潘　瓊，任　凱，崇殿龍，張智瑞，周　燦，劉　浩，趙素容

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

3-溴丙酮酸對(duì)肝癌Bel7402細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

潘瓊，任凱，崇殿龍，張智瑞，周燦，劉浩，趙素容

目的：觀察糖酵解抑制劑3-溴丙酮酸對(duì)肝癌Bel7402細(xì)胞凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。方法：采用MTT法檢測(cè)3-溴丙酮酸對(duì)Bel7402細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)，PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度3-溴丙酮酸(0、50、100、200 μmol/L)對(duì)Bel7402細(xì)胞凋亡的影響，ATP檢測(cè)試劑盒分析細(xì)胞內(nèi)ATP水平，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果：3-溴丙酮酸可濃度和時(shí)間依賴性地抑制Bel7402細(xì)胞的增殖(P<0.01)，作用24、48、72 h的IC50值分別為422.9、143.9、85.0 μmol/L。3-溴丙酮酸可誘導(dǎo)Bel7402細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡，50、100、200 μmol/L 3-溴丙酮酸作用24 h的細(xì)胞凋亡率均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。ATP水平檢測(cè)結(jié)果表明，3-溴丙酮酸可明顯降低Bel7402細(xì)胞內(nèi)的ATP水平(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示，3-溴丙酮酸可下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)，并上調(diào)凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax的表達(dá)。結(jié)論：3-溴丙酮酸具有誘導(dǎo)肝癌Bel7402細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)引起細(xì)胞內(nèi)ATP降低、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)。

肝臟腫瘤；3-溴丙酮酸；細(xì)胞凋亡

肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率高。我國(guó)是全球肝癌發(fā)病率和病死率最高的國(guó)家，肝癌患者約占全球的55%。手術(shù)治療是肝癌的首選治療方式，然而，許多患者由于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、肝功能不全、健康狀況差等原因而無(wú)法手術(shù)切除，使藥物治療在降低腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及延長(zhǎng)患者帶瘤生存期等方面起著十分重要的作用。研究[1-4]發(fā)現(xiàn)，糖酵解抑制劑3-溴丙酮酸對(duì)肝癌、鼻咽癌、乳腺癌等顯示了良好的抗腫瘤效應(yīng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞有高度的選擇性，且能殺傷耐藥的腫瘤細(xì)胞，其作為抗腫瘤新藥的研究引起了廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)研究3-溴丙酮酸對(duì)肝癌Bel7402細(xì)胞凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技公司，3-溴丙酮酸、MTT、PI購(gòu)自Sigma公司，Bcl-2、Bax、β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG購(gòu)自博士德生物工程公司，ATP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司。

1.2細(xì)胞株肝癌細(xì)胞株Bel7402由中山大學(xué)惠贈(zèng)。培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bel7402細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔8×103個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)過(guò)夜待細(xì)胞充分貼壁后換液加入不同濃度的3-溴丙酮酸(25、50、100、200、400 μmol/L)，另設(shè)溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入15 μL MTT溶液繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(A570 nm)，計(jì)算細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率(%) =(處理組A570 nm-空白組A570 nm)/(對(duì)照組A570 nm-空白組A570 nm)×100%。

1.4PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡將Bel7402細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后換液加入不同濃度的3-溴丙酮酸(50、100、200 μmol/L)處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗1次，加預(yù)冷的75%乙醇于4 ℃或-20 ℃固定過(guò)夜。檢測(cè)前用PBS洗2次，將細(xì)胞重懸于含PI(50 μg/mL)和RNase A(100 μg/mL)的PBS中，室溫避光孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)具sub-G0/G1期DNA含量的細(xì)胞比例。

1.5細(xì)胞內(nèi) ATP水平檢測(cè)將Bel7402細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后換液加入終濃度為50、100、200 μmol/L的3-溴丙酮酸處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔。處理4 h后收集細(xì)胞。采用ATP檢測(cè)試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行操作，以酶標(biāo)儀測(cè)定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值。用實(shí)驗(yàn)組的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值與對(duì)照組的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值的比值確定各組的細(xì)胞內(nèi)ATP水平。

1.6Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的表達(dá)將Bel7402細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至90%匯合后，換液加入終濃度為50、100、200 μmol/L的3-溴丙酮酸處理細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，每孔加入50 μL預(yù)冷的RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組取40～50 μg蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫封閉2～3 h，一抗4 ℃過(guò)夜或室溫孵育2～3 h，TBST 洗膜3次，相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3次，化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)試劑盒顯影，Bio-Rad 凝膠成像儀對(duì)膜進(jìn)行曝光獲取圖像。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.13-溴丙酮酸對(duì)肝癌Bel7402細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果表明，3-溴丙酮酸在25～400 μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)Bel7402細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用(P<0.01)，且具有時(shí)間和濃度依賴性，作用24、48、72 h的IC50值分別為422.9、143.9、85.0 μmol/L(見(jiàn)表1)。

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較**P<0.01；與50 μmol/L比較△P<0.05，△△P<0.01；與100 μmol/L比較#P<0.05，##P<0.01

2.23-溴丙酮酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用結(jié)果表明，與相應(yīng)對(duì)照組比較，50、100、200 μmol/L的3-溴丙酮酸可誘導(dǎo)Bel7402細(xì)胞發(fā)生顯著的細(xì)胞凋亡(P<0.01)，并隨著3-溴丙酮酸濃度增加，其細(xì)胞凋亡率亦顯著增高(P<0.01)(見(jiàn)表2、圖1)。

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較**P<0.01；與50 μmol/L比較△△P<0.01；與100 μmol/L比較##P<0.01

2.33-溴丙酮酸對(duì)Bel7402細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響3-溴丙酮酸能特異性抑制糖酵解過(guò)程的限速酶己糖激酶Ⅱ的活性，使細(xì)胞因ATP供應(yīng)不足而死亡[5]。與相應(yīng)對(duì)照組比較，50、100、200 μmol/L 3-溴丙酮酸作用4 h均可明顯降低Bel7402細(xì)胞內(nèi)的ATP水平(P<0.01)，并隨著3-溴丙酮酸濃度增加，Bel7402細(xì)胞內(nèi)的ATP水平顯著降低(見(jiàn)表3)。

表3　3-溴丙酮酸對(duì)Bel7402細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較**P<0.01；與50 μmol/L比較△△P<0.01；與100 μmol/L比較##P<0.01

2.43-溴丙酮酸對(duì)Bel7402細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響結(jié)果表明，3-溴丙酮酸可下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax的表達(dá)(見(jiàn)圖2)。

3　討論

正常細(xì)胞主要通過(guò)氧化磷酸化過(guò)程提供能量，而多數(shù)腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下也仍以糖酵解作為主要的產(chǎn)能方式，這一現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)。由于糖酵解過(guò)程產(chǎn)生的能量比經(jīng)由氧化磷酸化產(chǎn)生的能量少得多，是一種非常低效的產(chǎn)能方式，故保持高水平的糖酵解活性對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)十分重要。因此靶向有氧糖酵解而選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤策略具有廣泛的臨床開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景[6-7]。己糖激酶，特別是己糖激酶Ⅱ在維持腫瘤細(xì)胞高糖酵解活性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。3-溴丙酮酸可抑制己糖激酶Ⅱ的活性，引起細(xì)胞內(nèi)ATP耗竭而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，而對(duì)依賴氧化磷酸化供能的正常細(xì)胞幾乎無(wú)毒性作用，其抗腫瘤作用近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3-溴丙酮酸可明顯降低Bel7402細(xì)胞內(nèi)的ATP水平，導(dǎo)致細(xì)胞因能量供應(yīng)不足而死亡。

Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，包括凋亡抑制蛋白和凋亡誘導(dǎo)蛋白，前者主要有Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL等，后者主要為Bax、Bak、Bad等[9]。凋亡抑制蛋白保護(hù)線粒體膜的完整性，而凋亡誘導(dǎo)蛋白促使凋亡因子如細(xì)胞色素C、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子、第二線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑等的釋放，最終通過(guò)激活caspase激酶而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到，50、100、200 μmol/L 3-溴丙酮酸處理Bel7402細(xì)胞24 h，可下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)，而上調(diào)凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax的表達(dá)，從而使線粒體膜的通透性增加以及凋亡因子的釋放增多而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)觀察了3-溴丙酮酸對(duì)肝癌Bel7402細(xì)胞增殖及凋亡的影響，結(jié)果表明，3-溴丙酮酸對(duì)Bel7402細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其促凋亡作用可能與藥物引起細(xì)胞內(nèi)ATP降低、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)相關(guān)。

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(本文編輯劉夢(mèng)楠)

Effects of 3-bromopyruvate on apoptosis and the expression of apoptosis-related proteins in liver carcinoma Bel7402 cells

PAN Qiong,REN Kai,CHONG Dian-long,ZHANG Zhi-rui,ZHOU Can,LIU Hao,ZHAO Su-rong

(FacultyofPharmacy,BengbuMedicalCollege,AnhuiEngineeringTechnologyResearchCenterofBiochemicalPharmaceuticals,BengbuAnhui233030,China)

Objective:To investigate the effect of 3-bromopyruvate on the apoptosis of liver carcinoma cells,and its underlying mechanisms.Methods:The proliferative inhibition of Bel7402 cells treated with 3-bromopyruvate was measured by MTT assay.The cells were treated with different concentrations of 3-bromopyruvate( 0,50,100,200 μmol/L ),and apoptosis was analyzed by flow cytometry with PI staining.The intracellular ATP level was detected by commercial kit.The expression of Bcl-2 and Bax protein was analyzed by Western blot.Results:3-bromopyruvate inhibited the proliferation of Bel7402 cells in a time and concentration dependent manner,with an IC50value of 422.9,143.9,85.0 μmol/L at 24,48 and 72 h,respectively.3-Bromopyruvate also induced obvious apoptosis in Bel7402 cells.The apoptotic rate of 50,100,200 μmol/L of 3-bromopyruvate treatment for 24 h was significantly different from that of the control group(P<0.01).At the same time,3-bromopyruvate significantly decreased the intracellular ATP level(P<0.01).The result of Western blot showed that 3-bromopyruvate down-regulated the expression of antiapoptotic protein Bcl-2,and up-regulated the expression of proapoptotic protein Bax in Bel7402 cells.Conclusions:3-bromopyruvate can induce apoptosis in Bel7402 cells,which may be correlated to the inadequate ATP supply,down-regulation of Bcl-2,and up-regulation of Bax.

liver neoplasms;3-bromopyruvate;apoptosis

2015-08-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81372899)；安徽省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(KJ2016A486)；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(201510367035)；蚌埠醫(yī)學(xué)院科研基金項(xiàng)目(BYKY1408ZD)

單位] 蚌埠醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 蚌埠 233030

[作者簡(jiǎn)介] 潘瓊(1991-)，女，2010級(jí)本科生，2015級(jí)碩士研究生.

趙素容，博士，碩士研究生導(dǎo)師，副教授.E-mail：inwindangel@qq.com

1000-2200(2016)09-1129-04

R 735.7

ADOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.09.003