李寧寧, 齊　菲, 安滿霞, 李　瑜, 張文波, 林曉飛*

(1 內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021；2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，呼和浩特 010019)

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3種錦雞兒屬植物過氧化物酶基因的克隆及表達(dá)分析

李寧寧1, 齊菲1, 安滿霞1, 李瑜1, 張文波2, 林曉飛1*

(1 內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021；2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，呼和浩特 010019)

采用同源克隆技術(shù)分離了3種錦雞兒屬植物檸條錦雞兒(Caraganakorshinskii)、小葉錦雞兒(C.microphylla)和中間錦雞兒(C.intermedia)的過氧化物酶(POD)基因(分別命名為CkPOD、CmPOD和CiPOD)，并對它們在干旱脅迫條件下的表達(dá)特征進(jìn)行了分析。CkPOD、CiPOD、CmPOD基因的cDNA序列均包含有1 074 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼的蛋白質(zhì)由357個氨基酸構(gòu)成，分子量為38.7 kD。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示：3種錦雞兒屬植物的POD可以和鷹嘴豆等豆科植物的POD聚為一類，且CkPOD和CmPOD具有較近的親緣關(guān)系，CiPOD與CkPOD和CmPOD的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，這一結(jié)果與3種錦雞兒屬植物的進(jìn)化地位一致，顯示POD基因較為保守，可以為錦雞兒屬植物的系統(tǒng)分類提供參考。PEG模擬干旱脅迫能夠強烈誘導(dǎo)CkPOD、CiPOD和CmPOD基因的表達(dá)，顯示POD基因在錦雞兒屬植物抵御干旱脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。研究結(jié)果可為解析錦雞兒屬植物的耐旱機理以及利用錦雞兒屬植物進(jìn)行荒漠改良和生態(tài)修復(fù)提供理論和實驗依據(jù)。

錦雞兒；POD；基因克隆；基因表達(dá)；干旱脅迫；系統(tǒng)進(jìn)化分析

過氧化物酶(Peroxidase，POD)是一種以血紅素為輔基的氧化酶，廣泛存在于動植物體中，可催化過氧化氫和有機過氧化物對各種有機物和無機物的氧化作用[1-2]。過氧化物酶家族可分為三類, 第一類是與細(xì)菌過氧化物酶相關(guān)的胞內(nèi)過氧化物酶，例如抗壞血酸鹽過氧化物酶或啤酒酵母的細(xì)胞色素c過氧化物酶等；第二類是真菌分泌的過氧化物酶，例如木質(zhì)素過氧化物酶或錳過氧化物酶；第三類是具有信號肽并通過分泌途徑起作用的植物過氧化物酶，該類過氧化酶在植物中廣泛存在[3-4]。前人的研究結(jié)果表明，POD參與植物的形態(tài)建成，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，例如：植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白交聯(lián)、木質(zhì)素聚合、栓化作用、激素誘導(dǎo)、生長素的降解和異化以及衰老等[5-11]。另一方面，POD作為植物保護(hù)酶系統(tǒng)的重要成員之一參與植物抵御逆境反應(yīng)。它通過與超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)相互協(xié)調(diào)配合，清除細(xì)胞內(nèi)過剩的自由基，使體內(nèi)自由基維持在正常的動態(tài)平衡，以減少逆境對植物體造成的氧化損傷。植物中的過氧化物酶既有組成型表達(dá)的，也有誘導(dǎo)型表達(dá)的。在病原菌侵染、冷凍、干旱、重金屬離子、機械損傷等生物和非生物脅迫條件下，POD能夠被誘導(dǎo)表達(dá)[12-21]。特別是在干旱脅迫條件下，植物體內(nèi)的POD活性會明顯升高，顯示POD能夠在植物抵御干旱脅迫中發(fā)揮作用[22-24]。目前，在植物抗逆品種的選育工作中，POD活性常常被作為苗期篩選抗性材料的生化指標(biāo)[25]。

錦雞兒屬(CaraganaFabr.)植物是豆科多年生落葉灌木，廣泛分布于中國西北地區(qū)的荒漠地帶，具有較強的抗旱能力，是干旱、半干旱地區(qū)常見的防風(fēng)固沙及沙地牧場改良的優(yōu)良樹種。在過去的100年里，由于人類的過度干預(yù)，中國西北地區(qū)黃土高原地帶自然植被被大量破壞。在20世紀(jì)中葉，該地區(qū)實施了大規(guī)模的植被修復(fù)工程[26]。由于檸條錦雞兒(C.korshinskii)、中間錦雞兒(C.intermedia)和小葉錦雞兒(C.microphylla)具有強大的根系和廣泛的適應(yīng)性，故而作為理想的植物材料被廣泛用于生態(tài)修復(fù)工程。因此，比較研究這3種錦雞兒屬植物的耐旱機制，可為它們在生態(tài)修復(fù)工程中的合理利用提供依據(jù)。在前期研究中調(diào)查了干旱脅迫條件下這3種錦雞兒屬植物SOD基因的表達(dá)特征[27]，本工作克隆了該3種植物的POD基因，并比較分析了它們在干旱脅迫下的表達(dá)特性，以期為研究錦雞兒屬植物的抗旱分子機理及利用錦雞兒屬植物進(jìn)行荒漠改良和生態(tài)修復(fù)提供理論和實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

本研究的初始材料為檸條錦雞兒、中間錦雞兒和小葉錦雞兒的種子。檸條錦雞兒種子采自巴彥淖爾狼山前沖積扇錦雞兒灌叢，中間錦雞兒種子采自準(zhǔn)格爾黃上丘陵溝壑區(qū)中間錦雞兒灌叢，小葉錦雞兒采自錫林格勒錫林河流域小葉錦雞兒灌叢。挑選飽滿、均一無蟲蛀的種子，經(jīng)75%乙醇和0.1%升汞消毒后，置于鋪有3層濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)萌發(fā)。取長勢一致的幼苗移栽于盛有石英砂的容器中，置于25℃、14 h/d光周期、光照強度36～40 μmol·m-2·s-1的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并定時定量澆灌1/2 Hoagland營養(yǎng)液。生長7周左右的幼苗用于提取RNA。

主要試劑：TaKaRa RNA Extraction Kit(TaKaRa)、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0、克隆載體pMD-19T(TaKaRa)、SMART RACE cDNA Ampliication Kit(Clontench)、DNA Gel Extraction Kit(AXYGEN)、Takara RT-PCR Kit(TaKaRa)、大腸桿菌感受態(tài)(Escherichiacoli)DH5a(TaKaRa)、TransScript All-in-One First-Strand cDNA synthesis SuperMix(TransGen)和TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TransGen)等。其他生化及分子生物學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。本研究所有引物合成及測序工作均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2實驗方法

1.2.13種錦雞兒屬植物POD基因的克隆利用ClustalW軟件對GenBank已登錄的亞麻(Linumusitatissimum，AAB47602.1)、紫花苜蓿(Medicagosativa，AAB41811.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，AAA32842.1)、野生蘿卜(Armoraciarusticana，CAA40796.1)和大豆(Glycinemax，AAL40127.1)過氧化物酶的氨基酸序列進(jìn)行多重同源比對，在保守區(qū)域設(shè)計1對兼并引物Deg-POD-F(5′-CAYTTYCAYGAYTGYTTYGT-3′)和Deg-POD-R(5′-GTRTTNARNGTNGGRTCNGG-3′)。

利用TaKaRa RNA Extraction Kit提取3種錦雞兒屬植物的總RNA，并采用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以檸條錦雞兒cDNA為模版，利用Deg-POD-F和Deg-POD-R兼并引物，經(jīng)PCR擴增CkPOD基因片段。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs(各2.5 mmol/L)2.0 μL、Deg-POD-F(50 μmol/L)1.0 μL、Deg-POD-R(50 μmol/L)1.0μL、TakararTaq(5 U/μL)0.2 μL，加去離子水至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，47.5 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

根據(jù)已獲得的CkPOD基因序列設(shè)計該基因的特異性引物POD-GSP-R(5′-GAGCAGCAAGGGCAA-GAATATCAGC-3′)；POD-GSP-F(5′-CTGCTCTTTAT-TCGTGGACCG-3′)，用于末端克隆。利用SMART RACE cDNA Ampliication Kit試劑盒合成cDNA第一鏈，利用POD-GSP-R和試劑盒提供的UPM引物擴增CkPOD的5′末端序列。PCR反應(yīng)體系為：10×ExPCR buffer 2.5 μL、dNTPs(各2.5 mmol/L)2.0 μL、MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL、POD-GSP-R(10 μmol/L)1.0 μL、UPM(10×)2.5 μL、TakaraExTaqHS(5 U/μL)0.2 μL，加去離子水至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。利用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0試劑盒提供的Oligo(dT)引物，以檸條錦雞兒總RNA為模版合成cDNA第一鏈，使用POD-GSP-F和M13M4引物擴增CkPOD3′末端序列。PCR反應(yīng)體系為：10×ExPCR buffer 2.5 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)各2.0 μL、MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL、POD-GSP-F(10 μmol/L)1.0 μL、M13M4(10 μmol/L)1.0 μL、TakaraExTaqHS(5 U/μL)0.2 μL，加去離子水至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

根據(jù)RACE-PCR獲得的CkPOD末端序列，在其上下游分別設(shè)計引物Full-POD-F(5′-ATGAAGTACTCCCTTCGTCTC-3′)和Full-POD-R(5′-TGTCATGGATGTGCC-3′)。分別以3種錦雞兒屬植物的cDNA為模版，利用Full-POD-F和Full-POD-R引物，擴增檸條錦雞兒、中間錦雞兒和小葉錦雞兒POD cDNA全長序列。PCR反應(yīng)體系為：10×ExPCR buffer 2.5 μL、dNTPs(各2.5 mmol/L)2.0 μL、MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL、Full-POD-F(10 μmol/L)1.0 μL、Full-POD-R(10 μmol/L)1.0 μL、TakaraExTaqHS(5 U/μL)0.2 μL，加去離子水至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，49 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用DNA Gel Extraction Kit回收目的片段，與克隆載體pMD-19T連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，將PCR檢測為陽性的重組菌進(jìn)行擴大培養(yǎng)后送上海英駿生物技術(shù)有限生公司測序。

1.2.23種錦雞兒POD基因的生物信息學(xué)分析將所克隆的3種錦雞兒屬植物PODcDNA序列進(jìn)行BlastX同源性比對；利用NCBI的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)識別ORF，并將其翻譯成相應(yīng)氨基酸序列；利用 ExPASy數(shù)據(jù)庫的PortParam軟件(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)對編碼的氨基酸序列的基本性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測。在GenBank中搜索不同植物POD基因的氨基酸序列，與3種錦雞兒屬植物的POD氨基酸序列進(jìn)行Clustal W多重比對，并利用MEGA5.0軟件的鄰接法(neighbor-joining，N-J法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.33種錦雞兒屬植物POD基因在干旱脅迫下的表達(dá)檢測為了比較分析這3種錦雞兒屬植物POD基因在干旱脅迫下的表達(dá)特性，將生長7周左右的幼苗分別進(jìn)行5%、15%和25% PEG模擬干旱脅迫，并分別在第1天、第3天、第5天和第7天提取脅迫處理的3種錦雞兒屬植物的總RNA，利用Roche LightCycler480 II系統(tǒng)進(jìn)行實時熒光定量PCR對其表達(dá)量進(jìn)行檢測。根據(jù)已獲得的3種錦雞兒屬植物POD基因序列設(shè)計特異性引物POD-RT-F(5′-TGATATTCTTGCCCTTGC-3′)和POD-RT-R(5′-GGCTTTGGTTGGCTGTTA-3′)，利用檸條錦雞兒的肌動蛋白基因(CkActin，F(xiàn)J485727.1 Ck-ACT-RT-F:5′-CAACCCTAAGGCTAATCG-3′, Ck-ACT-RT-R:5′-GCATAAAGGGAAAGGACA-3′)作為內(nèi)參，使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA synthesis SuperMix試劑盒合成cDNA；并使用TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TransGen)試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR。反應(yīng)體系為：2×TS Tip Super Mix 10 μL、Primer-F(POD-RT-F和 Ck-ACT-RT-F，10 μmol/L)0.4 μL、Primer-R(POD-RT-R和 Ck-ACT-RT-R，10 μmol/L)0.4 μL、cDNA 1.0 μL，加去離子水至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 s；95 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，48個循環(huán)；溶解曲線從65～97 ℃。所有實驗均進(jìn)行3次重復(fù)，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析并繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.13種錦雞兒屬植物POD基因的克隆

2.1.1檸條錦雞兒POD基因片段及末端序列的克隆以檸條錦雞兒總RNA反轉(zhuǎn)錄所合成的cDNA第一鏈為模板，利用在POD保守區(qū)域設(shè)計的兼并引物Deg-POD-F和Deg-POD-R，通過RT-PCR擴增獲得了500 bp的基因片段(圖1，A)。Blast X分析顯示，所獲得的序列與其他高等植物POD基因序列具有高度同源性，可初步確定其為檸條錦雞兒的POD基因片段，并將其命名為CkPOD。根據(jù)已獲得的500 bp的CkPOD基因序列設(shè)計特異性引物POD-GSP-F和POD-GSP-R，采用RACE技術(shù)分離了CkPOD的3′末端序列570 bp(圖1，B)和5′末端序列500 bp(圖1，C)。

2.1.23種錦雞兒屬植物POD基因全長序列的克隆由于檸條錦雞兒、中間錦雞兒和小葉錦雞兒的親緣關(guān)系較近，故而利用同源克隆的方法進(jìn)行該3種植物POD基因序列的分離。在CkPOD的5′末端設(shè)計引物Full-POD-F、3′末端設(shè)計引物Full-POD-R，分別以3種錦雞兒屬植物總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈為模版，經(jīng)PCR擴增獲得了1 074 bp的基因序列(圖2)。通過測序和分析后證它們是檸條錦雞兒、中間錦雞兒和小葉錦雞兒POD基因的cDNA序列。

M. 100 bp Ladder Marker; 1. 兼并PCR產(chǎn)物；2. 3′-RACE；3. 5′-RACE圖1　兼并PCR和RACE-PCR產(chǎn)物M. 100bp Ladder Marker; 1. Product of degenerate PCR；2. 3′-RACE；3. 5′- RACEFig.1　Products of degenerate PCR and RACE-PCR

2.23種錦雞兒屬植物POD基因序列分析CkPOD、CiPOD和CmPOD基因cDNA均包含1 074 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼357個氨基酸。利用ExPASy數(shù)據(jù)庫中的PortParam軟件在線分析結(jié)果顯示，CkPOD、CiPOD和CmPOD的蛋白分子量均為38.7 kD，理論等電點分別為6.98、6.09和6.59。利用在線軟件TargetP進(jìn)行分析結(jié)果顯示，3種植物的POD均為分泌途徑中的蛋白，且均具有28個氨基酸的信號肽 (圖3)?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，3種植物的POD蛋白均具有3個跨膜結(jié)構(gòu)域(7～26 aa，119～144 aa，182～201 aa，圖3)。絕大多數(shù)植物Ⅲ型POD保守的8個半胱氨酸殘基也被發(fā)現(xiàn)在所克隆的3個基因序列中(40～120、73～78、126～328和205～237位)，它們分別形成4個緊密相連的二硫鍵橋以維持酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。另外，以Asp-72、Asp-79、Ser-81、Val-75和Gly-77為中心的Ca2+結(jié)合位點構(gòu)成遠(yuǎn)端的氧供體結(jié)構(gòu)域，而以Thr-199、Asp-250、Thr-253、Asp-258和Val-256為中心的Ca2+結(jié)合位點則構(gòu)成了近端氧供體結(jié)構(gòu)域。位于2個結(jié)構(gòu)域中間的血紅素則由Fe2+與His-71和His-198形成共價鍵，構(gòu)成活性中心；His-198與Asp-275通過氫鍵形成咪唑環(huán)以協(xié)助維持血紅素活性中心的穩(wěn)定(圖3)。

利用Clustal W軟件對CkPOD、CiPOD和CmPODcDNA進(jìn)行多重比對發(fā)現(xiàn)(圖3)，3條序列中有23個核苷酸不同，其中CkPOD和CmPOD間有11個核苷酸不同，CiPOD和CmPOD間有16個核苷酸不同，而CkPOD和CiPOD間則有19個核苷酸不同。對CkPOD、CiPOD和CmPOD的氨基酸序列進(jìn)行比對結(jié)果顯示，3種POD之間只有5個氨基酸不同，其中CkPOD和CmPOD有3個不同的氨基酸(145、182和243 aa)，CiPOD和CmPOD也有3個不同的氨基酸(38、42和243 aa)，而CkPOD和CiPOD有4個不同的氨基酸(38、42、145和182 aa，圖3)?；?1種植物POD蛋白的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，3種錦雞兒屬植物的POD與鷹嘴豆等豆科植物POD蛋白聚為一類。檸條錦雞兒和小葉錦雞兒的POD具有較近的親緣關(guān)系，而中間錦雞兒則與檸條錦雞兒和小葉錦雞兒POD的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)(圖4)。

M. DL2000; 1. 檸條錦雞兒；2. 中間錦雞兒；3. 小葉錦雞兒圖2　cDNA全長序列擴增M. DL2000; 1. CkPOD cDNA；2. CiPOD cDNA；3. CmPOD cDNAFig.2　Amplification of full-length cDNA

C.k.檸條錦雞兒；C.i.中間錦雞兒；C.m.小葉錦雞兒；波浪線為信號肽序列，下劃線為跨膜結(jié)構(gòu)域，方框為活性中心構(gòu)成序列，●表示與Ca2+結(jié)合的氨基酸殘基;▲表示形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，◆表示活性作用位點的氨基酸殘基序列，★表示與血紅素結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基圖3　CkPOD、CiPOD和CmPOD的cDNA及氨基酸序列比對C.k. C. korshinskii；C.i. C. intermedia；C.m. C. microphylla； Wavy lines indicated the putative signal peptide, underline indicated the transmembrane domains, the boxes represent the putative catalytic domain, ● indicated the Ca2+ site hydrogen bonded to the residues, ▲ indicated the cysteine residues involved in disulfide bridges, ◆ indicated the active site residues and ★ indicated the residues bonding to heme iron atomFig.3　Alignment of cDNAs and amino acids of CkPOD, CiPOD and CmPOD

圖4　由鄰位相接法構(gòu)建的21種植物POD蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4　Neighbor joining phylogenetic tree of POD proteins from 21 plant species

圖5　CkPOD、CiPOD和CmPOD基因在PEG模擬干旱脅迫下的表達(dá)量Fig.5　Expression levels of the CkPOD, CiPOD and CmPOD under PEG-simulated drought stress conditions

2.33種錦雞兒屬植物POD基因在干旱脅迫下的表達(dá)

為了進(jìn)一步調(diào)查CkPOD、CiPOD和CmPOD基因在干旱脅迫下的表達(dá)特性，生長7周的幼苗分別用于5%，15%和25% PEG-模擬干旱脅迫，并比較分析在脅迫第1天、第3天、第5天和第7天時3種錦雞兒屬植物POD基因的表達(dá)量變化。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，PEG模擬干旱能夠強烈地誘導(dǎo)CkPOD、CiPOD和CmPOD基因的表達(dá)(圖5)。在正常生長條件下，CkPOD、CiPOD和CmPOD的表達(dá)量都比較低；特別是CiPOD基因的表達(dá)量與CkPOD和CmPOD相比最低(圖5)，然而在干旱脅迫條件下它們的表達(dá)量均迅速升高。CiPOD和CmPOD基因的表達(dá)模式較為相似，在25% PEG脅迫第5天時它們的表達(dá)量達(dá)到峰值；而CkPOD基因則是在15% PEG脅迫第7天時表達(dá)量達(dá)到峰值(圖5)。

3　討　論

植物POD是一個非常龐大的基因家族，擬南芥基因組中含有73個POD基因[28]，水稻基因組中含有138個POD基因[29]，故而推測錦雞兒屬植物中也存在多個POD基因，本研究所克隆的CkPOD、CiPOD和CmPOD基因也僅僅是POD基因家族中的一個成員。生物信息學(xué)分析顯示，所克隆基因包含了植物過氧化物酶所特有的活性殘基[30]，與Ca2+結(jié)合的保守氨基酸殘基，形成二硫鍵橋的8個半胱氨酸殘基以及與血紅素結(jié)合相關(guān)的天冬氨酸和組氨酸殘基[31]，可進(jìn)一步說明CkPOD、CiPOD和CmPOD基因編碼的蛋白具有過氧化物酶活性。另外，所克隆的3種錦雞兒屬植物POD蛋白均含有信號肽序列，顯示它們可能為第三類過氧化物酶基因[32]。

目前國內(nèi)外學(xué)者對同屬小葉系的小葉錦雞兒、中間錦雞兒和檸條錦雞兒的種間親緣關(guān)系，特別是對于中間錦雞兒是否是一個獨立的物種存有較大的爭議。Sanczir[33]、富象乾[34]、劉媖心[35]和趙一之[36]等認(rèn)為中間錦雞兒是一個獨立的物種；Yakovlev[37]認(rèn)為中間錦雞兒與檸條錦雞兒為同一物種；張明理等[38]認(rèn)為中間錦雞兒是檸條錦雞兒的一個變種；而徐朗然和郝秀英[39]則認(rèn)為中間錦雞兒是小葉錦雞兒的一個變種。侯鑫等通過分析該3種植物ITS和葉綠體trnL-F基因序列否定了中間錦雞兒的雜交起源假說，認(rèn)為小葉錦雞兒、中間錦雞兒和檸條錦雞兒是一個連續(xù)的地理漸變?nèi)篬40]。本研究利用POD基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，檸條錦雞兒和小葉錦雞兒的POD具有較近的親緣關(guān)系，而中間錦雞兒則與檸條錦雞兒和小葉錦雞兒POD的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)；這一結(jié)果支持侯鑫等關(guān)于該3種植物進(jìn)化關(guān)系的推論。該結(jié)果也在一定程度上說明POD基因的起源非常古老且較為保守，可作為分子標(biāo)記為植物的分類提供參考。

POD作為植物保護(hù)酶系統(tǒng)的成員之一，與SOD和CAT協(xié)同作用參與植物抵御生物和非生物脅迫。在脅迫條件下植物體內(nèi)的POD活性升高，以清除植物體內(nèi)過剩的自由基[41-45]，避免氧化損傷。在PEG模擬干旱脅迫條件下CkPOD、CiPOD和CmPOD表達(dá)量均明顯升高，顯示該基因在錦雞兒屬植物抵御干旱脅迫中發(fā)揮重要作用。該結(jié)果亦與擬南芥(A.thaliana)[41]、楊樹(Populusperoxisoma)[42]、番茄(Solanumlycopersicum)[43]、三葉膠(Grimmiapilifera)[44]和甘蔗(Saccharumofficinarum)[45]等植物POD表達(dá)特性的報道一致。檸條錦雞兒、中間錦雞兒和小葉錦雞兒在地理分布上是隨著水分梯度自西向東呈替代分布[40]，其中檸條錦雞兒的抗旱性最強，小葉錦雞兒的抗旱性最弱[46]。李鳳玲等[47]的研究表明，在干旱脅迫條件下該3種錦雞兒屬植物的POD活性明顯提高，其中檸條錦雞兒POD的活性明顯高于中間錦雞兒和小葉錦雞兒，該結(jié)果與本研究中3種錦雞兒屬植物POD基因表達(dá)量的分析結(jié)果有所差異。在脅迫初期小葉錦雞兒的CmPOD表達(dá)量最高，其次是檸條錦雞兒CkPOD，而中間錦雞兒CiPOD的表達(dá)量最低。植物的POD是一個龐大的基因家族，其成員數(shù)量眾多，每一個成員可能有不同的表達(dá)模式，對總POD活性的貢獻(xiàn)也有所不同。另一方面，轉(zhuǎn)錄水平上基因表達(dá)量的微弱差異并不能夠反映其在翻譯水平上表達(dá)量的差異。因此，分離該3種錦雞兒屬植物其它POD成員并比較分析它們的表達(dá)模式對于深入研究其耐旱機理是非常必要的。

干旱作為一個重要的非生物脅迫因子嚴(yán)重制約農(nóng)作物及牧草的生產(chǎn)，因此，研究植物的抗旱分子機理、采用分子生物學(xué)技術(shù)手段進(jìn)行作物的抗旱性遺傳改良、或者篩選具有應(yīng)用價值的抗旱作物品種非常必要。本研究為深入研究錦雞兒屬植物的抗旱分子機理及利用錦雞兒屬植物進(jìn)行荒漠改良和生態(tài)修復(fù)提供了一定的理論和實驗依據(jù)。

[1]JOSHI D K, GOLD M H. Oxidation of dimethoxylated aromatic compounds by lignin peroxidase fromPhanerochaetechrysosporium[J].EuropeanJournalofBiochemistry, 1996,237(1):45-57.

[2]SHANNON L M, KAY E, LEW J Y. Peroxidase isozymes from horseradish roots[J].JournalofBiologicalChemistry, 1966,241(9):2 166-2 172.

[3]DELANNOY E, LA J, ASSIGBETSE K,etal. Activity of class III peroxidases in the defense of cotton to bacterial blight[J].MolecularPlant-microbeInteractions: MPMI, 2003,16(11):1 030-1 038.

[4]HIRAGA S, SASAKI K, ITO H,etal. A large family of class III plant peroxidases[J].PlantandCellPhysiology, 2001,42(5):462-468.

[5]MORGENS P H, CALLAHAN A M, DUNN L J,etal. Isolation and sequencing of cDNA clones encoding ethylene-induced putative peroxidases from cucumber cotyledons[J].PlantMolecularBiology, 1990,14(5):715-25.

[6]KIM K Y, KWON H K, KWON S Y,etal. Differential expression of four sweet potato peroxidase genes in response to abscisic acid and ethephon[J].Phytochemistry, 2000,54(1):19-22.

[7]WHETTEN R W, MACKAY J J, SEDEROFF R R. Recent advances in understanding lignin biosynthesis[J].AnnualreviewofPlantBiology, 1998,49(1): 585-609.

[8]LEE T T. Role of phenolic inhibitors in peroxidase-mediated degradation of indole-3-acetic acid[J].PlantPhysiology, 1977,59(3):372-375.

[9]朱嘵紅, 曹顯祖. 花藥中生長素的積累與過氧化物酶活性的關(guān)系[J]. 植物生理學(xué)報, 1996，(4):254-257.

ZHU X H, CAO X Z. Relationship between the accumulation of IAA and the peroxidase activity in anthers[J].PlantPhysiologyCommunication, 1996，(4):254-257.

[10]HIRAGA S, YAMAMOTO K, ITO H,etal. Diverse expression profiles of 21 rice peroxidase genes[J].FebsLetters, 2000,471(2/3):245-250.

[11]PASSARDI F, COSIO C, PENEL C,etal. Peroxidases have more functions than a Swiss army knife[J].PlantCellReports, 2005,24(5):255-265.

[12]REBMANN G, HERTIG C, BULL J,etal. Cloning and sequencing of cDNAs encoding a pathogen-induced putative peroxidase of wheat (TriticumaestivumL.) [J].PlantMolecularBiology, 1991,16(2):329-331.

[13]MOHAN R, BAJAR A M, KOLATTUKUDY P E. Induction of a tomato anionic peroxidase gene (tap1) by wounding in transgenic tobacco and activation oftap1/GUS andtap2/GUS chimeric gene fusions in transgenic tobacco by wounding and pathogen attack[J].PlantMolecularBiology, 1993,21(2):341-354.

[14]VALERIO L, MEYER M D, PENEL C,etal. Expression analysis of theArabidopsisperoxidase multigenic family[J].Phytochemistry, 2004,65(10):1 331-1 342.

[15]BAE E K, LEE H, LEE J S,etal. Molecular cloning of a peroxidase gene from poplar and its expression in response to stress[J].TreePhysiology, 2006,26(11):1 405-1 412.

[16]MITTLER R, ZILINSKAS B A. Molecular cloning and characterization of a gene encoding pea cytosolic ascorbate peroxidase[J].JournalofBiologicalChemistry, 1992,267(30):21 802-21 807.

[17]ASADA K, FOYER C H, MULLINEAUX P M. Production and action of active oxygen species in photosynthetic tissues[J].Pure&AppliedChemistry, 1994,79(12):2 217-2 227.

[18]劉世鵬, 劉濟明, 陳宗禮, 等. 模擬干旱脅迫對棗樹幼苗的抗氧化系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)的影響[J]. 西北植物學(xué)報, 2006,26(9):1 781-1 787.

LIU S P, LIU J M, CHEN Z L,etal. Effects of simulated drought on antioxidative enzymes and osmotic regulation inZizyphusjujubaseedlings[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 2006,26(9):1 781-1 787.

[19]朱維琴, 吳良?xì)g, 陶勤南.干旱逆境對不同品種水稻生長、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及保護(hù)酶活性的影響[J].科技通報, 2006,22(2):176-181.

ZHU W Q, WU L H, TAO Q N. Growth and physiological adapation of different rice(OryzasativaL.) varieties in response to drought stress[J].BulletinofScienceandTechnology, 2006,22(2):176-181.

[20]肖強, 高建明, 羅立廷. 干旱脅迫對空心蓮子草抗氧化酶活性和組織學(xué)的影響[J]. 生物技術(shù)通訊, 2006,17(4):556-559.

XIAO Q, GAO J M, LUO L T. Effects of drought stress on the activities of anti-oxidant enzymes and histology in alternanthera philoxeroides[J].LettersinBiotechnology, 2006,17(4):556-559.

[21]張中華, 楊建平, 陳圣棟. 低溫脅迫對韭菜膜透性及保護(hù)酶活性的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2006,15(2):124-127.

ZHANG Z H, YANG J P, CHEN S D,etal. Effect of low temperature stress on protective enzyme activity and membrane permeability in Chinese Chives[J].ActaAgriculturaeBoreali-OccidentalisSinica, 2006,15(2):124-127.

[22]劉靈娣, 李存東, 孫紅春, 等. 干旱對不同鈴重基因型棉花葉片細(xì)胞膜傷害、保護(hù)酶活性及產(chǎn)量的影響[J]. 棉花學(xué)報, 2009,21(4):296-301.

LIU Y D, LI C D, SUN H C,etal. Effects of drought on cell membrane damage, activities of protective enzymes and yield of different boll-weight genotypes in cotton[J].CottonScience, 2009,21(4):296-301.

[23]吳麗云, 曹幫華, 邵偉, 等. PEG脅迫對八棱海棠種子萌發(fā)及幼苗生理的影響[J]. 山東科學(xué), 2011,24(1):36-39.

WU L Y, CAO B H, SHAO W,etal. Effects of PEG stress on seed germination and seedling physiology ofMalusrobusta[J].ShandongScience, 2011,24(1):36-39.

[24]熊正英, 張志勤, 王致遠(yuǎn), 等. POD活性與水稻抗旱性的關(guān)系[J]. 陜西師大學(xué)報, 1995,12(23):63-69.

XIONG Z Y, ZHANG Z Q, WANG Z Y,etal. Relationship of peroxidase activity with drought resistance of rice[J].JournalofShanxiNormalUniversity, 1995,12(23):63-69.

[25]曹錫清. 脂質(zhì)過氧化對細(xì)胞與機體的作用[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 1986,2:17-23.

CAO X Q. The function of lipid peroxidation for cell and organism[J].ProgressinBiochemistryandBiophysics, 1986,2:17-23.

[26]LIU Y, LEI H, AN L,etal. Arbuscular mycorrhizal dynamics in a chronosequence ofCaraganakorshinskiiplantations[J].FemsMicrobiologyEcology, 2009,67(1):81-92.

[27]ZHANG W B, LI N N, QI F,etal. Isolation and expression analysis of Cu/Zn superoxide dismutase genes from threeCaraganaspecies[J].RussianJournalofPlantPhysiology, 2014,61(5):656-663.

[28]DUROUX L, WELINDER K G. The peroxidase gene family in plants: A phylogenetic overview[J].JournalofMolecularEvolution, 2003,57(4):397-407.

[29]PASSARDI F, LONGET D, PENEL C,etal. The class Ⅲ peroxidase multigenic family in rice and its evolution in land plants[J].Phytochemistry, 2004,65(13):1 879-1 893.

[30]WU W, LU J, WEI Y,etal. Isolation and characterization of the first putative peroxidase gene from oilseed rape (Brassicanapus) which is highly homologous to HRPC[J].BioscienceReports, 2006,26(3):263-280.

[31]SHULAEV V, OLIVER D J. Metabolic and proteomic markers for oxidative stress. new tools for reactive oxygen species research[J].PlantPhysiology, 2006,141(2):367-372.

[32]程華, 李琳玲, 王燕, 等. 銀杏過氧化物酶基因POD1的克隆及表達(dá)分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報, 2011,25(6):44-51.

CHENG H, LI L L, WANG Y,etal. Molecular cloning, characterization and expression of POD1 gene from ginkgo biloba L.[J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica, 2011,25(6):44-51.

[33]SANCZIR Cz.. A new species ofCaragana[J].BotanicheskiiZhurnal, 1974,59: 233.

[34]富象乾. 內(nèi)蒙古植物志(第3卷，第1版)[M]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，1977: 163-179.

[35]LIOU Y X. Some new species ofCaraganaand Chesneya from China[J].ActaPhytotaxonomicaSinica, 1984,22(3):209-216.

[36]趙一之. 中國錦雞兒屬的分類學(xué)研究[J]. 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報：(自然科學(xué)版), 1993：24(6):631-653.

ZHAO Y Z. A taxonomic study on Caragana in China[J].ActaScientiarumNaturaliumUniversitatisNeiMongol, 1993,24(6): 631-653.

[37]YAKOVLEV G P. Plantae Asiae Centralis[M].Leningrad:Nauka, 1988,8: 24-44.

[38]張明理, 朱光華. 錦雞兒屬(豆科)一新組合[J]. 植物研究, 2004,24(1):5-6.

ZHANG M L, ZHU G H. A new combination ofCaragana(Fabaceae) from China[J].BulletinofBotanicalResearch, 2004,24(1):5-6.

[39]徐朗然, 郝秀英. 黃土高原和秦嶺山地錦雞兒屬植物的分類和地理分布的研究[J]. 西北植物學(xué)報, 1989，9(2):92-101.

XU L R, HAO X Y. A study on classification and distribution ofCaraganaon LoessTableland and Mount Qin[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 1989，9(2):92-101.

[40]侯鑫, 劉俊娥, 趙一之, 等. 基于ITS序列和trnL-F序列探討小葉錦雞兒、中間錦雞兒和檸條錦雞兒的種間關(guān)系[J]. 植物分類學(xué)報, 2006,44(2):126-134.

HOU X, LIU J E, ZHAO Y Z,etal. Interspecific relationships ofCaraganamicrophylla,C.davazamciiandC.korshinskii(Leguminosae) based on ITS and trnL-F data sets[J].ActaPhytotaxonomicaSinica, 2006,44(2):126-134.

[41]ZHANG H, WANG J, NICKEL U,etal. Cloning and expression of anArabidopsisgene encoding a putative peroxisomal ascorbate peroxidase[J].PlantMolecularBiology, 1997,34(6):967-971.

[42]LI Y J, HAI R L, DU X H,etal. Over-expression of aPopulusperoxisomalascorbate peroxidase (PpAPX) gene in tobacco plants enhances stress tolerance[J].PlantBreeding, 2009,128(4):404-410.

[43]SUN W H, MING D, SHU D F,etal. Over-expression ofStAPXin tobacco improves seed germination and increases early seedling tolerance to salinity and osmotic stresses[J].PlantCellReports, 2010,29(8):917-926.

[44]LUKE L P, SATHIK M B M, THOMAS M,etal. Quantitative expression analysis of drought responsive genes in clones ofHeveawith varying levels of drought tolerance[J].PhysiologyandMolecularBiologyofPlants, 2015,21(2):179-186.

[45]WANG S, ZHANG K K, HUANG X,etal. Cloning and Functional analysis of thylakoidal ascorbate peroxidase (TAPX) gene in Sugarcane[J].SugarTech, 2015,17(4):1-11.

[46]楊明博, 楊劼, 楊九艷. 鄂爾多斯高原不同生境下中間錦雞兒(Caraganadavazameii)葉片的游離脯氨酸、丙二醛含量以及POD活性的變化[J]. 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報, 2005,36(2):192-196.

YANG M B, YANG J, YANG J Y. The changes of free proline and MDA contents and POD activity ofCaraganadavazameiiin different habitats in Erdos Plateau[J].ActaScientiarumNaturaliumUniversitatisNeimongol, 2005,36(2):192-196.

[47]李鳳玲. 錦雞兒屬(CaraganaFabr)三種植物實生苗水分關(guān)系與抗旱性研究[D]. 呼和浩特： 內(nèi)蒙古大學(xué), 2009.

(編輯:宋亞珍)

Isolation and Expression Feature of Peroxidase Genes from ThreeCaraganaSpecies

LI Ningning1, QI Fei1, AN Manxia1, LI Yu1, ZHANG Wenbo2, LIN Xiaofei1*

(1 College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China; 2 College of Forestry, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China)

Peroxidase (POD) genes were isolated from threeCaraganaspecies,C.korshinskii,C.microphyllaandC.intermedia(designated asCkPOD,CmPODandCiPOD, respectively) using homology-based cloning techniques, and their expression profiles under drought stress conditions were investigated. All of the cDNAs ofCkPOD,CiPODandCmPODcontain an open reading frame (ORF) of 1 074 bp, encoding a protein of 357 amino acids with a theoretical molecular weight of 38.7 kD. Phylogenetic analysis showed that these threeCaraganaPODs could be clustered into one clade with their isoforms from leguminosae, includingCicerarietinum. The PODs ofC.korshinskiiandC.microphyllashowed a closer relationship compared toC.intermediaPOD, corresponding to evolutionary history of the threeCaraganaplants. Real time RT-PCR revealed that the expression of theCaraganaPODgenes was strongly induced by PEG-simulated drought stress, showing that theCaraganaPODgenes play an important role in resisting drought-tolerance. These results may provide theoretical and experimental basis for understanding the drought-tolerance mechanism of theCaraganaplants and for their utilization in desert improvement and vegetation restoration programs.

Caragana; peroxidase; gene cloning; gene expression; drought stress; phylogenetic analysis

1000-4025(2016)09-1743-09doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1743

2016-06-14;修改稿收到日期:2016-08-18

國家自然科學(xué)基金(31260168);內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2015MS0355)

李寧寧 (1986-)，男，在讀博士研究生，主要從事植物逆境分子生物學(xué)研究。E-mail: lining86@outlook.com

林曉飛，副教授，主要從事植物逆境分子生物學(xué)研究。E-mail:linxiaofei04@hotmail.com

Q785; Q786

A