍被許多實(shí)驗(yàn)室采用[8,9]。當(dāng)然，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)只是初步觀察變化情況，并不是唯一的觀察指標(biāo)，還需要結(jié)合其他方法加以佐證，如WB等。

IM因具有靶向抑制BCR/ABL激酶作用而作為臨床治療CML慢性期的一線藥物，但臨床使用的同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其具有抑制患者免疫功能的作用，特別是抑制T細(xì)胞激活的能力[2-4]。有文獻(xiàn)報(bào)道NF-κB信號(hào)通路與細(xì)胞的激活密切相關(guān)。毛細(xì)胞白血病(HCL)是一種罕見(jiàn)的慢性B細(xì)胞增生性疾病，Nagel等[10]報(bào)道不管是HCL細(xì)胞株還是HCL病人的樣本中，NF-κB通路均被異常激活，導(dǎo)致了B細(xì)胞的持續(xù)增生和凋亡抑制。Wei等[11]也發(fā)現(xiàn)SQSTM1基因存在于自噬缺陷的腫瘤細(xì)胞中，SQSTM1代償性地激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

NF-κB信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)，與凋亡途徑密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡涉及一系列蛋白，如Caspase家族蛋白、p53蛋白和Bcl-2家族蛋白、Survivin，其中Caspase 家族蛋白分為三大類：凋亡啟動(dòng)因子、凋亡執(zhí)行因子和炎癥介導(dǎo)因子，構(gòu)成了級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)[12]。其中Caspase-8為凋亡啟動(dòng)因子，能在其它蛋白輔助下發(fā)生自我活化并激活下游的Caspase。Caspase-3為凋亡執(zhí)行因子，作用于其特異性底物并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志。NF-κB具有抗細(xì)胞凋亡作用被許多文獻(xiàn)報(bào)道，李淑蓮等[13]發(fā)現(xiàn)在mDRA-6誘導(dǎo)白血病Jurkat細(xì)胞凋亡過(guò)程中激活了NF-κB，而激活的NF-κB能夠抑制其誘導(dǎo)凋亡的能力，表明NF-κB具有抗細(xì)胞凋亡作用?；熕幬颰MZ在治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤過(guò)程中產(chǎn)生耐藥性，Chen等[14]研究其耐藥發(fā)生的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)腫瘤的周期性缺氧(Cycling hypoxia)通過(guò)激活ROS介導(dǎo)的NF-κB，誘導(dǎo)Bcl-xL的表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的抗凋亡作用，從而產(chǎn)生對(duì)化療藥物的耐藥性[14]。

免疫應(yīng)答中，抗原與TCR結(jié)合后募集下游信號(hào)分子形成了CARMA1-BCL10-MALT1(CBM)復(fù)合物，此復(fù)合物募集泛素連接酶TRAF6，TRAF6對(duì)IKKγ泛素結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行泛素化，從而激活了下游IκB激酶(IKK)復(fù)合物和NF-κB，NF-κB進(jìn)入核內(nèi)指導(dǎo)相關(guān)炎性細(xì)胞因子基因表達(dá),合成釋放TNF-α、IL-1、IL-2等，表現(xiàn)出T細(xì)胞激活增殖。在有關(guān)信號(hào)通路途徑中，針對(duì)相關(guān)的蛋白激酶，或轉(zhuǎn)錄因子的檢測(cè)基本是在基因水平、蛋白水平或自身蛋白的磷酸化層面上。三者之間的變化關(guān)系，既有同步變化的報(bào)道也有不同步報(bào)道。如Ko[15]報(bào)道氧化銅納米粒子作用人上皮細(xì)胞可以上調(diào)MAPK的表達(dá)，而MAPK抑制劑可以下調(diào)MAPK的表達(dá)，均表現(xiàn)出基因水平、蛋白水平以及自身蛋白磷酸化水平的同步變化[15]。而Gao[16]發(fā)現(xiàn)電針刺激后五組小鼠NR2B基因、蛋白水平?jīng)]有顯著差異，但其中有兩組小鼠NR2B磷酸化水平有顯著差異。這也表明靶基因、靶蛋白與靶蛋白磷酸化水平表達(dá)變化也可以不同步。不過(guò)，尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道：僅靶基因、蛋白表達(dá)水平的變化而無(wú)靶蛋白自身磷酸化的改變。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)NF-κB基因和蛋白水平的變化情況，間接地說(shuō)明伊馬替尼可以通過(guò)TCR-CBM復(fù)合物-NF-κB-凋亡途徑誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡。

已有的研究表明[5]，A20最初是作為TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)中的一個(gè)誘導(dǎo)性蛋白而鑒定，是一個(gè)重要的NF-κB負(fù)調(diào)控因子。A20為具有去泛素化酶功能，通過(guò)抑制泛素連接酶TRAF6對(duì)IKKγ泛素化，抑制了IKK復(fù)合物的激活，從而達(dá)到抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的功能[17]。A20本身不具備促細(xì)胞凋亡的能力，而是通過(guò)抑制NF-κB的抗凋亡作用，間接表現(xiàn)其促凋亡效應(yīng)。A20表達(dá)過(guò)低或失活會(huì)導(dǎo)致NF-κB持續(xù)活化，致使多種疾病的發(fā)生。臨床上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種淋巴瘤中存在A20缺失[17,18]。Chen等[19]對(duì)143例臨床肝癌病人標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)，A20的表達(dá)與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，且A20高表達(dá)的病人具有更長(zhǎng)的無(wú)病生存期，無(wú)論是體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)均表明：促進(jìn)A20的表達(dá)均可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而敲除A20基因則正好相反，因此，A20可作為肝癌病人預(yù)后的新指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn)[19]。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IM作用正常人外周血CD3+T細(xì)胞后，具有誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的效應(yīng)(圖1)。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示Caspase-3和A20基因表達(dá)上調(diào)，NF-κB基因表達(dá)下調(diào)；Western blot結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果變化一致(圖4、5)。我們推測(cè)，IM誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制是IM可能經(jīng)TCR途徑，作用于上游負(fù)反饋蛋白A20，通過(guò)增強(qiáng)A20蛋白的功能，抑制下游P65蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制下游NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)T細(xì)胞凋亡效應(yīng)。此外，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超抗原SEA能夠拮抗IM對(duì)T細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的作用(圖1)，也佐證了IM對(duì)T細(xì)胞抑制的機(jī)制。當(dāng)然，也可能在這條信號(hào)通路中A20并非IM作用的唯一靶點(diǎn)。因此，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

綜上所述，IM能夠通過(guò)上調(diào)A20分子的表達(dá)，通過(guò)NF-κB信號(hào)途徑誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡，這不利于清除白血病殘余細(xì)胞。因此，如何逆轉(zhuǎn)IM對(duì)T細(xì)胞的抑制作用值得深入研究。

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[收稿2016-02-26修回2016-04-08]

(編輯許四平)

Mechanisms of imatinib mesylate induced apoptosis of primary T cells

CHEN Xiao-Hua,QIU Hua-Yun,SHI Shan-Shan,WU Sha,LIN Chen,LI Yang-Qiu.

Medical College of Shaoguan University，Shaoguan 512000，China

Objective:To investigate mechanism of imatinib mesylate induced apoptosis of primary CD3+T cells．Methods: The CD3+T cells were stimulated by 0-100 nmol/L imatinib for 24 h，cell apoptosis was detected by flow cytometry;Caspase-3,Caspase-8,A20 and NF-κB expression levels were detected by Real-time quantitative PCR and Western blot.Results: IM significantly increased apoptosis of T cell;Caspase-3 and A20 gene expression levels were upregulated and NF-κB expression level was downregulated both in gene and protein levels.Conclusion: IM increased apoptosis of T cell by upregulating A20 expression.

Imatinib mesylate;Primary CD3+T cells;A20；NF-κB

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.005

陳小華(1987年- )，男，碩士，助教，主要從事分子免疫學(xué)方面的研究，E-mail: 627489541@qq.com。

及指導(dǎo)教師：林晨(1961年-)，男，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事白血病發(fā)病機(jī)制的研究，E-mail: tlinc@jnu.edu.cn。

R364．1+4

A

1000-484X(2016)09-1268-05

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金(91129720)和廣東省科技計(jì)劃(國(guó)際合作)項(xiàng)目(2012B050600023)資助。

②暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)系，廣州510632。

③暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣州510632。