晉婷婷，任嘉紅，劉瑞祥

(長治學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系,山西長治 046011)

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南方紅豆杉根際解有機(jī)磷細(xì)菌的鑒定及其解磷特性和促生作用研究

晉婷婷，任嘉紅*，劉瑞祥

(長治學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系,山西長治 046011)

以分離自南方紅豆杉根際的1株解有機(jī)磷細(xì)菌JYD-4為研究對象，對其進(jìn)行分類鑒定；采用鉬銻抗比色法研究JYD-4菌種在不同碳源、氮源和pH條件下的解有機(jī)磷能力；提取JYD-4菌株磷酸酯酶，測定在不同溫度和pH作用下的磷酸酯酶活性；采用溫室盆栽試驗(yàn)研究JYD-4菌株對南方紅豆杉實(shí)生苗的促生長作用。結(jié)果表明：(1)分離自南方紅豆杉根際的解有機(jī)磷細(xì)菌JYD-4為嗜麥寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)。(2)菌株JYD-4在卵黃固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生的解磷圈與菌落直徑比為2.01，在液體培養(yǎng)基中的解磷量為72.38 mg/L。(3)菌株JYD-4解磷最適碳源為葡萄糖，最適氮源為牛肉膏，最適pH 7.0。(4)菌株JYD-4產(chǎn)生的磷酸酯酶主要為胞內(nèi)酶，該酶在20℃～65 ℃溫度范圍均能發(fā)揮較高酶活性，但僅能在pH 9.0條件下產(chǎn)生較高酶活性。(5)菌株JYD-4接種能夠明顯提高南方紅豆杉實(shí)生苗的苗高、地徑和生物量。研究表明，嗜麥寡養(yǎng)單胞菌JYD-4是一株高效解有機(jī)磷細(xì)菌，主要分泌堿性磷酸酯酶，對南方紅豆杉具有明顯的促生長作用；該研究為南方紅豆杉微生物肥料的開發(fā)提供了優(yōu)良的菌種資源，為該菌種的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

解有機(jī)磷細(xì)菌；南方紅豆杉；嗜麥寡養(yǎng)單胞菌；解磷特性；磷酸酯酶；促生效果

南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)屬紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus)植物，是集觀賞、材用、藥用為一身的珍稀植物樹種，為國家一級重點(diǎn)保護(hù)野生植物[1]。南方紅豆杉為新生代第一紀(jì)孑遺植物，由于該樹種可提取新型抗癌藥物紫杉醇而倍受世人關(guān)注。然而，由于紅豆杉植株在自然條件下生長緩慢，植株體內(nèi)紫杉醇含量極低，導(dǎo)致中國紅豆杉屬植物野生資源遭到了嚴(yán)重破壞，有的地方甚至瀕臨滅絕。因此，如何保護(hù)、開發(fā)和利用紅豆杉資源，實(shí)現(xiàn)紫杉醇產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，已成為亟需解決的重要課題。

磷是植物生長發(fā)育的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是植物體內(nèi)核酸及多種酶、輔酶、ATP等的重要組成成分。植物體需要的磷主要是從土壤中獲得，但中國耕地土壤中95%以上的磷為無效形式，植物很難直接吸收利用。因此，提高植物對土壤中難溶性磷的吸收對于提高植物生物量至關(guān)重要。大量研究表明，土壤與植物根際存在大量微生物，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)，稱為解磷菌或溶磷菌(phosphate-solubilizing microbiology)，其按照分解底物的不同又可分為溶無機(jī)磷微生物和解有機(jī)磷微生物[2]。其中，能夠?qū)Ｒ恍苑纸庥袡C(jī)磷化合物的細(xì)菌稱為解有機(jī)磷細(xì)菌。它們通過分泌有機(jī)磷降解酶[3-4]，將土壤中有機(jī)磷化合物轉(zhuǎn)化為植物能夠吸收利用的可溶性磷，增加植物對磷元素的吸收，從而促進(jìn)植物的生長，該過程也被稱為有機(jī)磷的礦化作用。1935年，前蘇聯(lián)學(xué)者蒙金娜從土壤中分離到1株能夠分解核酸和卵磷脂的巨大芽孢桿菌，并于1947年大量生產(chǎn)使用，接種后明顯提高了土壤中有效磷含量。此后，國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者先后從小麥[5-6]、水稻、西紅柿、月季、玉米、白樺樹[7]、黑麥草、白三葉草、燕麥、黃羽扇豆[6]以及葡萄[8-9]等植物根際分離得到了多株解有機(jī)磷細(xì)菌，包括假單胞菌(Pseudomonassp.)、芽孢桿菌(Bacillussp.)、不動桿菌(Acinetobactersp.)、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp.)、腸桿菌(Enterobactersp.)、根瘤菌(Rhizobiumsp.)、節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)、土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)等。前期研究發(fā)現(xiàn)，解磷菌主要通過產(chǎn)生磷酸酯酶對有機(jī)磷化合物進(jìn)行降解[10]。

目前，對解磷菌的研究和應(yīng)用主要集中在農(nóng)作物上，在林業(yè)上的研究還相對較少，對珍稀樹種南方紅豆杉根際解磷菌的研究更是少見。因此，為了提高南方紅豆杉的生長繁殖能力，本研究以1株分離自南方紅豆杉根際土壤中的高效解有機(jī)磷細(xì)菌為對象，對其進(jìn)行菌種鑒定、解磷特性分析和解磷機(jī)制初探。同時，探討了該菌種在溫室條件下對南方紅豆杉實(shí)生苗生長的影響。旨在為該解磷菌在南方紅豆杉生物肥料上的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

菌株JYD-4分離自山西省長治市太行山大峽谷南方紅豆杉根際土壤中，該菌種現(xiàn)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏編號M2012264)。南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)為1年生盆栽實(shí)生苗，栽培于山西省長治市林業(yè)局苗圃大棚內(nèi)。

培養(yǎng)基包括：(1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：配方為牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，pH 7.2～7.4。(2)卵黃固體培養(yǎng)基：配方為牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂粉15～18 g/L，pH 7.0，滅菌，培養(yǎng)基溫度降至50 ℃左右時，每50 mL中加入3～4 mL新鮮蛋黃液，混勻，倒平板。(3)蒙金娜培養(yǎng)基：組成為葡萄糖10 g/L，(NH4)2SO40.5 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g/L，MnSO4·4H2O 0.03 g/L，卵磷脂0.4 g/L，CaCO35 g/L，pH 7.0。(4)PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮后切成小塊，稱取200 g，加水煮爛，用紗布過濾，加入葡萄糖20 g，瓊脂粉15～20 g，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1 000 mL，分裝，滅菌。

1.2菌株形態(tài)、生理生化特性分析及分子鑒定

對菌株JYD-4進(jìn)行平板劃線，分離單菌落，觀察菌落形態(tài)特征(菌落大小、顏色、透明度、表面光滑程度、邊緣整齊程度等)。菌體的革蘭氏染色參見《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》教材[11]，通過光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)。菌體的氧化酶反應(yīng)、KOH、吲哚試驗(yàn)、明膠液化、硝酸還原、產(chǎn)氨和硫化氫試驗(yàn)等生化特性鑒定參見《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]?；蚪MDNA的提取參見Chen等[13]方法。使用16S rDNA擴(kuò)增通用引物(27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增16S rDNA序列。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min ，30個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后，使用天根普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。PCR純化產(chǎn)物連接至pMD19-T(Takara)載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α。篩選陽性克隆，送至北京華大基因進(jìn)行測序。16S rDNA 序列測定后與GenBank數(shù)據(jù)做相似度分析。取相似度較高的菌株的16S rDNA序列，利用CLUSTALW軟件[14]進(jìn)行比對，利用MEGA 6.0[15]軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3菌株解磷能力測定

1.3.1平板解磷能力將菌株單菌落接種于卵黃培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d后，測量解磷圈與菌落直徑，并計算解磷圈與菌落直徑之比。

1.3.2液體解磷能力將菌株單菌落接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)2 d后，10 000 r/min離心1 min，無菌水重懸菌體沉淀。實(shí)驗(yàn)組取1 mL菌懸液接種于含50 mL蒙金娜培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，對照組接種1 mL滅菌菌懸液。30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)至1～7 d的培養(yǎng)液，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清，使用鉬銻抗比色法測定上清液中可溶性磷含量[16]。以實(shí)驗(yàn)組和對照組中可溶性磷含量的差值作為受試菌株的解磷量，其單位為mg/L。本部分以及之后的解磷能力測定均設(shè)置3個重復(fù)。

1.3.3不同碳源下解磷能力以(NH4)2SO4為氮源，分別用葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘油和可溶性淀粉作為碳源(各碳源濃度均為10 g/L)，測定解磷量。

1.3.4不同氮源下解磷能力以葡萄糖為碳源，分別用(NH4)2SO4、NH4Cl、NaNO3、KNO3、尿素和牛肉膏作為氮源(各氮源濃度均為0.5 g/L)，測定解磷量。

1.3.5不同初始pH值下解磷能力以葡萄糖為碳源，(NH4)2SO4為氮源，分別調(diào)節(jié)蒙金娜培養(yǎng)基pH至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，將菌株JYD-4分別接種至不同pH蒙金娜培養(yǎng)基中，測定解磷量。

1.4磷酸酯酶活性測定

1.4.1磷酸酯酶的提取和活性測定取蒙金娜培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d的菌液，6 000 r/min下離心10 min，上清(S1)置于4 ℃保存；使用10 mL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)重懸沉淀(P1)，6 000 r/min下離心10 min，10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)洗滌2 次，上清(S2)4 ℃保存；使用10 mL 25%蔗糖溶液重懸沉淀，于25 ℃條件下振蕩10 min，10 000 r/min離心10 min，上清(S3)4 ℃保存；使用10 mL預(yù)冷雙蒸水重懸沉淀，置于冰水浴中振蕩10 min，10 000 r/min離心10 min，上清(S4)4 ℃保存；10 mL 50 mmol/L Tris-HCl重懸沉淀后，超聲破碎細(xì)胞，10 000 r/min離心10 min，4 ℃保存上清(S5)。合并S1、S2 和 S3作為胞外提取液，S4為細(xì)胞周質(zhì)提取液，S5為胞內(nèi)提取液。各取2 mL上述酶液，沸水浴1 h，即為失活酶液，作為空白對照使用。磷酸酯酶活性測定方法參見文獻(xiàn)[17]。磷酸酯酶活性的測定設(shè)置3個重復(fù)，下同。

1.4.2不同溫度下磷酸酯酶活性分別控制酶促反應(yīng)溫度為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃,測定不同溫度下磷酸酯酶活性。

1.4.3不同pH下磷酸酯酶活性分別用pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的0.2 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液和pH 9.0、9.5 的0.05 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液設(shè)置酶促反應(yīng)體系中不同pH 環(huán)境。測定pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0和9.5環(huán)境下磷酸酯酶活性。

1.5菌株JYD-4對南方紅豆杉接種效應(yīng)

用接種環(huán)挑取少量菌體接種于含有50 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。取上述菌液離心(4 ℃，6 000 r/min，5 min)，無菌生理鹽水洗滌菌體3次，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至1012cfu/L制成菌劑。將上述菌劑接種至一年生南方紅豆杉，對照組接種等量無菌生理鹽水，接種量為每株5 mL。紅豆杉苗培養(yǎng)基質(zhì)為泥炭、珍珠巖和沙按 3∶1∶1體積比混合而成，每盆裝1.5 kg?；|(zhì)中速效氮、速效磷和速效鉀含量分別為35.0、7.0和25.4 mg/kg。接種后實(shí)生苗置于溫室中，使用遮陽網(wǎng)控制光照，適時澆水。接種1年后分別測量實(shí)驗(yàn)組和對照組苗高和地徑。植株烘干后測其干重進(jìn)行生物量分析。

1.6數(shù)據(jù)分析

本研究所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個重復(fù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel和SPSS 13. 0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株JYD-4形態(tài)觀察、生理生化特性分析及16S rDNA分析鑒定

菌株JYD-4在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，菌落較小，半透明，乳黃色，圓形、邊緣整齊；菌落表面光滑，有光澤，中央有突起(圖1，A)。顯微鏡觀察，菌體呈短桿狀，大小約0.23～0.33 μm×0.34～1.40 μm (圖1，B)。菌體革蘭氏染色陰性，無芽孢，極生多鞭毛。JYD-4為好氧菌，氧化酶反應(yīng)、KOH、吲哚試驗(yàn)、明膠液化、硝酸還原、產(chǎn)氨和硫化氫試驗(yàn)均為陽性。對該菌株的16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增后測序(圖2，A)，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示(圖2，B)，菌株JYD-4與嗜麥寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)位于同一分支，與S.maltophilia16S rDNA序列相似度為99%，結(jié)合生理生化特性，初步確定菌株JYD-4為嗜麥寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)。其16S rDNA序列(1 508 bp)已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KU942526。

A.菌落形態(tài)；B.菌體形態(tài)(結(jié)晶紫染色，放大倍數(shù)1 000)圖1　菌株JYD-4的菌落和菌體形態(tài)A. Colony morphology; B. Cell morphology (stained by crystal violet, magnification: 1 000)Fig.1　Colony morphology and cell morphology of strain JYD-4

2.2菌株JYD-4的解磷能力及解磷特性

2.2.1解磷能力如圖3所示，S.maltophiliaJYD-4在卵黃平板上培養(yǎng)后，可產(chǎn)生明顯不透明的解磷圈。解磷圈直徑為32.18 mm，菌落直徑為15.98 mm，解磷圈與菌落直徑比為2.01。該結(jié)果表明，JYD-4菌株對卵磷脂具有較強(qiáng)的降解能力。

同時，將S.maltophiliaJYD-4接種至蒙金娜液體培養(yǎng)基，從培養(yǎng)第1天開始，每天定時取樣測定培養(yǎng)液中可溶性磷含量，計算解磷量。結(jié)果(圖4)顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，S.maltophiliaJYD-4的解磷量逐漸升高；當(dāng)培養(yǎng)至第5天時，解磷量達(dá)到最高值(72.38 mg/L)，此后隨著培養(yǎng)時間的繼續(xù)延長，菌株JYD-4逐漸出現(xiàn)解磷量降低的趨勢。由此推測，在培養(yǎng)初期，菌株JYD-4生長代謝能力旺盛，不斷分解培養(yǎng)基中卵磷脂，解磷量逐漸增長；隨著培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，導(dǎo)致菌體分解代謝能力降低，從而使培養(yǎng)基中可溶性磷含量緩慢下降

圖3　S. maltophilia JYD-4產(chǎn)生的解磷圈Fig.3　Phosphate-solubilizing zone produced by S. maltophilia JYD-4

圖2　菌株JYD-4 16S rDNA序列擴(kuò)增(A)和系統(tǒng)發(fā)育樹(B)Fig.2　Amplification profile of 16S rDNA (A) and phylogenetic tree (B) of strain JYD-4

。

2.2.2不同碳源下解磷量菌株JYD-4在含有不同氮源的蒙金娜液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，呈現(xiàn)出不同的解磷能力，且碳源間差異顯著(圖5，A)。其中，以葡萄糖作為碳源時，菌株JYD-4解磷能力最強(qiáng)(72.12 mg/L)，顯著高于其它碳源；當(dāng)以果糖、半乳糖和甘油分別作為碳源時，菌株JYD-4解磷量基本相當(dāng)，分別為64.93、60.40和58.84 mg/L；當(dāng)使用蔗糖和淀粉作為碳源時，菌株JYD-4解磷量最低，僅分別為40.50 和 36.74 mg/L。

圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下同圖4　菌株JYD-4在不同培養(yǎng)時間的解磷量Bars with different letters are significantly different (P<0.05)；The same as belowFig.4　Phosphate solubilization capacity of strain JYD-4 in different culture periods

2.2.3不同氮源下解磷量將菌株JYD-4接種于含有不同氮源的蒙金娜液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，其也呈現(xiàn)出不同的解磷能力，且氮源間差異顯著(圖5，B)。其中，菌株JYD-4解磷量在以牛肉膏作為氮源時最高(75.54 mg/L)，以(NH4)2SO4為氮源時次之(68.94 mg/L)，且兩者顯著高于其余氮源處理，這可能是由于牛肉膏營養(yǎng)成分豐富，在充當(dāng)?shù)吹耐瑫r，也會提供碳源物質(zhì)，有利于菌株生長并提高其降解有機(jī)磷能力；當(dāng)分別以尿素和KNO3作為氮源時，JYD-4解磷量分別為53.88和52.53 mg/L，兩者差異不顯著；當(dāng)以NH4Cl作為氮源時，對應(yīng)的JYD-4解磷量為49.21 mg/L，略低于KNO3處理；當(dāng)以NaNO3作為氮源時，菌株JYD-4解磷量最低(46.29 mg/L)，并顯著低于除NH4Cl外的其它氮源。以上結(jié)果說明，在本試驗(yàn)的幾種氮源中，以牛肉膏蛋白胨作為氮源時，最有利于菌株JYD-4發(fā)揮解磷能力。

2.2.4不同初始pH下解磷量由圖5，C可知，菌株JYD-4在pH 7.0的培養(yǎng)基中解磷量最高(74.61 mg/L)，并顯著高于其它pH條件下的解磷量；在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的其它pH條件下，菌株JYD-4解磷量相差不大。其中，培養(yǎng)基初始pH值6.5、8.0和8.5處理對應(yīng)的JYD-4解磷量分別為59.07 、61.92 和58.05 mg/L，它們之間沒有顯著性差異；在初始pH分別為7.5、9.0和9.5的培養(yǎng)基中，菌株JYD-4解磷量相對較低，分別為54.15 、52.20 和52.62 mg/L，它們之間也沒有顯著性差異。上述結(jié)果表明，菌株JYD-4在培養(yǎng)基初始pH為7.0的培養(yǎng)條件下可以發(fā)揮最高解磷能力。

C1.葡萄糖；C2.蔗糖；C3.果糖；C4.半乳糖；C5.甘油；C6.淀粉；N1.硫酸銨；N2.氯化銨；N3.硝酸鈉；N4.硝酸鉀；N5.尿素；N6.牛肉膏圖5　不同碳源(A)、氮源(B)和pH(C)對菌株JYD-4解磷量的影響C1. Glucose; C2. Sucrose; C3. Fructose; C4. Galactose; C5. Glycerol; C6. Starch; N1. Ammonia sulfate; N2. Ammonia chloride; N3. Sodium nitrate; N4. Potassium nitrate; N5. Urea; N6. Beef extractFig.5　Effect of different C sources(A)，N sources(B) and pH(C) on phosphate solubilization capacity of strain JYD-4

2.3菌株JYD-4磷酸酯酶活性分析

一般認(rèn)為，微生物對有機(jī)磷的分解是通過分泌磷酸酯酶而實(shí)現(xiàn)的。為此，對菌株JYD-4的磷酸酯酶進(jìn)行了定域分析，并分別考察了不同溫度、不同pH對磷酸酯酶活性的影響。

2.3.1不同區(qū)域磷酸酯酶活性分別對菌株JYD-4的胞外、周質(zhì)空間和胞內(nèi)磷酸酯酶進(jìn)行提取，并進(jìn)行酶活測定。結(jié)果顯示(圖6)，胞外和周質(zhì)空間磷酸酯酶活性分別為8.75 和8.01 U/mL，而胞內(nèi)磷酸酯酶活性高達(dá)167.48 U/mL，是胞外和周質(zhì)空間的約20倍。該結(jié)果說明菌株JYD-4產(chǎn)生的磷酸酯酶主要存在于胞內(nèi)。

2.3.2不同溫度下磷酸酯酶活性分別測定菌株JYD-4在不同溫度條件下的胞內(nèi)磷酸酯酶活性。結(jié)果(圖7，A)表明，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的溫度范圍內(nèi)(20 ℃～65 ℃)，菌株JYD-4胞內(nèi)磷酸酯酶活性隨溫度增加呈“先減小后增大”的趨勢，并在35 ℃和40 ℃時酶活性最低(分別為105.31和101.63 U/mL)，且顯著低于其余溫度處理。在其余設(shè)定溫度條件下，菌株JYD-4磷酸酯酶活性較為穩(wěn)定，酶活性最高值(60 ℃對應(yīng)酶活165.51 U/mL)和最低值(55 ℃對應(yīng)酶活136.76 U/mL)之間僅相差28.75 U/mL。該結(jié)果說明菌株JYD-4的磷酸酯酶具有較廣的溫度適應(yīng)范圍，在高溫條件下仍具有一定的應(yīng)用潛力。

圖6　S. maltophilia JYD-4磷酸酯酶定域分析Fig.6　Phosphatase localization of S. maltophilia JYD-4

圖7　不同溫度(A)和pH (B)對磷酸酯酶活性的影響Fig.7　Effect of different temperatures (A) and pH (B) on phosphatase activity

2.3.3不同pH下磷酸酯酶活性如圖7,B所示，當(dāng)pH低于9.0時，菌株JYD-4胞內(nèi)磷酸酯酶活性極低，均在10 U/mL以下；當(dāng)pH值達(dá)到9.0時，磷酸酯酶活性急劇上升并達(dá)到最大值(164.53 U/mL)；隨著pH值的繼續(xù)升高，酶活性隨之迅速下降，在pH 9.5條件下降為85.16 U/mL，僅為pH 9.0條件下酶活性的一半。該結(jié)果表明，菌株JYD-4磷酸酯酶活性的發(fā)揮對pH條件要求較為嚴(yán)格，在pH 9.0左右條件下酶活性最高，暗示了菌株JYD-4產(chǎn)生的有可能為堿性磷酸酯酶。

2.4菌株JYD-4對南方紅豆杉的生長促進(jìn)作用

將JYD-4菌劑接種至南方紅豆杉根際1年后，植株長勢明顯高于對照組(圖8)。其中，菌株JYD-4接種處理后的南方紅豆杉實(shí)生苗的苗高、地徑和生物量分別比對照組提高了43.39%、24.11%和29.25%，且接種處理組的苗高還顯著高于對照組(表1)。該結(jié)果說明，菌株JYD-4接種能夠明顯促進(jìn)南方紅豆杉實(shí)生苗的生長。

圖8　S. maltophilia 菌株JYD-4對南方紅豆杉的促生長作用Fig.8　Growth-promoting effects of S. maltophilia strain JYD-4 on T. chinensis var. mairei表1　S. maltophilia 菌株JYD-4對南方紅豆杉的促生作用Table 1　Growth-promoting effects of S. maltophiliaJYD-4 on T. chinensis var. mairei

指標(biāo)Index處理TreatmentJYD-4CK苗高Seedlingheight/cm41.77±4.30a29.13±6.45b地徑Grounddiameter/mm6.95±0.28a5.60±0.21a生物量Biomass/g12.33±0.99a9.54±0.90a

注： 同行數(shù)據(jù)后不同字母表示對照與處理間存在差異顯著性(P≤0.05)

Note: Date with different letters in the same row indicate significantly difference between treatments and control at 0.05 level.

3　討　論

解磷微生物在土壤磷素循環(huán)過程中擔(dān)任著重要的角色。以微生物為基礎(chǔ)開發(fā)的各種微生物肥料已經(jīng)在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，該類肥料具有肥效高、本身無毒、不污染環(huán)境、成本低、節(jié)約能源等特點(diǎn)，是化學(xué)肥料的最有效替代品。目前，國內(nèi)外對磷細(xì)菌的研究大多集中于無機(jī)磷溶磷菌[18-20]。在土壤中，有機(jī)磷化物約占土壤總磷量的1/3～1/2。對有機(jī)磷降解菌的分離及應(yīng)用，將有助于最大化提高土壤磷利用率。本研究中分離得到的有機(jī)磷降解菌S.maltophiliaJYD-4，在本實(shí)驗(yàn)條件下其解磷量可高達(dá)75.54 mg/L 。欒麗英[8]和馬雪蕾[9]分別從葡萄根際分離得到解有機(jī)磷細(xì)菌，其最高解磷量分別為62.29 mg/L和52.02 mg/L；馮月紅[5]和朱穎[21]分別從小麥和三葉草根際分離得到解磷菌對卵磷脂的解磷量分別為44.00 mg/L和58.42 mg/L。和上述菌種相比，本研究分離得到的嗜麥寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)JYD-4菌株是一株有機(jī)磷高效降解菌。

生存環(huán)境的改變會影響到解磷菌的解磷能力，因此，本研究進(jìn)一步探究了不同培養(yǎng)條件對菌株JYD-4解磷能力的影響。當(dāng)以葡萄糖作為碳源時，菌株JYD-4解磷量明顯高于其它碳源；當(dāng)培養(yǎng)基中添加牛肉膏作為氮源時，菌株JYD-4解磷量也明顯升高，解磷能力也優(yōu)于其他氮源。推測認(rèn)為添加營養(yǎng)成分豐富的牛肉膏，既有利于菌株JYD-4生長，也有利于該菌株對卵磷脂的高效降解。在研究不同碳源、氮源和pH對菌株JYD-4解磷能力的影響過程中發(fā)現(xiàn)，即使是同樣的培養(yǎng)條件(葡萄糖為碳源，(NH4)2SO4為氮源，pH 7.0)，在不同批次的實(shí)驗(yàn)過程中菌株JYD-4的解磷量會在68.94～74.61 mg/L范圍內(nèi)波動。分析可能是由于菌種生理活性在不同批次實(shí)驗(yàn)中的差異造成的。RMN等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)在菌株的純化過程中部分解磷菌會失去解磷能力。在研究培養(yǎng)基初始pH值對菌株JYD-4解磷量的影響過程中，雖然菌株JYD-4在pH 7.0環(huán)境下具有最高解磷量，但在其它pH值環(huán)境下，菌株JYD-4依然能發(fā)揮52.20～61.92 mg/L的解磷量，該解磷量并不低于其它已報道有機(jī)磷降解菌。這說明S.maltophiliaJYD-4可以在pH 6.5～9.5范圍內(nèi)發(fā)揮穩(wěn)定的解磷能力，該菌株不僅可以在中性土壤環(huán)境中發(fā)揮解磷效果，促進(jìn)植物生長，還可作為微生物肥料用菌作用于偏酸和偏堿土壤環(huán)境中生長的植物。

截止到目前為止，盡管有很多學(xué)者對植物根際的磷細(xì)菌展開了大量研究，但不同來源的磷細(xì)菌對不同植物的促生效果也不同。一般而言，從植物根際分離得到的解/溶磷菌對該種植物具有更強(qiáng)的促生效果，而且該菌種的引入也不會破壞植物根際原有的微生態(tài)平衡。在研究前期，本研究組從南方紅豆杉根際分離得到了4株溶無機(jī)磷細(xì)菌，該菌種具有高效溶磷能力同時能夠促進(jìn)南方紅豆杉實(shí)生苗的生長[23]。在此基礎(chǔ)上，本研究又從南方紅豆杉根際分離得到解有機(jī)磷細(xì)菌S.maltophiliaJYD-4菌株。該菌種具有高效解有機(jī)磷能力，對南方紅豆杉實(shí)生苗生長具有明顯促進(jìn)作用。因此，本研究分離得到的S.maltophiliaJYD-4是一株集高效解磷和促生能力為一體的微生物菌種，該菌株為南方紅豆杉微生物肥料的開發(fā)提供了優(yōu)良的菌種資源，對于南方紅豆杉珍稀樹種的人工繁殖和資源保護(hù)具有重要意義。

關(guān)于細(xì)菌對有機(jī)磷的降解機(jī)制，目前普遍認(rèn)為是通過產(chǎn)生磷酸酯酶(又稱有機(jī)磷降解酶，organophosphorus acid hydrolase)對有機(jī)磷進(jìn)行降解[24-25]。本研究對S.maltophiliaJYD-4的胞外、周質(zhì)空間和胞內(nèi)磷酸酯酶分別進(jìn)行了粗提取和酶活性測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)磷酸酯酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于胞外和周質(zhì)空間；該酶對溫度要求非常寬泛，在高達(dá)65 ℃溫度條件下依然能保持較高酶活，但其對pH條件要求極為嚴(yán)格，僅能在pH 9.0條件下產(chǎn)生較高酶活性，該結(jié)果暗示了菌株JYD-4產(chǎn)生的磷酸酯酶有可能為堿性磷酸酯酶。而此前很多研究普遍認(rèn)為解磷菌主要通過產(chǎn)生酸性磷酸酯酶來分解有機(jī)磷[25-26]。

目前，已有多株有機(jī)磷降解菌的磷酸酯酶編碼基因被克隆，包括假單胞菌(Pseudomonassp.)[27-28]、黃桿菌(Flavobacteriumsp.)[29-30]、類單胞菌(Alteromonassp.)[31]、節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)[32]、鄰單胞菌(Plesiomonassp.)[33]、土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)[34]和紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)[35]等。根據(jù)目前已報道的磷酸酯酶的編碼基因序列，設(shè)計了多對引物，嘗試對S.maltophiliaJYD-4磷酸酯酶編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增。非常遺憾的是，目前并未擴(kuò)增得到S.maltophiliaJYD-4的磷酸酯酶編碼基因。推測，存在于不同菌種中的磷酸酯酶編碼基因可能存在多樣性，菌株JYD-4的磷酸酯酶編碼基因與目前已知的相關(guān)基因序列差異較大，結(jié)合菌株JYD-4產(chǎn)生堿性磷酸酯酶的推測，分析菌株JYD-4產(chǎn)生的磷酸酯酶在有機(jī)磷降解特性等方面可能存在獨(dú)特之處。在今后的工作中仍然會嘗試多種方法獲取S.maltophiliaJYD-4的磷酸酯酶編碼基因，從而更深入地了解微生物菌種對有機(jī)磷的降解機(jī)制。

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(編輯:裴阿衛(wèi))

Identification, Characterization and Growth-promoting Effects of an Organophosphate-solubilizing Bacterium fromTaxuschinensisvar.maireiRhizosphere

JIN Tingting, REN Jiahong*, LIU Ruixiang

(Department of Biological Science and Technology, Changzhi College, Changzhi, Shanxi 046011, China)

We isolated and identified an organophosphate-solubilizing bacterium JYD-4 from the rhizosphere ofTaxuschinensisvar.mairei. Molybdenum-antimony anti-spectrophotometric method was applied to investigate the effects of carbon sources, nitrogen sources and pH environments on organophosphate solubilization capacity. We also detected the effects of temperatures and pH on the phosphatase enzyme activity produced by strain JYD-4. The inoculation test in potted seedlings was carried out under the greenhouse. The results showed that: (1) strain JYD-4 was identified asStenotrophomonasmaltophilia. (2) The ratio of organophosphate-solubilizing circle diameter to colony diameter was 2.01. Organophosphate-dissolving ability in liquid medium was 72.38 mg/L. (3) Glucose and beef extract were identified as the optimal carbon source and nitrogen source for organophosphate-solubilizing. The optimal pH was 7.0. (4) Phosphatase produced byS.maltophiliaJYD-4 mainly located in the cell. The phosphatase could maintain stable activity in a wide temperature range (20-65 ℃), only conferred high activity at pH 9.0. (5)S.maltophiliaJYD-4 was able to improve the seedling height, ground diameter and biomass of the seedlings ofT.chinensisvar.mairei. The results showed thatS.maltophiliaJYD-4 is a highly effective organophosphate-solubilizing bacterium. It could significantly promote the growth ofTaxuschinensisvar.mairei. Results in this paper provide excellent strain for the development of microbial fertilizer ofT.chinensisvar.mairei, and provide theory evidences for the application ofS.maltophiliaJYD-4.

Organophosphate-solubilizing bacterium;Taxuschinensisvar.mairei;Stenotrophomonasmaltophilia; Phosphate-solubilizing characteristics; Phosphatase, Growth-promoting effects

1000-4025(2016)09-1819-09doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1819

2016-05-28;修改稿收到日期:2016-09-01

國家自然科學(xué)基金(31100471)；山西省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目

晉婷婷(1987-)，女，博士，講師，主要從事資源微生物研究。E-mail：jintingi@163.com

任嘉紅，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事森林微生物研究。E-mail：renjiahong@163.com

Q93-331; Q939.99

A