李樹紅，陳 恩，蔣光陽，陳治光，李 冉，楊 娟，鐘海霞

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014)

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小麥Bowman-Birk型蛋白酶抑制因子的克隆表達(dá)及其抑制魚糜凝膠軟化的效果研究

李樹紅，陳 恩，蔣光陽，陳治光，李 冉，楊 娟，鐘海霞

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014)

為探究重組小麥(Triticumturgidum)Bowman-Birk蛋白酶抑制劑(BBI)抑制活性特征及其對(duì)鰱魚肌原纖維蛋白自溶反應(yīng)的抑制效果，采用TA克隆技術(shù)克隆小麥BBI成熟肽基因片段，并對(duì)原核表達(dá)的小麥BBI蛋白進(jìn)行鎳親和層析純化，利用SDS-PAGE、TSK-GEL G2000SWxl高效液相色譜檢測(cè)誘導(dǎo)及純化效果。在測(cè)定重組小麥BBI對(duì)胰蛋白酶的抑制活性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過SDS-PAGE分析了重組BBI對(duì)鰱魚肌原纖維蛋白自溶反應(yīng)的抑制作用。結(jié)果表明，經(jīng)雙酶切鑒定證實(shí)成功獲得了BBI成熟肽基因片段，該基因與野生二粒小麥BBI相關(guān)基因(GenBank登錄號(hào)EU346892.1)序列相似性為99.63%。目的蛋白在SDS-PAGE及TSK-GEL G2000SWxl高效液相色譜分析中，分別表現(xiàn)為單一帶和單一峰，產(chǎn)物得到有效純化，分子量約10.5 kD。該重組小麥BBI對(duì)胰蛋白酶有明顯的抑制活性。添加量5 μg·mg-1重組BBI可顯著抑制鰱魚肌原纖維蛋白(尤其是肌球蛋白重鏈)在pH 7.5，50 ℃下的自溶。

小麥BBI；克隆表達(dá)；純化；抑制活性；魚糜凝膠軟化

絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serine Protease Inhibitor, SPI)作為主要的生物蛋白酶抑制劑之一，對(duì)調(diào)節(jié)蛋白酶活性和蛋白質(zhì)代謝具有重要作用。根據(jù)抑制劑的氨基酸排列順序、拓樸學(xué)性質(zhì)及結(jié)合機(jī)制，可將絲氨酸蛋白酶抑制因子超家族分為16個(gè)家族[1]。植物中已發(fā)現(xiàn)的7個(gè)家族，主要以Bowman-Birk家族、Serpin家族、Kunitz家族研究最多[1]。

Bowman-Birk型蛋白酶抑制因子(BBI)由Bowman于1944年首次從大豆中分離，Birk于1961年純化并定義[2]。雙子葉植物如(豇豆[3]、綠豆[4])來源的BBI的共同結(jié)構(gòu)特征是均具有一個(gè)結(jié)構(gòu)域，但同時(shí)有兩個(gè)獨(dú)立的、可與兩種不同蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)結(jié)合的活性中心，因此也被稱為雙頭抑制因子[5-7]。目前對(duì)雙子葉植物源BBI的克隆表達(dá)、結(jié)構(gòu)分析、生理活性等研究較為全面，并且發(fā)現(xiàn)其在抗蟲[8]、輻射保護(hù)[9]、抗腫瘤[10]等領(lǐng)域均有潛在作用。單子葉禾本科植物來源的BBI結(jié)構(gòu)域相對(duì)復(fù)雜，根據(jù)目前已知單子葉植物BBI的抑制活性特征，可基本將其分為2類：第一類主要是抑制胰蛋白酶，這類抑制劑一般含有1～3個(gè)序列高度相似的結(jié)構(gòu)域[11-15]；第二類為只有一個(gè)結(jié)構(gòu)域的WIP1(Wound-induced protein)蛋白[16-18]，其N端具有保守的抑制反應(yīng)位點(diǎn)。

目前對(duì)禾本科單子葉植物水稻、玉米BBI的研究已有報(bào)道，但對(duì)麥類來源的BBI研究卻寥寥無幾，對(duì)其生物學(xué)性質(zhì)、生理功能及可能的應(yīng)用前景了解甚微。目前僅有對(duì)大麥(HordeumvulgareL.)BBI晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道[19]，闡明了16 kD單子葉植物大麥源BBI的三維結(jié)構(gòu)。此外，對(duì)栽培品種小麥(SR3)中一耐鹽相關(guān)基因進(jìn)行了克隆，并根據(jù)基因結(jié)構(gòu)，推測(cè)其為一類BBI[20]。但是對(duì)該抑制劑蛋白的純化、分子量、活性特征等未進(jìn)行系統(tǒng)研究。目前對(duì)麥類來源BBI除探索其在作物病害防治領(lǐng)域[21-22]的潛在作用外，未見其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

鰱魚(Hypophthalmihthysmolitrix)是我國(guó)的重要淡水經(jīng)濟(jì)魚種，年產(chǎn)量達(dá)385.09萬t，居全國(guó)淡水養(yǎng)殖的第二位[23]。鰱魚價(jià)格低廉，且肉色潔白，因此開發(fā)具有高附加值的魚糜制品前景較好。然而鰱魚魚糜容易發(fā)生熱誘導(dǎo)的魚糜凝膠軟化[24-25]。目前研究表明，軟化主要是由肌原纖維結(jié)合的絲氨酸蛋白酶(MBSP)[26]和內(nèi)源半胱氨酸組織蛋白酶 B、L、L-like、H[27]水解魚糜蛋白的肌球蛋白重鏈(MHC)等肌原纖維蛋白導(dǎo)致的。

本課題組已經(jīng)報(bào)道了小分子半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs)可顯著抑制半胱氨酸蛋白酶引起的肌球蛋白的降解、抑制鰱魚自身魚糜的凝膠軟化[28]。蔣欣靜[6]、張 賓[29]、Sun L C[30]等也報(bào)道了雙子葉植物大豆、綠豆源BBI對(duì)MBSP活性有抑制作用，推測(cè)其可用于魚糜制品凝膠彈性品質(zhì)改良。但對(duì)單子葉植物麥類來源的BBI防止魚糜結(jié)構(gòu)蛋白水解及魚糜凝膠軟化方面的研究尚未見報(bào)道。

為此，本研究在克隆、原核表達(dá)小麥BBI的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)層析純化的重組小麥BBI的活性特征進(jìn)行分析，探討其對(duì)鰱魚肌原纖維蛋白自溶的抑制作用，為深入研究麥類來源BBI的性質(zhì)及其對(duì)鰱魚魚糜制品彈性品質(zhì)的改良效應(yīng)提供理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材 料

小麥(人工合成六倍體SHW-L1)BBI的cDNA、表達(dá)質(zhì)粒pET-30a、感受態(tài)大腸桿菌E.coliDH5α、感受態(tài)大腸桿菌E.coliBL21(DE3) 均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1BBI基因特異性引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)野生二粒小麥(Triticumdicoccoidessubsp.)中可能與損傷誘導(dǎo)(wound-induced)相關(guān)的BBI基因序列(GenBank登錄號(hào)：EU346892.1)設(shè)計(jì)小麥BBI成熟肽基因引物，上游引物為：5′-GGAATTCCATATGAAGAGCACCAAGCT-3′，下劃線部分為NdeⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物為：5′-CCGCTCGAGGTGCTTTTTGCATGGC-3′，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

1.2.2BBI基因分子克隆

以小麥(人工合成六倍體SHW-L1)BBI的cDNA為模板，利用BBI引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min)；1.2%的瓊脂糖電泳。將純化回收的目的基因連接至載體pMD19-T，得到重組質(zhì)粒BBI-pMD19-T；將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliDH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，將陽性克隆送Invitergen生物公司進(jìn)行測(cè)序(以T7引物擴(kuò)增、雙向全長(zhǎng)測(cè)序)。

1.2.3表達(dá)載體BBI-pET-30a的構(gòu)建及重組菌的表達(dá)

重組質(zhì)粒BBI-pMD19-T和pET-30a分別經(jīng)雙酶切后，回收目的基因片段和載體片段，16 ℃連接16 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliBL21，以BBI成熟肽引物進(jìn)行PCR檢測(cè)和雙酶切鑒定。

將成功轉(zhuǎn)入BBI-pET-30a的E.coliBL21(DE3)重組菌株37 ℃培養(yǎng)，當(dāng)OD600為0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)，37 ℃分別誘導(dǎo)培養(yǎng)0、1、2、3、4 h；離心收集菌體，經(jīng)洗滌液洗滌、離心后，1 mg菌體加入3 mL裂解液，重懸沉淀；反復(fù)凍融3次，1 mg菌體加入1 mL溶菌酶(100 mg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)30 min；超聲破碎菌體，8 000 r·min-1離心10 min，收集上清液用于純化、鑒定。

1.2.4重組小麥BBI的純化和鑒定

將1.2.3中的上清液分別經(jīng)截留分子量為30 kD和3 kD的超濾膜進(jìn)行濃縮(4 ℃)，收集3～30 kD蛋白液，經(jīng)鎳親和層析純化、回收目的蛋白，SDS-PAGE[31]鑒定重組BBI的誘導(dǎo)及純化效果。通過TSK G2000 SWxl凝膠柱高效液相層析對(duì)重組BBI進(jìn)行純度鑒定。

1.2.5重組小麥BBI對(duì)胰蛋白酶的抑制活性測(cè)定

參照Schwert等[32]的方法略作修改。以1 mmol·L-1的對(duì)甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯(TAME)為底物，在25 ℃下，247 nm處連續(xù)掃描測(cè)定胰蛋白酶酶反應(yīng)和重組小麥BBI的抑制反應(yīng)的紫外吸光值。計(jì)算ΔA247/min，求得酶反應(yīng)速度。調(diào)節(jié)BBI加量范圍，測(cè)定該加量范圍內(nèi)的殘余酶活百分比。

1.2.6重組BBI對(duì)鰱魚肌原纖維蛋白自溶反應(yīng)的抑制作用分析

鰱魚肌原纖維蛋白的制備參考Aranishi等[33]的方法。取一定量的肌原纖維蛋白沉淀，按1∶2.5的比例懸浮于100 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)中，按1 mg鰱魚肌原纖維蛋白添加5 μg重組BBI(對(duì)照組不加)，于50 ℃進(jìn)行自溶反應(yīng)。分別于反應(yīng)0、0.5、1、3、6、9、12和24 h后從對(duì)照組和試驗(yàn)組中取樣10 μL，與等體積的終止液(2% SDS，8 mol·L-1脲，5% β-巰基乙醇，0.005%溴酚藍(lán)，20 甘油，62.5 mmol·L-1pH 6.8 Tris-HCl)混合，煮沸5 min，作為電泳樣品，SDS-PAGE電泳采用12%的分離膠。

2　結(jié)果與分析

2.1小麥BBI基因的擴(kuò)增結(jié)果

小麥BBI基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳成像后，結(jié)果如圖1所示，在270 bp左右可以看到與預(yù)期片段大小一致的清晰目的條帶。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：小麥BBI cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。

M:DNA Marker;1:Wheat BBI cDNA amplification.

圖1小麥BBI cDNA PCR擴(kuò)增圖

Fig.1Electrophoresis results of PCR amplification of wheat BBI cDNA

2.2小麥BBI基因的克隆及測(cè)序結(jié)果

采用DNAman 8.0軟件分析目的基因的序列，并推導(dǎo)其氨基酸序列，結(jié)果如圖2?？寺〉玫降腂BI基因序列長(zhǎng)270 bp，編碼90個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量約為9.6 kD，等電點(diǎn)為8.75。該基因序列與野生二粒小麥WIP1型BBI(Genebank登錄號(hào)：EU346892.1)基因序列相似性為99.63%，推測(cè)的氨基酸序列相似性為100%。

與其他常見單子葉或雙子葉植物源BBI相關(guān)基因的編碼氨基酸序列比對(duì)，本試驗(yàn)所得基因編碼序列與二棱型啤酒大麥(Hordeumvulgaresubsp. vulgare，GenBank登錄號(hào)AK375535.1)BBI的氨基酸序列相似性最高，為97.78%；與面包小麥(Triticumaestivum)鋁脅迫誘導(dǎo)基因 wail3(GenBank登錄號(hào)L11881.1)、 wail5(GenBank登錄號(hào)L11882.1)和 wail6(GenBank登錄號(hào)L28009.1)編碼的氨基酸序列(WIP1型蛋白)相似性分別為65.56%、87.78%、65.56%；與水稻(Oryzasativa, GenBank登錄號(hào)U76004.1)BBI氨基酸的相似性為42.31%；與玉米(Zeamays, GenBank登錄號(hào)NM001112240.1)WIP1型BBI有34.29%的氨基酸序列一致。與大豆(Glycinemax, GenBank登錄號(hào)NM001251618.1)及綠豆(Vignaradiata, GenBank登錄號(hào)GU121097.1)BBI氨基酸序列的相似性僅分別為22.00%、18.56%(圖3)?？梢娖渑c小麥類WIP1型BBI的序列相似性很高，推測(cè)為小麥WIP1型BBI。

由小麥BBI的 cDNA序列推測(cè)的氨基酸序列中含有大量位置保守的半胱氨酸(Cys)殘基，分別為Cys32、Cys33、Cys36、Cys45、Cys52、Cys56、Cys59、Cys72、Cys83和Cys87，推測(cè)其可形成5個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。

圖2　小麥BBI的基因序列和推測(cè)的氨基酸序列

黑色陰影背景表示相同的氨基酸殘基，灰色陰影背景表示相似的氨基酸殘基; *表示推導(dǎo)的活性中心。

Identical amino acid residues are darkly shaded, and similar amino acids are lightly shaded;The active sites are marked by asterisk*.

圖3小麥BBI基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他植物源BBI的類比分析

Fig.3Multiple alignment of amino acid sequences derived from sequences of BBI of wheat and other plant

2.3表達(dá)載體BBI-pET-30a的構(gòu)建及BBI的表達(dá)純化

由圖4可知，與未經(jīng)誘導(dǎo)相比，IPTG誘導(dǎo)4 h后轉(zhuǎn)入BBI-pET-30a的重組菌株E.coliBL21在10.5 kD處條帶明顯，說明在本試驗(yàn)條件下，誘導(dǎo)4h目標(biāo)基因的表達(dá)量最大。對(duì)誘導(dǎo)4h的菌體進(jìn)行超聲破碎，其上清液經(jīng)過超濾濃縮及鎳柱層析純化后，取層析吸附部分進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)(圖5)及高效液相檢測(cè)(圖6)。鎳親和層析吸附部分在電泳圖上呈現(xiàn)10.5 kD的單一條帶；其進(jìn)一步經(jīng)TSK-GEL G2000SWxl高效液相色譜檢測(cè)，在保留時(shí)間25.68 min處出現(xiàn)單一蛋白峰。

M:Marker; 1:BBI重組菌誘導(dǎo)0 h; 2、3:BBI重組菌誘導(dǎo)1 h; 4、5:BBI重組菌誘導(dǎo)2 h; 6、7:BBI重組菌誘導(dǎo)3 h; 8、9:BBI重組菌誘導(dǎo)4 h。

M:Marker; 1:Recombinant BBI induced for 0 h; 2 and 3:Recombinant BBI induced for 1h; 4 and 5:Recombinant BBI induced for 2 h; 6 and 7:Recombinant BBI induced for 3 h; 8 and 9:Recombinant BBI induced for 4 h.

圖4不同誘導(dǎo)時(shí)間重組BBI的SDS-PAGE鑒定結(jié)果

Fig.4Detection of expressed BBI at different

induced time by SDS-PAGE

M:Marker; 1、2:菌體破碎后3～30 kD超濾液; 3、4:3～30 kD超濾液鎳親和層析吸附部分。

M:Marker; 1 and 2:BBI extract by 3-30 kD ultrafiltration after breaking down the recombinedE.coli; 3 and 4:BBI extract by Ni2+-NTA agarose affinity after 3-30 kD ultrafiltration.

圖5BBI純化后的SDS-PAGE鑒定結(jié)果

Fig.5Detection of purified BBI by SDS-PAGE

圖6　重組小麥BBI層析吸附樣的TSK-GEL G2000SWxl凝膠高效液相層析

2.4重組小麥BBI對(duì)胰蛋白酶的抑制活性

重組小麥BBI對(duì)胰蛋白酶的活性有明顯抑制作用，隨著小麥BBI加入量的增大，胰蛋白酶活性逐漸下降(圖7)。

2.5重組BBI對(duì)鰱魚肌原纖維蛋白自溶反應(yīng)的抑制作用

本試驗(yàn)制備的鰱魚背肌肌原纖維蛋白質(zhì)濃度為4.6 mg·mL-1。205 kD處為肌球蛋白重鏈(MHC)。

向鰱魚肌原纖維蛋白溶液中添加5 μg·mg-1重組BBI后，肌原纖維蛋白自溶結(jié)果見圖8。 由圖8B可知，對(duì)照組自溶0.5 h后，形成魚糜凝膠結(jié)構(gòu)的主要蛋白―肌球蛋白重鏈(MHC)已開始自溶，12h后MHC分解十分顯著，24 h后MHC消失殆盡。在重組BBI存在下(圖8A)，即使自溶反應(yīng)3 h后，MHC的分解也不明顯；自溶12 h后才發(fā)生比較明顯的水解，但相對(duì)對(duì)照組而言，這種水解很輕微。表明重組BBI能夠十分有效地抑制肌原纖維蛋白中MHC的自溶。

圖7　重組小麥BBI對(duì)胰蛋白酶的抑制活性

1：自溶0 h；2:自溶0.5 h；3：自溶1 h；4：自溶3 h；5：自溶6 h；6：自溶9 h；7：自溶12 h；8：自溶24 h。

1:Autolysis for 0 h; 2:Autolysis for 0.5 h;3:Autolysis for 1 h; 4:Autolysis for 3 h; 5:Autolysis for 6 h; 6:Autolysis for 9 h; 7:Autolysis for 12 h; 8:Autolysis for 24 h.

圖8有(A)、無(B)重組BBI的鰱魚肌原纖維蛋白自溶SDS-電泳圖

Fig.8SDS-PAGE of silver carp myofibrillar protein autolysis with(A) and without(B) recombinant BBI

3　討 論

本研究以cDNA為模板，成功克隆了小麥(人工合成六倍體SHW-L1)BBI基因，該小麥BBI序列中含有大量的半胱氨酸殘基Cys，可形成5個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。由其中兩對(duì)二硫鍵分別各自連接9個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的環(huán)形結(jié)域，形成了BBI蛋白酶抑制劑家族的雙頭抑制區(qū)[10]。通過序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與單子葉植物BBI氨基酸序列具有很高相似性，與野生二粒小麥(Genebank登錄號(hào)EU346892.1)、二棱型啤酒大麥(GenBank登錄號(hào)AK375535.1)及面包小麥鋁脅迫誘導(dǎo)基因 wail5(GenBank登錄號(hào)L11882.1)BBI的氨基酸序列相似性最高，分別為100%、97.78%和87.78%。序列的分子量和結(jié)構(gòu)特征與其他多種單子葉植物源單結(jié)構(gòu)域BBI保持一致，表明該小麥基因可能屬于WIP1型的BBI類蛋白。

單子葉植物BBI和雙子葉植物BBI的結(jié)構(gòu)存在較大區(qū)別。大多數(shù)雙子葉植物的BBIs含有14個(gè)保守的半胱氨酸殘基和7對(duì)二硫鍵(C1-C14，C2-C6，C3-C13，C4-C5，C7-C9，C8-C12，C10-C11);而來源于單子葉植物分子量為8 kD的WIP1型BBI在進(jìn)化過程中可能會(huì)丟失2個(gè)(C10、C11)或4個(gè)(C3、C10、C11、C13或C4、C5、C10、C11)半胱氨酸殘基[12]。本研究克隆的小麥BBI與此相似，即與雙子葉植物BBI相比，丟失了4個(gè)半胱氨酸殘基，含有10個(gè)半胱氨酸殘基，能形成5對(duì)二硫鍵。

雙子葉植物BBI的特征是一個(gè)結(jié)構(gòu)域，包含2個(gè)結(jié)合不同絲氨酸蛋白酶的活性位點(diǎn)，如大豆(Genebank登錄號(hào)：NM001251618.1)的BBI，一個(gè)在Lys16-Ser17可以和胰蛋白酶結(jié)合，另一個(gè)在Leu44-Ser45可與胰凝乳蛋白酶結(jié)合[34]。目前對(duì)小麥源BBI研究較少，之前報(bào)道的面包小麥鋁脅迫誘導(dǎo)基因 wail3、wail5和 wail6編碼蛋白的第一個(gè)活性中心可能為Phe39-Ser40，第二個(gè)活性中心可能位于Pro64-Ser65[35]。玉米WIP1型損傷誘導(dǎo)基因編碼蛋白的第一個(gè)活性中心可能為Phe54-Ser55，第二個(gè)活性中心可能位于Tyr82-Ser83[17]。因此，推測(cè)本研究克隆的小麥BBI可能有兩個(gè)活性中心，分別在Phe39-Ser40、Pro64-Ser65。

也有研究認(rèn)為單子葉植物BBI只有一個(gè)抑制活性中心，其結(jié)構(gòu)域與雙子葉BBI最大的構(gòu)象差別在于每個(gè)結(jié)構(gòu)域C端的回環(huán)，該回環(huán)在雙子葉BBI中對(duì)應(yīng)胰凝乳蛋白酶抑制反應(yīng)回環(huán)，而由于單子葉BBI的回環(huán)附近少了一對(duì)類似雙子葉中的二硫鍵的約束，導(dǎo)致其構(gòu)象變得很松散，影響其結(jié)合或抑制任何蛋白酶[19]。單子葉栽培品種大麥(HordeumvulgareL.)中純化的一種BBI蛋白，具有雙結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域只具有一個(gè)活性中心，且兩個(gè)活性中心Arg17和Arg76，都僅抑制胰蛋白酶[19]。本研究克隆的小麥BBI對(duì)胰蛋白酶具有明顯抑制活性，其僅有N端的一個(gè)活性中心具有抑制作用還是兩個(gè)活性中心都具有抑制相同酶活性的作用，還有待進(jìn)一步研究。

對(duì)重組小麥BBI進(jìn)行原核表達(dá)和純化后，經(jīng)TSK-GEL G2000SWxl凝膠高效液相層析檢測(cè)，在保留時(shí)間25.68 min左右處出現(xiàn)單一活性蛋白峰。經(jīng)SDS-PAGE分析，顯示該肽段分子量為10.5 kD，與預(yù)測(cè)分子量9.6 kD接近。活性測(cè)定分析表明，純化的重組BBI明顯抑制了典型絲氨酸蛋白酶—胰蛋白酶的活性，說明該蛋白對(duì)絲氨酸蛋白酶具有抑制作用。

通過比較重組小麥BBI的氨基酸同源性、保守序列與活性中心位置以及其對(duì)絲氨酸蛋白酶活性的抑制作用，將其歸類為WIP1型的BBI。

肌原纖維蛋白中的MHC是魚糜蛋白的主要成分。魚糜加熱凝膠化過程中，MHC發(fā)生有序交聯(lián)形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是形成魚糜凝膠制品彈性品質(zhì)的重要條件[36]。鰱魚魚糜適宜凝膠化的pH條件為pH 7.5，在加熱過程中容易發(fā)生凝膠軟化的溫度為50 ℃[24-25]，此條件下，添加足量純化的重組BBI后，相對(duì)于對(duì)照，鰱魚肌原纖維蛋白中MHC的自溶得到顯著抑制，說明有絲氨酸蛋白酶參與了鰱魚MHC的自溶。

本研究報(bào)道的重組BBI能夠有效抑制鰱魚MHC的自溶，推測(cè)其在抑制魚糜制品凝膠軟化方面也將具有重要意義。研究結(jié)果可為探索小麥來源BBI生物活性及其進(jìn)一步在魚糜制品中的應(yīng)用奠定必要的理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)方法。

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Cloning, Expression and Purification of Wheat Bowman-Birk Inhibitor and the Inhibitory Effect on Surimi Gel Softening

LI Shuhong，CHEN En，JIANG Guangyang，CHEN Zhiguang，LI Ran，YANG Juan，ZHONG Haixia

(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

In order to explore the inhibitory activity and inhibitory effect on autolysis reaction of silver carp myofibrillar protein of recombinant wheat BBI, TA cloning was used to clone BBI gene fragment which encoded mature peptide of wheat. The target protein was purified with Ni2+-NTA agarose affinity chromatography after prokaryotic expression system. SDS-PAGE and HPLC of TSK-GEL G2000SWxl were conducted to examine the purified product. On the basis of inhibitory activity of recombinant BBI to trypsin, SDS-PAGE was conducted to analyze the inhibitory effects of BBI on autolysis reaction of silver carp myofibrillar protein. The results of double enzyme cutting indicated that BBI gene fragment was successfully cloned, which shared the sequence identity of 99.63% with the gene related to BBI of wild emmer (GenBank accession No.EU346892.1). The target protein of wheat BBI was purified highly and performed a single band about 10.5 kD and a sharp peak respectively on SDS-PAGE and HPLC of TSK-GEL G2000SWxl.Activity assay revealed that wheat BBI can inhibit trypsin.The analysis about autolysis reaction of silver carp myofibrillar protein at pH 7.5 and 50 ℃ on SDS-PAGE indicated that the degradation of the major textural protein in surimi, myosin heavy chain, was suppressed significantly by the recombinant inhibitor with the concentration of 5 μg·mg-1.

Wheat BBI; Cloning and expression; Purification; Inhibitory activity; Surimi gel softening

2016-01-28

2016-04-07

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014NZ0003)

E-mail：lish@sicau.edu.cn(李樹紅)；chen663@foxmail.com(陳 恩，與第一作者同等貢獻(xiàn))

李樹紅(E-mail：lish@sicau.edu.cn)

S512.1；S312

A

1009-1041(2016)09-1241-08

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-08-31

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160831.1651.032.html