蔡　曼，李衛(wèi)華，王　娟，王旭文，孔憲輝，余　渝，劉　麗*

(1 石河子大學/新疆兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，新疆石河子 832003；2 新疆農(nóng)墾科學院棉花研究所/農(nóng)業(yè)部西北內(nèi)陸區(qū)棉花生物學與遺傳育種重點實驗室/國家棉花改良中心新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團分中心，新疆石河子832000)

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陸地棉GhSAD2基因克隆與表達特征研究

蔡曼1，李衛(wèi)華1，王娟2，王旭文2，孔憲輝2，余渝2，劉麗2*

(1 石河子大學/新疆兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，新疆石河子 832003；2 新疆農(nóng)墾科學院棉花研究所/農(nóng)業(yè)部西北內(nèi)陸區(qū)棉花生物學與遺傳育種重點實驗室/國家棉花改良中心新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團分中心，新疆石河子832000)

Δ9硬脂酰 ACP 脫氫酶基因(GhSAD2)是脂肪酸合成代謝過程中關(guān)鍵的去飽和酶基因，為明確該基因在棉花脂肪酸合成代謝中的功能，該研究克隆了陸地棉GhSAD2基因，并對該基因的序列特征、進化關(guān)系及表達特性進行分析。序列分析顯示，GhSAD2基因(GenBank登錄號為KX197920)cDNA全長1 188 bp，編碼396個氨基酸，具有脂肪酸去飽和酶家族2個高度保守的組氨酸簇EENRHG和DEKRH，分別位于氨基酸的185和271位。系統(tǒng)進化分析顯示，GhSAD2基因與可可樹的同源基因進化關(guān)系非常接近。qPCR分析顯示，GhSAD2基因在葉中的表達量高于莖和根，且在花后25 d的種子中表達量達到最高值。低溫脅迫誘導(dǎo)結(jié)果表明，GhSAD2基因在不同程度低溫處理下均有上調(diào)表達，6 h表達量最大，之后逐漸下調(diào)。研究表明，GhSAD2基因可能對棉子油不飽和脂肪酸的合成具有重要作用，同時在棉花抗寒方面也起一定的生理作用。

Δ9 硬脂酰 ACP 脫氫酶基因(GhSAD2)；陸地棉；基因克隆；序列分析；低溫脅迫

棉花是世界上最重要的纖維作物和主要的油料作物，在中國和世界經(jīng)濟中具有重要地位。陸地棉棉子仁中含有15%～40% 的棉子油[1]，其中亞油酸的含量最高，可達50% 以上，是所有食用油中最高的一種[2]。棉子油除可用作生活食用油、化學工業(yè)原料外[3-4]，還是生產(chǎn)生物柴油的理想原料[5]。脂肪酸不僅能為植物儲存能量、為種子萌發(fā)提供所需的能量，而且也是某些信號分子的前體，在損傷防御和耐寒性等方面有著重要的作用，如膜脂中不飽和脂肪酸的比例和含量與植物的抗寒性密切相關(guān)[6-9]。

Δ9-硬脂酰-ACP 脫氫酶(stearoyl- ACP desaturase, SAD)在植物質(zhì)體中催化硬脂酰-ACP 脫飽和而在脂肪酸鏈的 C9與C10間引入一個雙鍵形成油酰-ACP的反應(yīng)，是不飽和脂肪酸合成代謝的關(guān)鍵酶[10]。因此，SAD 直接決定了植物油脂中的不飽和脂肪酸的總量以及飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例[11]。在大多數(shù)高等植物中，合成SAD的SAD基因在各器官中均有表達，而表達模式存在差異。例如SAD基因在油樟的葉、種子、花中表達量高，而在根和莖中表達量低[12]。而海濱錦葵的SAD基因在葉中表達水平最高，其次是種子，再次是莖和根，花中的表達水平最低。SAD基因在海濱錦葵種子不同階段的表達水平隨種子的發(fā)育逐漸降低[13]?；ㄉ鶾14]、蓖麻[15]、油菜[16]、芝麻[17]的SAD基因在各器官中表達模式相似，在發(fā)育種子中的表達量比其他組織都高，且在種子發(fā)育不同階段SAD基因的表達存在差異[18]。Liu等[19]通過 RNA干涉使棉花的SAD基因沉默，硬脂酸含量從正常的20%上升到40%，同時還伴隨棉籽油中其他3種主要脂肪酸棕櫚酸、油酸和亞油酸的減少。Wendy 等[20]將土豆的SAD基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)葉片和種子的脂肪酸組分發(fā)生了變化，不飽和脂肪酸含量增加。Liu[21]等首先在GenBank中注冊了陸地棉SAD基因的全長 cDNA 序列(X95988.1)，關(guān)于其它品種不同染色體組SAD基因序列特征的研究未見報道。

膜脂相變是植物冷害的原初反應(yīng)。自Lyons[22]提出植物低溫傷害的膜脂相變假說以來，大量實驗證明膜脂的不飽和脂肪酸的比例和含量與植物的耐寒性關(guān)系密切。一般認為，膜脂不飽和脂肪酸含量增高，膜脂相變溫度會降低，增加了膜的流動性，從而使植物的抗寒性相應(yīng)提高。反之，冷敏感植物的膜脂相變可能是由于膜脂脂肪酸的不飽和程度較低，低溫下膜脂由液晶相向凝膠相轉(zhuǎn)變，造成細胞膜膜相分離，從而引起細胞代謝紊亂。改變膜的流動性有三種機制，即脂肪酸碳鏈變短、碳鏈分支和引入雙鍵。前兩者只在脂肪酸生物合成過程中實現(xiàn)，而后者則既可以在其生物合成過程中進行，也可以通過去飽和酶對細胞膜內(nèi)已有的脂肪酸催化來實現(xiàn)。SAD催化的脫氫作用是植物典型不飽和脂肪酸生物合成的第一步，直接影響植物中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例，對植物膜在生理溫度下由凝膠態(tài)轉(zhuǎn)化為液晶態(tài)有重要的作用[23]。將來自擬南芥的一種脂肪酸脫飽和酶基因在煙草中超表達，并在正常溫度(25 ℃)下生長；同時將對照煙草在15℃下培養(yǎng)，兩種條件下生長的植物的膜脂不飽和脂肪酸含量都增加10%，說明低溫可促進不飽和脂肪酸的合成，以適應(yīng)低溫。Vega 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，4 ℃處理下，馬鈴薯SAD基因轉(zhuǎn)錄水平較對照組(20 ℃)有顯著升高，SAD基因的表達與馬鈴薯的低溫適應(yīng)性有關(guān)。目前Liu等關(guān)于棉花SAD基因功能的相關(guān)報道主要集中在對脂肪酸成分的影響方面，而對SAD基因在棉花抗寒性方面的作用研究甚少。

本研究以棉花‘新陸早33號’品種為材料，采用電子拼接和RT-PCR方法克隆GhSAD2基因cDNA全長，GenBank登錄號為KX197920。利用NCBI和DNAMAN分析軟件，對該基因進行核苷酸序列以及氨基酸序列的分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，以分析該基因在不同物種間的進化關(guān)系；并對該基因的氨基酸序列、組織表達特異性及低溫脅迫下的表達特性進行了分析，以期為遺傳改良棉籽油品質(zhì)、提高棉花抗逆性等提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料

2014年在新疆農(nóng)墾科學院試驗地種植‘新陸早33號’，開花期在植株中上部同一部位掛牌自交，采集盛花期后10、15、20、25、30、35、40和45 d的胚珠，用于測定基因的表達量。根、莖、葉取自生長在28℃(16 h/8 h)的光照培養(yǎng)箱中長出 2～3 片真葉的棉花幼苗，用于測定基因組織表達。所有試驗材料取樣后迅速置液氮中，在-70℃冰箱保存，用于RNA提取。

脅迫處理：從溫度25 ℃/16 ℃(16 h/8 h)，光照培養(yǎng)箱取長出 2～3片真葉、長勢相同的‘新陸早33號’幼苗，進行不同溫度的脅迫處理。具體操作如下：將棉花幼苗置于5 ℃、15 ℃、25 ℃的培養(yǎng)箱中，分別在處理1、3、6、12、24 和 48 h 后進行葉片取樣，迅速置于液氮后，-70 ℃保存，用于RNA提取。

所有室內(nèi)試驗在新疆農(nóng)墾科學院農(nóng)業(yè)部西北內(nèi)陸區(qū)棉花生物學與遺傳育種重點實驗室內(nèi)完成。

1.2方法

1.2.1RNA提取及cDNA 鏈的合成用CTAB法[25]提取棉花葉片總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性； 用核酸蛋白分析儀測定其A260、A280值，計算RNA濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄之前，RNA樣品用DNase I(Takara，日本)處理。以3.5 μL RNA 為模板按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit (Takara，日本)描述的方法，合成 cDNA第一鏈。具體過程如下:5×PrimerScript Buffer 2 μL，PrimerScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL, RNase-Free ddH2O 3 μL，充分混勻，37 ℃孵育15 min進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，85 ℃孵育5 s反轉(zhuǎn)錄酶失活，置于4 ℃?zhèn)溆没?20 ℃保存。

1.2.2GhSAD2基因的擴增根據(jù)中國農(nóng)業(yè)大學遺傳育種實驗室構(gòu)建的棉花脂肪酸 cDNA 文庫，對文庫進行分析后，從文庫中選取1個可能與脂肪酸去飽和酶基因(SAD)相關(guān)的 cDNA 序列，將其在NCBI 的棉花EST 數(shù)據(jù)庫中進行比對，下載一致性高的 EST 用 CAP3 Sequence assembly進行拼接，用ORF finder預(yù)測ORF區(qū)，分別設(shè)計全長 ORF 引物和 RT-PCR 引物(表1)進行目標基因全長 ORF 驗證和表達特征分析，PCR 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。提取‘新陸早33號’葉片中的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 作模板用Pfu高保真酶(全式金，北京)進行 PCR 擴增，PCR 條件為 94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，61.4 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物，目的條帶經(jīng)膠回收、純化(方法參見天根膠回收試劑盒說明書)后連接至 pMD19-T (Takara，日本)載體上，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1(全式金，北京)，藍白斑篩選挑取陽性單克隆、搖菌，選取3個陽性克隆送往上海生工生物工程有限公司進行測序；采用 Blast 程序(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)分析序列的同源性；用 DNAMAN軟件進行序列翻譯和多重比對；利用在線 CDD 軟件 ( http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd.shtml) 分析棉花GhSAD2 基因的保守結(jié)構(gòu)域(Ferritin-like domain)。

1.2.3生物信息學分析利用下列在線軟件對氨基酸序列進行結(jié)構(gòu)特征分析：蛋白等電點、分子量等分析軟件(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)，蛋白二級結(jié)構(gòu)分析軟件(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)， 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)，亞細胞定位軟件 (http://www. cbs.dtu.dk/services/TargetP)，信號肽預(yù)測軟件(http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)， 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析軟件(http://swissmodel.expasy.org/interactive)。系統(tǒng)進化樹采用Clustalw1.83軟件對GenBank中不同物種的SAD基因進行多序列比對分析，創(chuàng)建一個不同來源的SAD2基因的多序列的比對結(jié)果；系統(tǒng)發(fā)生和進化分析在比對的基礎(chǔ)上用 MAGE5.0軟件完成，系統(tǒng)進化樹采用鄰接法構(gòu)建。

1.2.4GhSAD2 基因的表達分析以‘新陸早33號’根、莖、葉和花后不同時間的胚珠為材料，分別以它們的 cDNA 為模板，選用UBQ7基因為內(nèi)參。根據(jù)所克隆的GhSAD2 基因的編碼序列設(shè)計定量PCR的引物(表 1)，擴增目的片段為1 182 bp，引物特異性由PCR產(chǎn)物的熔解曲線單一峰確定。反應(yīng)用TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金)在Roche LightCycler 480熒光定量 PCR 儀上進行。反應(yīng)體系為20 μL，包括TransStart Tip Green qPCR SuperMix (2×) 10 μL、10 μmol/L GhSAD2-q上下游引物各0.4 μL、模板cDNA 1 μL，加 ddH2O至20 μL。qPCR 程序為 95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃變性10 s， 56 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，40 個循環(huán)；95 ℃ 1 min，40 ℃～95 ℃ 2 min做溶解曲線，40 ℃降溫30 s。設(shè)3個技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)輸出的結(jié)果用Microsoft Excel軟件進行處理。

2　結(jié)果與分析

2.1GhSAD2基因的克隆及序列分析

利用設(shè)計的GhSAD2F和GhSAD2R引物(表1)，對‘新陸早33號’葉片中cDNA 進行 PCR 擴增電泳結(jié)果表明有一長約1.2 kb的擴增條帶(圖1)，符合預(yù)期擴增片段長度。將特異條帶切膠回收后連接PMD19-T vector，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細胞后，用藍白斑篩選陽性克隆送往測序公司進行序列測定。其測序結(jié)果通過DNAStar和DNAMAN分析，

M.DL2000； 1～7.GhSAD2的cDNA片段圖 1　陸地棉SAD2基因的克隆M.DL2000；1-7. cDNA gene fragment of GhSAD2Fig.1　cloned gene SAD2 of Gossypium hirsutum

進行BLASTP比對，確定其為cDNA全長，包括完整的開放閱讀框(open reading frame，ORF)。cDNA全長為1 188 bp，編碼396個氨基酸，將該基因命名為GhSAD2，GenBank登錄號為KX197920。

利用ExPASy分析顯示，該基因的理論分子量為45.3 kD，理論等電點為5.88，平均親水系數(shù)(GRAVY)為-0.464，屬于親水性蛋白。用Target P1.1 Server對棉花GhSAD2基因編碼的氨基酸序列進行預(yù)測的結(jié)果表明，該序列含有葉綠體轉(zhuǎn)運肽(用 C 表示)、線粒體目標肽(用M表示)、 分泌途徑信號肽(用S表示)與其它，分值分別為0.616、0.204、0.079及0.043，預(yù)測可靠性為3級，無氨基酸殘基分裂位點，有葉綠體轉(zhuǎn)運肽，導(dǎo)肽長度為34。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，GhSAD2中α螺旋占54.82%，無規(guī)則卷曲占38.25%，β折疊占6.93%；通過SWISS-MODEL同源建模法獲得GhSAD2 的理論三維結(jié)構(gòu)(圖2)，一致性為90.86%，為同型二聚體，含一個屬于酰基 ACP 脫氫酶家族和屬于類鐵蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域。位于SAD保守區(qū)的 4個螺旋結(jié)構(gòu)中埋藏著一個由2個鐵原子組成的二鐵中心，鐵原子的配基為E137、E175、H178、E261。

圖 2　棉花GhSAD2理論三維結(jié)構(gòu)Fig.2　Theoretical three-dimensional structure of GhSAD2表1　基因擴增的引物Table 1　Primer sequence for gene amplification

引物名稱Primer引物序列Primersequence(5'→3')Tm/℃說明IntroductionGhSAD2FATGGCTCTGAAATTCAACCC61.4GhSAD2基因擴增GhSAD2RGAGCTGGACTTCTCTATCAAAT61.4GhSAD2geneamplificationqSAD2FGCCTTTCATGCCTCCTAGC56熒光定量qSAD2RGTTGTTCTCAGCCCAGTCC56qPCRUBQ7FGAAGACCTACACCAAGCCCAAG56熒光定量內(nèi)參UBQ7RCGGACTCTACTCAATCCCCACC56qPCRactin

用Blast將該基因與其他植物SAD2氨基酸序列同源比對，圖3表明，GhSAD2與已經(jīng)發(fā)表的陸地棉SAD基因的相似性為83%，與已經(jīng)克隆得到的大豆、可可、擬南芥及小麥的相似性分別為84.6%、80.1%、76.3%、75.0%；同時利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫中在線CDD 軟件對該基因的保守結(jié)構(gòu)域進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆陬愯F氧化還原蛋白超家族，具有?；?ACP 脫氫酶保守結(jié)構(gòu)域，保守域為67～373，包括14個底物結(jié)合位點，多個二聚體形成位點和用于催化Fe2+中心的6個活性位點，該酶在同型二聚體狀態(tài)下保持活性，并且單體主要由α-螺旋和催化 Fe2+中心的4 個螺旋束組成，該中心具有催化酰基-ACP上第9個和10個碳原子上的H與O2-結(jié)合，形成不飽和鍵。從相似性比對的結(jié)果可以看出，SAD基因在不同物種間的同源性很高，所有SAD基因的核心區(qū)段幾乎完全相同，僅在起始密碼子和終止密碼子附近有較大的差異。本研究克隆得到的GhSAD2基因編碼的蛋白具有脂肪酸去飽和酶家族2個高度保守的組氨酸簇-EENRHG和DEKRH，分別位于氨基酸的185和271位，推測其可能具有SAD家族類似的功能，該分析進一步驗證了本研究從陸地棉中克隆得到GhSAD2 基因。

2.2GhSAD2的系統(tǒng)進化樹分析

利用BLASTP對該基因預(yù)測蛋白的氨基酸序列進行同源性檢索，并下載同源性較高的物種氨基酸序列，用Clustalw1.83和MEGA5.0構(gòu)建SAD基因家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果顯示，整個進化樹分為2支，其中大豆、文冠果、苜蓿等分為一大支，棉花和可可分為一小支。GhSAD2基因和已經(jīng)發(fā)表的陸地棉的SAD基因聚于同一個小的進化分支，親緣關(guān)系最近，同時與可可樹的同源基因進化關(guān)系非常接近。這與該物種在經(jīng)典分類學上的地位相一致，棉花和可可樹同屬被子植物門、雙子葉植物綱、錦葵目。

GhSAD2(KX197920)和GhSAD1(X95988.1). 棉花; GmSAD2(NM001251615.1).大豆; TcSAD2(XM 007033671.1).可可; AtSAD2(NM129933.3).擬南芥; TaSAD2(HQ589253.1).小麥；黑框表示SAD基因保守的氨基酸序列圖3　GhSAD2 基因的氨基酸序列比對分析GhSAD2(KX197920) and GhSAD1(X95988.1) are from G. hirsutum; GmSAD2(NM001251615.1) is from Glycine max; TcSAD2(XM 007033671.1) is from Theobroma cacao; AtSAD2(NM129933.3) is from Arabidopsis thaliana; TaSAD2(HQ589253.1) is from Triticum aestivum. The coserved SAD homologeis indicated in blackFig.3　Alignment of amino acid sequences of SAD2 genes of G. hirsutum

圖中各節(jié)處數(shù)字表示重復(fù)1 000次Bootstrap值圖4　GhSAD2 基因的系統(tǒng)進化樹The numbers at note represent the Bootstrap values with 1 000 replicates in this figureFig.4　Phylogenetic tree of GhSAD2 genes

圖 5　GhSAD2基因在棉花各組織中的表達Fig.5　GhSAD2 expression in the leaf,stem and root of G. hirsutum

2.3GhSAD2基因的組織表達分析

分別以‘新陸早33號’棉花幼苗2～3片真葉的根、莖、葉及盛花期后10、15、20、25、30、35、40和45 d胚珠的總RNA為模板，以持家基因UBQ7為內(nèi)參基因。通過 qRT-PCR 研究GhSAD2基因在棉花幼苗根、莖、葉等組織的相對表達量(圖5)，及在棉花種子發(fā)育不同時期的表達情況(圖6)。結(jié)果顯示，GhSAD2基因在葉的表達量高于莖和根中的表達量；GhSAD2基因在花后種子發(fā)育過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在花后25 d的種子中達到最高值，隨后逐漸降低，在成熟的種子(花后45 d時)表達相對微弱。GhSAD2基因是不是影響棉子油中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的關(guān)鍵基因，還有待進一步研究。

圖6　GhSAD2基因在棉花種子發(fā)育不同時期的表達Fig.6　GhSAD2 expression in different seed development stages of G. hirsutum

圖 7　GhSAD2基因在不同溫度脅迫下相對表達量Fig.7　GhSAD2 gene relative expression levels under temperature stress

2.4GhSAD2基因在低溫脅迫下的表達分析

通過對不同溫度不同時間的脅迫處理下GhSAD2基因的qRT-PCR分析(圖7)，25 ℃作為對照組，GhSAD2基因在棉花葉片中的相對表達量基本保持恒定，無顯著性的上升或下降。在5 ℃和15 ℃處理下，GhSAD2基因的相對表達量穩(wěn)步上升，從1 h 后開始逐步增加，到6 h時達到高峰，表達量為25 ℃對照組的2.7～6.0倍;隨后逐漸降低，在12 h的處理后，GhSAD2基因的表達量基本保持穩(wěn)定，在24和48 h時其表達量是對照組的1.3～2.3倍。研究結(jié)果表明，GhSAD2基因能夠在低溫脅迫下應(yīng)答，在短時間內(nèi)表達量會有所上調(diào)，表明GhSAD2基因可能在棉花冷脅迫調(diào)控中起一定的作用。

3　討　論

Δ9 硬脂酰-ACP 去飽和酶(Stearoyl-ACP desaturase，SAD)是目前研究最多、最廣泛的膜質(zhì)去飽和酶，該酶催化的反應(yīng)是在第 9～10 碳原子之間脫氫形成第一個雙鍵。通常 SAD在質(zhì)體中催化硬脂酸去飽和產(chǎn)生油酸，然后以脂形式存在的油酸被運轉(zhuǎn)到類囊體膜中或進入細胞質(zhì)中進一步去飽和[26]。迄今為止，它是高等植物中唯一的脂溶性脫氫酶，因此，關(guān)于植物脂質(zhì)去飽和的研究已經(jīng)成為生物化學研究中的熱點。

目前已從多種植物中分離獲得SAD基因的 cDNA。其中油菜、芝麻、油茶、麻風樹等大多數(shù)油料作物SAD基因的 ORF 長 1 173～1 197 bp，編碼 390～398個氨基酸，本研究獲得的陸地棉的SAD基因cDNA全長分別為1 188 bp，396個氨基酸。通過氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化樹分析，GhSAD2基因與陸地棉SAD1基因的cDNA全長序列(X95988.1)相似性最高，親緣關(guān)系最近，推測兩基因可能在調(diào)控植物生長方面的功能比較接近。利用實時熒光定量PCR，GhSAD2基因在棉花的組織中都有表達，且在花后25 d 種子中表達量最大，說明該基因在脂肪酸合成過程中都起到了脫氫酶的作用。Liu等[21]通過 RNA干涉使棉花的SAD基因沉默，硬脂酸含量從正常的20%上升到40%，同時還伴隨棉籽油中其他3種主要脂肪酸棕櫚酸、油酸和亞油酸的減少。對于本研究克隆得到的GhSAD2基因在調(diào)節(jié)脂肪酸含量是否與之前得到的基因有類似的功能需要進一步進行驗證。

Lindqvist 等[26]用 X-射線晶體衍射分析描述了蓖麻SAD基因的晶體結(jié)構(gòu)，張黨權(quán)等[27]通過同源建模法獲得油茶SAD基因的理論三維結(jié)構(gòu)，均為同型二聚體，亞基含有11個α-螺旋，其中9個α-螺旋形成一個反平行螺旋束，該螺旋束上的4個α-螺旋與 Fe2+共同形成 SAD的活性中心。本研究通過同源建模獲得GhSAD2蛋白的同型二聚體，發(fā)現(xiàn)其具有植物SAD的空間結(jié)構(gòu)特征。這為進一步從蛋白水平研究棉花GhSAD2基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

SAD在質(zhì)體中催化硬脂酸去飽和產(chǎn)生油酸，然后油酸以脂的形式被運轉(zhuǎn)到類囊體膜中或進入細胞質(zhì)中進一步去飽和。大量研究表明當植物受到溫度脅迫時主要是通過改變不飽和脂肪酸含量和比例來提高植物的抗寒性，因此SAD基因?qū)τ谥参锏牡蜏仨憫?yīng)具有十分重要的作用。Cheesbrough等[28-29]研究發(fā)現(xiàn)，長在20℃的大豆的SAD基因活性比生長在35 ℃的大豆的SAD基因活性高5倍。Polashock J等[30]和 Ma J 等[31]分別將酵母的SAD基因和菠菜的SAD基因?qū)霟煵?，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性均增強。銀杏的GbSAD基因在4 ℃和15 ℃處理下該基因的水平穩(wěn)步上升，從1 h后表達增加，到3和6 h表達達到高峰，相比對照(25 ℃)增長40～50倍，然后逐步下降到48 h表達量為對照組的2～4倍[32]，本研究中GhSAD2基因與銀杏GbSAD基因在低溫脅迫下呈現(xiàn)相同的表達趨勢。但對于15 ℃的中度脅迫下的表達量始終高于5 ℃的高度脅迫，可能是中度脅迫更有利于GhSAD2的表達，對于GhSAD2基因在棉花抗寒中的具體作用，有待進一步研究。

通過轉(zhuǎn)基因手段改良棉花脂肪酸成分及抗寒性是一項意義重大的工作，下一步我們將構(gòu)建過表達載體和干擾載體，通過轉(zhuǎn)基因進一步研究該基因在不飽和脂肪酸合成過程中及棉花抗寒中的具體作用。

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(編輯:宋亞珍)

Molecular Cloning and Expression Analysis of Stearoyl-ACP Desaturase Gene(GhSAD2)in Upland Cotton (GossypiumhirsutumL.)

CAI Man1, LI Weihua1, WANG Juan2, WANG Xuwen2, KONG Xianhui2, YU Yu2, LIU Li2*

(1 Shihezi University/The Key Oasis Eco-agriculture Laboratory of Xinjiang Production and Construction Group,Shihezi， Xinjiang 832003, China; 2 Cotton Institute, Xinjiang Academy Agricultural and Reclamation Science / Northwest Inland Region Key Laboratory of Cotton Biology and Genetic Breeding (Xinjiang), Ministry of Agriculture, China / Xinjiang Production & Construction Corps / Subcenter of National Cotton Improvement Center, Ministry of Agriculture, China, Shihezi, Xinjiang 832000, China)

Δ9 stearoyl ACP desaturase gene (GhSAD2) is a fatty acid synthesis and metabolism in the process of key desaturase gene. To clarify the gene function in biosynthesis of cotton fatty acids, we cloned theGhSAD2 gene from upland cotton, and analyzed the gene sequence features, evolutionary relationship and expression characteristics. In this study, a full-length cDNA of stearoyl-ACP desaturase gene was cloned from upland cotton ‘Xinluzao 33’ leaves successfully by using electronic stitching and RT-PCR, which namedGhSAD2 and access number was KX197920 in GenBank. The gene nucleotide and amino acid sequences were analyzed by using NCBI and DNAMAN and a phylogenetic tree was constructed by using Clustalw 1.83 and MAGE 5.0 software, which would help analyze the gene evolutionary relationships among different species. Result showed that theGhSAD2 gene open reading frame had 1188bp, encoding a polypeptide of 396 amino acids. Sequence analysis revealed that this geneGhSAD2 had two highly conserved histidine clusters of ferritin-like superfamily: EENRHG and DEKRH were located at amino acid 185 and 271. Phylogenetic analysis showed thatGhSAD2 homologous gene evolutionary relationship with the cacao tree is very close, which is consistent with the status of the species in the classical taxonomy. qPCR showed thatGhSAD2 inG.hirsutumhad a much higher expression in leaves than that in stems and roots.GhSAD2 express highest at 25 days (s25) after flowering seed.GhSAD2 in leaves expression under cold stress analysis showed that the gene were upregulated under varying low temperature treatments. It has the highest expression at 6 hours treatment, and then gradually reduced. Studies have shown thatGhSAD2 gene may play an important role at cotton seed oil unsaturated fatty acid synthesis. At the same time, it has a certain physiological role in the cold resistance of cotton.

stearoyl-ACP desaturase gene;Gossypiumhirsutum; gene clone; sequencing analysis; low temperature stress

1000-4025(2016)09-1713-08doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1713

2016-05-26;修改稿收到日期:2016-09-02

國家自然科學基金(31360349)

蔡曼(1992-)，女，在讀碩士研究生，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail：1660115973@qq.com

劉麗，博士，副研究員，主要從事棉花遺傳育種研究。E-mail:cottonliuli@sina.com

Q785; Q789

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