趙艷玲,王海峰,王兆錠,樊永軍*

(1 包頭師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014030；2 包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品藥品工程學(xué)院, 內(nèi)蒙古包頭 014035；3 內(nèi)蒙古賀蘭山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局,內(nèi)蒙古阿拉善 750306)

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內(nèi)蒙古賀蘭山某塊菌的形態(tài)解剖學(xué)與分子生物學(xué)研究

趙艷玲1,王海峰2,王兆錠3,樊永軍1*

(1 包頭師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014030；2 包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品藥品工程學(xué)院, 內(nèi)蒙古包頭 014035；3 內(nèi)蒙古賀蘭山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局,內(nèi)蒙古阿拉善 750306)

利用形態(tài)解剖學(xué)和分子生物學(xué)方法,對(duì)采自內(nèi)蒙古賀蘭山地區(qū)實(shí)驗(yàn)樣地青海云杉林下的塊菌兩菌株(菌株a和b)進(jìn)行分析鑒定。研究發(fā)現(xiàn)：(1)兩菌株子囊果均為黃褐色，表面光滑，沒(méi)有明顯的疣狀突起和棱角。(2)菌株a產(chǎn)孢組織乳白色、致密團(tuán)狀，菌肉組織褐色；球形、棒狀子囊呈蜂窩狀排布，內(nèi)含有1～4個(gè)帶包被的、表面具有突起狀紋飾的球型子囊孢子；子囊孢子雙層壁，厚約1.7 μm，直徑約20 μm(含紋飾)。(3)菌株b產(chǎn)孢組織有裂隙，松散，子實(shí)層內(nèi)除了具有上述蜂窩狀排布的子囊和內(nèi)部的球型孢子外，還具有“口袋”狀子囊，該子囊內(nèi)含有大量?jī)啥思?、外壁光滑、褐色的橢球型孢子。(4)分子生物學(xué)進(jìn)化分析表明，兩菌株聚為一支，但屬于塊菌屬的支持率相對(duì)較低；推斷兩菌株可能為中國(guó)豬塊菌屬Choiromyces新記錄種。

賀蘭山；塊菌; 子囊果；子囊；子囊孢子;解剖學(xué)；進(jìn)化樹

近年來(lái)，關(guān)于塊菌(Tuber)的采集、分類和鑒定工作一直是國(guó)內(nèi)學(xué)者研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[1-4]。王云[1]認(rèn)為東亞尤其是中國(guó)的塊菌屬資源豐富且獨(dú)特，尚存在大量的未被發(fā)現(xiàn)或描述的新分類群。同時(shí)指出塊菌主要分布于中國(guó)的東北到西南地區(qū)這一條帶上。有研究者對(duì)中國(guó)塊菌屬進(jìn)行研究，其塊菌材料主要分布在吉林、遼寧、北京、內(nèi)蒙古赤峰、山西、成都、昆明和西藏等地[5-6]。陳應(yīng)龍認(rèn)為，在中國(guó)塊菌主要分布在西南的四川和云南，以及新疆、西藏、山西、遼寧、吉林、福建等省區(qū)[7]。目前，鮮見關(guān)于賀蘭山塊菌資源的報(bào)道。賀蘭山脈位于寧夏回族自治區(qū)與內(nèi)蒙古自治區(qū)交界處。山脈為近南北走向，具有日照充足，氣候多變等特點(diǎn)[8]。由于其特殊的地理環(huán)境和生態(tài)因子, 孕育了垂直帶變化明顯的植物類群，同時(shí)為多種大型真菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供了十分有利的條件[9]。本研究針對(duì)采自內(nèi)蒙古賀蘭山地區(qū)的真菌材料進(jìn)行形態(tài)解剖學(xué)和分子生物學(xué)分析，以期為豐富賀蘭山真菌資源多樣性和中國(guó)塊菌的系統(tǒng)分類研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

兩真菌試驗(yàn)材料于2015年1月采自賀蘭山地區(qū)實(shí)驗(yàn)樣地青海云杉林下，并暫分類為菌株a和b。兩菌株采集地理信息為：海拔2 757 m, E105°57′12.90″，N38°11′27.24″。

1.2研究方法

1.2.1形態(tài)解剖學(xué)分類1) 外部形態(tài)觀察。觀察內(nèi)容主要包括子囊果的外部形態(tài)、顏色；菌體表面是否具疣狀突起；菌脈的密集程度、粗細(xì)等特征。

2) 內(nèi)部顯微觀察。觀察內(nèi)容包括：包被、產(chǎn)孢組織的顏色和結(jié)構(gòu)等。同時(shí)，在解剖鏡(Nikon-JSZ5)下觀察拍照。

3) 掃描電鏡觀察。菌株經(jīng)3%戊二醛前固定24 h，吸除固定液，加入0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.2)漂洗2～3次，再用1%鋨酸固定2 h，吸除固定液，以雙蒸水洗2 h(中間換3次新液)；用50%、70%、80%、90%乙醇逐級(jí)脫水，每次20 min，吸除乙醇，再用無(wú)水乙醇脫水兩次，每次20 min；將菌株取出用日立HCP-2臨界點(diǎn)干燥儀進(jìn)行CO2臨界點(diǎn)干燥，用日立IB-5真空離子濺射儀進(jìn)行噴金處理，用日立S-570掃描電子顯微鏡和Hitachi S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察并拍照。觀察記錄子囊的形狀、大小以及子囊內(nèi)孢子的數(shù)目；子囊孢子的形狀、大??；表面的紋飾(刺、網(wǎng)格或刺-網(wǎng)格)等。

1.2.2分子生物學(xué)研究采用常規(guī)CTAB 法提取兩菌株基因組DNA，以ITS1f(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGC-TTATTGATATGC-3′)為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為：50 μL體系，94 ℃預(yù)變性 5 min,94 ℃變性 40 s, 57 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 72 ℃ 10 min，共30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，用Biospin真菌回收試劑盒割膠回收純化，純化產(chǎn)物交由生工上海測(cè)序部測(cè)序。

2　結(jié)果與分析

2.1外部形態(tài)觀察

兩菌株子囊果近球形或橢球形，未見子囊柄。表面光滑，不具有疣狀突起，呈紅褐色，有不規(guī)則的溝狀凹陷。子囊果直徑約2～4 cm。新鮮子囊果具特殊香氣(圖1，A、B)。馬麝(Moschuschrysogaster)喜食該菌體[10]。

2.2內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)觀察

2.2.1子實(shí)體橫切面觀察由兩菌株子囊果的橫切面可以看出，菌體外觀呈黃褐色，光滑，無(wú)明顯的疣狀突起；菌體邊緣具薄的包被；包被內(nèi)子實(shí)層具迷走狀脈紋和褐色菌肉組織。菌株a的子實(shí)層致密，呈乳黃色大理石菌脈封閉，迷走團(tuán)狀，在多處可到達(dá)包被邊緣處(圖1，C)。菌株b子實(shí)層較松散，在子實(shí)層內(nèi)肉眼可見黑色顆粒狀子囊，菌脈同樣封閉，呈迷走狀(圖1，D)。

菌株a子實(shí)層內(nèi)形成淺黃色脈紋(明紋)，并與外圍不育菌絲形成的菌肉組織形成的暗紋呈明顯對(duì)比。菌株b側(cè)絲構(gòu)成的菌肉組織較窄；子實(shí)層中有裂隙。分析原因，可能是由于產(chǎn)孢組織中不斷發(fā)育的子囊和子囊孢子不斷擠壓側(cè)絲造成。

2.2.2掃描電鏡觀察由圖2掃描電鏡照片可見，菌株a產(chǎn)孢組織內(nèi)具大量蜂窩狀分布的棒狀、球形子囊(圖2,A)。單個(gè)成熟子囊中常含1～4個(gè)子囊孢子(圖2,B)，子囊孢子球形、游離狀分布、雙層壁，壁厚約1.7 μm(不含紋飾,圖2,C)。外壁上每3～4個(gè)呈圓形坑狀的網(wǎng)眼交匯處形成一個(gè)具有明顯的、完整的、均勻的指狀突起(圖2,D)。由圖2，B可見，子囊內(nèi)的子囊孢子具有膜狀的包被。龍?jiān)戮闧11]研究印度塊菌子囊果的發(fā)育認(rèn)為，具有雙層膜的子囊孢子在發(fā)育后期，外膜分化斷開與內(nèi)膜共同形成雙層膜，且外膜在分化、斷裂之前就有明顯的刺狀突起紋飾。電鏡照片中的孢子(圖2,B)不屬于這一發(fā)育階段。因?yàn)樵摼曜幽覂?nèi)的膜(圖2,B)是平整光滑的，且包裹著的子囊孢子已經(jīng)具有突起狀紋飾?？梢?，在該階段子囊孢子的內(nèi)膜和帶紋飾的次生壁已經(jīng)形成，說(shuō)明子囊孢子已經(jīng)發(fā)育完成，而該膜應(yīng)屬于子囊膜。

圖1　菌株a(A,C)和b(B,D)子囊果的形態(tài)結(jié)構(gòu)和切面圖Fig.1　The morphological features and the section of strain a and b

A.菌體表面掃描(×60)；B.子囊和帶有包被的子囊孢子(×1 000)；C.子囊孢子的雙層壁(×1 000)；D.子囊孢子的突起狀紋飾(×2 457)圖2　菌株a掃描電鏡系列照片A.Surface scanning, ×60; B.Sac and ascospore with package, ×1 000; C.The scanning a double wall of ascospore, ×1 000; D.Protrusions ornamentation of ascospore,×2 457Fig.2　Photos of strain a under scanning electron microscope (SEM)

A.表面掃描結(jié)構(gòu)(×150)；B.子囊孢子及子囊掃描結(jié)構(gòu)(×600)；C.子囊果內(nèi)呈蜂窩狀子囊及球型、橢球形子囊孢子(×300)；D.橢球形的子囊孢子(×3000)圖3　菌株b掃描電鏡系列照片A.Surface scanning,×150; B.Sac like pocket,×600; C. The scanning of ascus like honeycomb and spherical and ellipsoidal ascospore with SEM,×300; D. Amplification of ellipsoid ascospore,×3 000Fig.3　Photos of strain a under scanning electron microscope (SEM)

由圖3掃描電鏡照片可見，菌株b產(chǎn)孢組織內(nèi)子囊的形狀較不規(guī)則。除了呈蜂窩狀分布的棒狀、圓球狀子囊外，還有似“口袋”結(jié)構(gòu)的子囊。蜂窩狀分布的子囊內(nèi)含有表面具疣狀突起和網(wǎng)紋結(jié)構(gòu)的球型、近球形子囊孢子；而似“口袋”結(jié)構(gòu)的子囊內(nèi)含有大量褐色、兩端呈“芒果尖”狀的橢球型孢子(圖3,D)。

綜合以上結(jié)果可知，菌株a子囊果內(nèi)的單個(gè)子囊中含有1～4個(gè)子囊孢子，常見3～4個(gè)子囊孢子。子囊(48)～74～(98) μm×(41)～48～(53) μm，具有薄膜狀包被的球型子囊孢子的直徑約為18.3～20～22.0 μm (含子囊孢子的紋飾)，子囊孢子紋飾的突起高(1)～2～(2.5) μm。電鏡下，突起低于2 μm的紋飾呈乳突狀，高于2 μm的紋飾呈指狀突起。所以該菌株的子囊孢子外壁上的紋飾特征以指狀或者乳突狀的紋飾為主。

菌株b，菌體內(nèi)主要有兩種類型的子囊。蜂窩狀分布的棒狀子囊內(nèi)含1～4個(gè)子囊孢子，常見3～4個(gè)子囊孢子，子囊(42)～63～(88) μm×(38)～42～(61) μm，球型子囊孢子直徑(含表面突起狀的紋飾)(15)～20～(22) μm，該子囊里的子囊孢子的紋飾與菌株a的極為相似；菌株b子囊果內(nèi)的似“口袋”的子囊囊徑(59)～96～(139) μm，該子囊內(nèi)存在大量的沒(méi)有子囊包被的兩端呈“芒果尖”、表面光滑、褐色橢球形子囊孢子(17)～21～(25) μm×(12)～14～(16) μm。

2.3分子生物學(xué)分析

采用CTAB法提取的兩菌株基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，純化后測(cè)序，將測(cè)得的兩菌株的序列經(jīng)Chromas軟件進(jìn)行序列校準(zhǔn)，運(yùn)用GenBank 的序列局部相似性查詢系統(tǒng)(Blast)，引用 DNA 基因庫(kù)中同源菌株rDNA的ITS(Internal Transcribed Spacer，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))區(qū)段序列，然后運(yùn)用軟件MEGA5.1 采用Neighbor-Joining Tree(相鄰比對(duì)法)分別對(duì)兩供試菌種進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建(圖4)，由圖可知，菌株a和b被聚在一起，且與Tubertaiyuanense(太原塊菌)和Tubertexense(德州塊菌，=T.lyoniiBtters(萊氏塊菌)[4])為一枝。

圖4　基于rDNA ITS序列的Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4　Neighbor-joining phylogenetic tree based on partial rDNA ITS sequences of strain a and b

3　討　論

本研究中兩菌株子囊果均呈黃褐色，表面無(wú)明顯的疣狀突起，子囊近球形至不規(guī)則形，不具明顯的棱角。子實(shí)層內(nèi)具有不育菌絲形成的褐色菌肉和乳白色、呈迷走狀的產(chǎn)孢組織。其中，菌株a致密的產(chǎn)孢組織內(nèi)具有呈蜂窩狀分布的球形、棒狀子囊，內(nèi)含有典型的突起狀紋飾的球型孢子，突起紋飾的高度約2 μm，孢子直徑(含紋飾)約20 μm；菌株b子實(shí)層松散，有裂隙，產(chǎn)孢組織內(nèi)不但具有蜂窩狀分布的子囊和球型孢子，還具有似“口袋”的大子囊，其內(nèi)含有大量的褐色、表面光滑、兩端“芒果尖”狀橢球型孢子。

與龍?jiān)戮甑萚11-12]描述的印度塊菌形態(tài)結(jié)構(gòu)略有不同，本研究中菌株子囊果橫切面上的明暗相間的紋脈中的明脈呈亮色，可能是由于產(chǎn)孢組織內(nèi)蜂窩狀排布的子囊和子囊孢子腔室的存在而呈現(xiàn)亮色；不可育菌絲纏繞在產(chǎn)孢組織的外圍構(gòu)成褐色菌肉組織而呈現(xiàn)暗紋。同時(shí)，子囊果的包被構(gòu)造顯示，包被較薄，且外部無(wú)明顯的疣狀突起。這些特點(diǎn)又區(qū)別于黑孢塊菌、夏塊菌、冬塊菌等塊菌[3-4，6-7]。而在兩菌株子實(shí)層內(nèi)，蜂窩狀排布的子囊以及其內(nèi)具有的1～4個(gè)子囊孢子，這與龍?jiān)戮甑萚12]的研究結(jié)果相同；但是對(duì)于該球型孢子和呈“口袋”狀子囊內(nèi)的光滑型、兩端“芒果尖”狀的橢球形孢子，明顯區(qū)別于中國(guó)已經(jīng)報(bào)道的各塊菌類群的子囊孢子[2-4，13-14]。然而，對(duì)于這種褐色、外壁光滑、兩端芒果尖的橢球型孢子，有學(xué)者認(rèn)為外壁光滑的孢子是敗育的子囊孢子，具體原因目前還沒(méi)有統(tǒng)一的說(shuō)法[11-12]。

對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，菌株a和b聚為一枝，但與其它塊菌屬成員的相對(duì)支持率較低。結(jié)合形態(tài)解剖學(xué)的研究，推斷菌株a和b可能是新發(fā)現(xiàn)類群。根據(jù)Gabriel[15]和Chen[16]的研究，從形態(tài)解剖學(xué)角度，筆者認(rèn)為本研究描述的兩菌株可能屬于豬塊菌屬Choiromyces。原因是除了本研究中描述的菌體包被薄、菌體外無(wú)明顯刺突、菌絲屬于交織組織等特點(diǎn)與豬塊菌屬Choiromyces相一致外，本研究中帶刺突紋飾的球狀類型孢子與Choiromycesmagnusii電鏡照片[15]中的孢子在大小、形態(tài)等方面極為相似。1990年，劉波等報(bào)道中國(guó)關(guān)于蜂窩孢豬塊菌Choiromycesalevolatus的新記錄[17]。所以進(jìn)一步推斷，本文中的菌株a和b可能是豬塊菌屬Choiromyces的中國(guó)新記錄種。Choiromyces屬是Tuberaceae(塊菌科)的一個(gè)屬，該屬1831年被Vittadini首次描述[15]。有學(xué)者研究該屬與Tuber屬的親緣關(guān)系比Terfezia地菇屬近[18]。Kirk等[19]認(rèn)為該屬有5個(gè)種，但Gabriel[15]提到的有10種之多。豬塊菌屬Choiromyces在國(guó)外有很多別稱，例如“豬塊菌(豬的松露)”、“高加索塊菌”、“高加索地區(qū)的松露”、“特蘭西瓦尼亞的白松露”、“匈牙利松露”等[15]。

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(編輯:潘新社)

Anatomy and Molecular Biology Study of Truffles Discovered in Helan Mountain of Inner Mongolia

ZHAO Yanling1, WANG Haifeng2, WANG Zhaoding3, FAN Yongjun1*

(1 Department of Biological Sciences and Technology, Baotou Teacher’s College, Baotou, Inner Mongolia 014030, China; 2 The Food and Drug Engineering College, Baotou Light Industry Vocational Technical College, Baotou, Inner Mongolia 014035, China; 3 Inner Mongolia Helan Mountain National Nature Reserve Administration, Ala Shan, Inner Mongolia 750306, China)

The two samples of truffles collected in the Helan Mountain region of Inner Mongolia were studied by Anatomy and molecular biology. (1) Two strains of ascoma were tan, smooth surface, no obvious verrucous protuberance and edges. (2) Gleba of strain a is ivory, dense and vagus veins. Hyphae organization is brown; Spherical or rod-shaped ascus in honeycomb arrangement contained 1-4 ascospore with package; the surface ascospore had a protuberant ornamentation and was spherical. Thickness of double wall was about 1.7 um, diameter 20 microns (including ascospore grain). (3) Gleba of strain b had cracks, loose, in addition to the above ascus and spore, also possessed a special ascus like “pocket” containing a large number of sharp, smooth, brown ellipsoidal spores. (4) Molecular evolution analysis shows that the two strains into one, but there is a relatively low approval ratings for genusTuber. Therefore, the two strains were concluded that they might be a new record species of genusChoiromycesin China.

Helan Mountain; truffles; ascoma; ascus; ascospore; anatomical study; phylogenetic

1000-4025(2016)09-1781-06doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1781

2016-06-15;修改稿收到日期:2016-09-06

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2014MS0302，2016MS0301 )；國(guó)家自然科學(xué)基金(31260132，31460188 )

趙艷玲(1978-)，女，博士，副教授，主要從事真菌資源利用研究。E-mail:nmzhaoyanling@163.com

樊永軍，教授，主要從事菌根學(xué)研究。E-mail:fanyj1975@163.com

Q246; Q248; Q789

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