潘德灼，鄧朝軍，呂曉杰，宋曉敏，邱智敏，龔慧文，蔣際謀，陳　偉*

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，福州 350013；3 福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福州 350002)

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日灼脅迫對(duì)枇杷果皮蛋白質(zhì)組的影響

潘德灼1，鄧朝軍2，呂曉杰1，宋曉敏1，邱智敏3，龔慧文1，蔣際謀2，陳偉1*

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，福州 350013；3 福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福州 350002)

為了探討枇杷果皮響應(yīng)日灼脅迫的差異表達(dá)蛋白的變化，以日灼抗性弱的‘金鐘’枇杷和日灼抗性較強(qiáng)的‘紅猴本’枇杷為研究對(duì)象，將處于轉(zhuǎn)色期的枇杷果實(shí)在40 ℃下日灼處理90 min，果皮蛋白采用雙向電泳分離和MALDI-TOF/TOF-MS進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示：(1)日灼后枇杷果皮中有64個(gè)表達(dá)豐度在2倍以上的差異蛋白，其中56個(gè)蛋白被成功鑒定，且38個(gè)在‘金鐘’中表達(dá)，23個(gè)在‘紅猴本’中表達(dá)。(2)這些蛋白質(zhì)參與脅迫響應(yīng)和防御(30.3%)、光合作用(14.3%)、呼吸作用(25.0%)、蛋白質(zhì)代謝(14.3%)等生理過(guò)程。(3)相對(duì)于‘紅猴本’枇杷，‘金鐘’枇杷果皮細(xì)胞中多種熱激蛋白(HSP)的含量上升，參與呼吸作用的蛋白含量增加以產(chǎn)生更多的能量，但是大部分與光合作用相關(guān)的蛋白含量下降，清除活性氧(ROS)酶如抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)和多酚氧化酶(PPO)含量降低，同時(shí)PPO酶活性下降。研究表明，要提高枇杷果皮抗日灼性可能需要提高清除ROS酶的含量和活性，需要一定量的HSP，以及保持正常的呼吸作用和光合作用。

枇杷；果皮；日灼；差異蛋白

枇杷(Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.)是原產(chǎn)于中國(guó)南方的薔薇科枇杷屬的亞熱帶果樹(shù)，果實(shí)成熟于春末夏初，果肉柔軟多汁，富含蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，同時(shí)果實(shí)還可入藥，具有潤(rùn)肺止咳等功效，藥用價(jià)值高[1]。2006年，中國(guó)枇杷的栽培面積達(dá)到了12萬(wàn)公頃，產(chǎn)量高達(dá)45.4萬(wàn)噸，約占世界總產(chǎn)量的67%[2]。福建是中國(guó)枇杷的主產(chǎn)地之一，高居中國(guó)枇杷總產(chǎn)量前列[3]。

果實(shí)日灼是一種由高溫強(qiáng)光脅迫引起的果實(shí)生理病害現(xiàn)象。“溫室效應(yīng)”的增強(qiáng)造成全球氣溫的升高，而高溫下的強(qiáng)光對(duì)許多園藝作物的生產(chǎn)栽培造成了很大的威脅，尤其是果實(shí)外觀會(huì)出現(xiàn)不同程度的日灼病斑[4-6]。高溫強(qiáng)光脅迫會(huì)引起果實(shí)果皮的抗氧化能力發(fā)生變化。有研究發(fā)現(xiàn)，日灼的石榴(PunicagranatumL.)果實(shí)無(wú)法抵抗氧化脅迫從而造成可見(jiàn)的果皮病斑[6]。蘋(píng)果(Malus×domesticaBorkh)果皮受高溫強(qiáng)光脅迫引起活性氧含量的上升，同時(shí)抗氧化酶的活性也增強(qiáng)，但是不足以防御光氧化脅迫帶來(lái)的損傷，最終導(dǎo)致蘋(píng)果果皮日灼病斑的出現(xiàn)[7]。在一定高溫脅迫范圍內(nèi)，蘋(píng)果果皮中抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性隨日灼程度的增強(qiáng)而上升，但超過(guò)一定限度，其活性明顯下降，這意味著過(guò)度的高溫強(qiáng)光會(huì)破壞APX的活性從而加大日灼傷害[8]。日灼的柑橘(Citrusreticulata)表皮細(xì)胞內(nèi)活性氧含量劇增，抗氧化系統(tǒng)清除活性氧的能力明顯降低[9]。噴施外源抗氧化劑能顯著提高紅地球葡萄(Vitisviniferacv. Red Globe)果皮過(guò)氧化氫酶(CAT)、APX和SOD的活性，增強(qiáng)果皮的抗熱性[10]。此外，高溫強(qiáng)光脅迫還會(huì)引起細(xì)胞中蛋白質(zhì)種類和表達(dá)量發(fā)生變化[11-12]，尤其可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量熱激蛋白[4]。

枇杷以鮮銷為主，枇杷果皮的日灼極大地影響其果實(shí)品質(zhì)、產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，造成極大的損失，直接制約了枇杷在國(guó)際鮮果市場(chǎng)上的占有量[13-14]，研究枇杷果實(shí)日灼發(fā)生的生理分子機(jī)制具有重要的意義。目前，學(xué)者已明確了枇杷果實(shí)日灼發(fā)生的敏感時(shí)期[15]，解析了枇杷果皮日灼發(fā)生的生理生化的原因[14]，探討了果皮日灼發(fā)生時(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化[11-12]，同時(shí)提出預(yù)防枇杷果皮日灼的套袋等方法[16]。但是對(duì)于枇杷果皮日灼發(fā)生的分子機(jī)制還不清楚。因此，本研究采用雙向電泳(Two-dimentional electrophoresis，2-DE)和MALDI-TOF/TOF-MS技術(shù)，以日灼抗性弱的‘金鐘’和日灼抗性較強(qiáng)的‘紅猴本’枇杷品種為研究對(duì)象，比較分析這2種枇杷果皮中差異表達(dá)的蛋白功能，以揭示調(diào)控果皮抗高溫強(qiáng)光脅迫的分子機(jī)理，為選育抗日灼枇杷品種提供理論依據(jù)，也為防治枇杷日灼提供參考。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)材料供試枇杷品種為日灼抗性弱的‘金鐘’(JZH)和日灼抗性較強(qiáng)的‘紅猴本’(HHB)，均采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)福州龍眼枇杷圃。在晴天(光照強(qiáng)度 ≥ 1 100 μmol·m-2·s-1)，選擇位于7年樹(shù)齡的枇杷樹(shù)的樹(shù)冠外圍中上部相同方位、結(jié)果性狀基本一致、果實(shí)大小均一、果皮無(wú)損傷、處于轉(zhuǎn)色期的果穗10穗，使用果實(shí)日灼誘導(dǎo)儀進(jìn)行誘導(dǎo)處理(圖1)，誘導(dǎo)溫度40 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間90 min，以未誘導(dǎo)處理的枇杷為對(duì)照組，削取向陽(yáng)面的果皮，液氮速凍后儲(chǔ)藏于-80 ℃冰箱中備用。

1.2蛋白質(zhì)的分離與鑒定

1.2.1蛋白質(zhì)的提取蛋白質(zhì)的提取采用酚抽提法[17]。取3 g樣品于預(yù)冷的陶瓷研缽中，加入少量的石英砂，加入液氮充分研磨至細(xì)粉末狀，加入12 mL的蛋白酚抽提取液[100 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.0)，50 mmol·L-1抗壞血酸，50 mmol·L-1硼砂，100 mmol·L-1KCl，1% (v/v) Triton-100，2% (v/v) β-巰基乙醇]和12 mL Tris-飽和酚(pH 8.0)，混勻后4 ℃、5 500 ×g離心10 min，吸取酚層，加入6倍體積預(yù)冷的0.1 mol·L-1乙酸銨甲醇溶液，-20 ℃過(guò)夜沉淀蛋白后4 ℃、20 000 ×g離心20 min，棄上清液，沉淀的蛋白先用預(yù)冷的甲醇溶液清洗1次，再用預(yù)冷的含有0.07% (v/v) β-巰基乙醇的丙酮溶液清洗2次，均置于-20 ℃下靜置1 h；4 ℃、20 000 ×g離心20 min，再用含有0.07%β-巰基乙醇的丙酮溶液清洗1次，均置于-20 ℃下靜置1 h后再以4 ℃、20 000 ×g離心20 min，最后將沉淀的蛋白懸浮于預(yù)冷的丙酮中，4 ℃、20 000 ×g離心20 min后所得蛋白沉淀，冷凍干燥后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1　枇杷果皮的日灼誘導(dǎo)處理Fig. 1　Treatment induced by sunburn on loquat pericarp

1.2.2蛋白質(zhì)的2-DE分離取3 mg蛋白質(zhì)干粉溶解于300 μL蛋白裂解液[2% (v/v) Ampholyte pH 4～7，7 mol·L-1尿素，40 mmol·L-1DTT，2 mol·L-1硫脲，40 g·L-1CHAPS]中，37 ℃恒溫水浴2.5 h后20 000 ×g室溫離心15 min，取上清液采用Bradford法[18]測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品。2-DE參考You等[17]方法，第一向固相pH梯度等電聚焦(IEF)采用Amersham Ettan IPGphor Ⅲ系統(tǒng)(GE Healthcare Amersham Biosciences)，上樣量為1.3 mg，IPG膠條為24 cm、pH 4～7的線性膠條，IEF參數(shù)的設(shè)定為：30 V(12 h)、200 V(1 h)、500 V(1 h)、1 000 V(1 h)、1 000～8 000 V Gradient(30 min)、8 000 V(6 h)、1 000 V(1 h)，運(yùn)行溫度20 ℃，最大電流50 μA。第二向凝膠電泳采用EttanTMDALT Ⅱ垂直板電泳系統(tǒng)(GE Healthcare Amersham Biosciences)，凝膠濃度為11%，先設(shè)恒定電流15 mA電泳30 min后增大至30 mA，直至溴酚藍(lán)遷移至膠底0.5 cm處結(jié)束。采用考馬斯亮藍(lán)G250染色并脫色后經(jīng)EPSON PERFECTION 2480 PHOTO儀器掃描，應(yīng)用ImageMaster 2D platinum 5.0 軟件分析膠圖并找出差異表達(dá)2倍以上并且重復(fù)性好(P≤ 0.5)的蛋白點(diǎn)。

1.2.3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定差異表達(dá)的蛋白經(jīng)trypsin酶解后進(jìn)行MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜鑒定[19]。質(zhì)譜所用儀器為5800串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Applied Biosysterms SCIEX，USA)，質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)GPS Explorer 3.6 (Applied Biosysterms SCIEX，USA) 和 MASCOT 軟件(Version 2.1，Matrix Science，London，UK)檢索：數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBInr(發(fā)布日期：2010.07.01)，檢索方式為Combined，最大允許胰蛋白酶漏切位點(diǎn)為1，質(zhì)譜誤差設(shè)置為100 ppm，MS/MS誤差設(shè)置為0.6 Da。

1.3果皮膜透性和丙二醛(MDA)含量的的測(cè)定

枇杷果皮膜透性的測(cè)定參考商宏莉等[20]方法，略作修改。稱取2 g枇杷果皮，剪成長(zhǎng)約1 cm小段放入小燒杯中，加入20 mL蒸餾水后，用抽氣機(jī)抽氣10 min，室溫靜置20 min后用電導(dǎo)儀測(cè)定燒杯中溶液的電導(dǎo)率B；最后將燒杯置于沸水中水浴處理10 min，取出燒杯并室溫靜置20 min后測(cè)定枇杷果皮煮沸后的電導(dǎo)率C。另外設(shè)空白組，測(cè)定蒸餾水的電導(dǎo)率A。根據(jù)公式：傷害率(%)=(B-A)/(C-A)×100%，求得傷害率。

MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[21]。稱取1 g枇杷果皮，用液氮磨成粉末，加入8 mL 50 g·L-1三氯乙酸，4 ℃、3 000 ×g離心10 min。取2 mL上清液加入2 mL 6.7 g·L-1TBA，振蕩混勻，沸水浴30 min，迅速冷卻后，3 000 ×g離心10 min，上清液分別在450 nm、532 nm和600 nm下測(cè)得OD值，計(jì)算單位鮮重葉片組織中MDA的含量，單位表示為μmol·g-1。

1.4多酚氧化酶(PPO)活性的測(cè)定

PPO活性的測(cè)定采用鄰苯二酚法[22]。稱取0.8 g 枇杷果皮，用液氮磨成粉末，加入4 mL 0.1 mol·L-1(pH 6.5)磷酸緩沖液，4 ℃、8 000 ×g離心15 min，上清液即為待測(cè)酶液。常溫條件下，取0.2 mol·L-1鄰苯二酚2.5 mL、0.1 mol·L-1(pH 6.5)磷酸緩沖液4 mL，加入1 mL待測(cè)酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，同時(shí)以緩沖液(不加酶液)作空白對(duì)照，37 ℃保溫3 min后，于410 nm下測(cè)定OD值。以每毫升每分鐘吸光度變化0.01為一個(gè)酶活力單位(U)，酶活性單位表示為U·g-1。

1.5Western blotting驗(yàn)證分析

枇杷果皮蛋白的免疫印跡分析參考Wang等[19]方法，略作修改。上樣量為50 μg的果皮蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離后，采用CDY40C半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(北京六一儀器廠)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，50 g·L-1脫脂奶粉封閉2 h，用TBST緩沖液(0.01 mol·L-1Tris-HCl緩沖鹽溶液，0.1% (v/v) Tween-20，pH 7.6)漂洗后加入按照比例(1∶3 000)稀釋的兔抗HSP 70或cAPX多克隆抗體液體室溫孵育1 h，用TBST緩沖液漂洗后再加入按照比例(1∶1 000)稀釋的HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗液體繼續(xù)室溫孵育1 h，用TBST緩沖液漂洗后加入DAB(Boster，中國(guó)武漢)顯色。免疫印跡相對(duì)強(qiáng)度用Quantity軟件(Bio-Rad，USA)分析。

1.6數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，顯著差異為P≤ 0.05，極顯著差異為P≤ 0.01 。

2　結(jié)果與分析

2.1日灼枇杷果皮差異蛋白的分離與鑒定

果皮是果實(shí)中最先遭受高溫強(qiáng)光脅迫影響的結(jié)構(gòu)組織。枇杷果實(shí)在40 ℃下日灼誘導(dǎo)處理90 min，本實(shí)驗(yàn)分別選取處于轉(zhuǎn)色期的JZH和HHB兩品種枇杷果實(shí)的果皮進(jìn)行2-DE分離，獲得分辨率較高和重復(fù)性較好的2-DE圖譜(圖2)。同時(shí)，經(jīng)過(guò)ImageMaster軟件對(duì)2-DE凝膠圖譜的分析，本實(shí)驗(yàn)于2個(gè)品種的枇杷果皮中共得到64個(gè)豐度差異變化在2倍以上的蛋白點(diǎn)(圖2)。

通過(guò)對(duì)64個(gè)差異蛋白點(diǎn)的MALDI-TOF/TOF-MS分析，本實(shí)驗(yàn)成功鑒定出56個(gè)蛋白，但有8個(gè)蛋白未能得到可信的匹配，鑒定成功率為87.5%；同時(shí)，對(duì)鑒定出的56個(gè)蛋白進(jìn)行功能注釋和分類(表1)。表1顯示，這些蛋白主要分為：(1)脅迫響應(yīng)與防御蛋白，共有17蛋白點(diǎn)，占所鑒定出的總蛋白的30.3%；(2)光合作用蛋白，共有8個(gè)，占14.3%；(3)呼吸作用相關(guān)的蛋白，共有14個(gè)，占25.0%；(4)與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白，共有8個(gè)，占14.3%；(5)其他蛋白，共有9個(gè)，占16.1%。

A.‘金鐘’對(duì)照組；B.‘金鐘’日灼處理組；C.‘紅猴本’對(duì)照組；D.‘紅猴本’日灼處理組圖2　枇杷果皮日灼誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)2-DE圖譜A. Control of JZH; B. Sunburn of JZH; C. Control of HHB; D. Sunburn of HHBFig. 2　2-DE maps of loquat pericarp proteins under sunburn stress

表1　日灼脅迫下兩品種枇杷果皮差異蛋白的MALDI-TOF/TOF-MS鑒定結(jié)果Table 1　Identification of differentially expressed proteins in loquat fruits pericarps under sunburn by MALDI-TOF/TOF-MS

續(xù)表1Continued Table 1

功能注釋和分類Functionandclassification蛋白點(diǎn)編號(hào)Spotno.蛋白名稱Proteinname物種Speciesgi號(hào)gino.匹配率Coveragerate/%理論分子量/等電點(diǎn)TheoreticalMr/kD/pI實(shí)際分子量/等電點(diǎn)ExperimntalMr/kD/pI呼吸作用Respiration7硫辛酰胺脫氫酶lipoamidedehydrogenase豌豆Pisumsativum9846783453.3/6.653.3/6.786-磷酸葡萄糖酸脫氫酶家族蛋白6-phosphogluconatedehydrogenasefamilyprotein擬南芥Arabidopsisthaliana2978286862553.6/7.059.2/6.99丙酮酸脫氫酶pyruvatedehydrogenase,putative蓖麻Ricinuscommunis2555431402439.4/5.942.3/4.911磷酸丙糖異構(gòu)酶triosephosphateisomerase銀柴胡Stellarialongipes546735827.5/5.528.1/5.520丙酮酸脫氫酶E1β亞單位putativepyruvatedehydrogenaseE1betasubunit甜椒Capsicumannuum1932907241844.3/6.140.0/5.7223-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶3-isopropylmalatedehydrogenase,putative蓖麻Ricinuscommunis2555792121243.5/5.550.2/5.030磷酸果糖激酶β亞基phosphofructokinasebetasubunit枇杷Eriobotryajaponica3265802743561.7/5.970.1/6.044磷酸甘油酸變位酶phosphoglyceratemutase扁桃Prunusdulcis14982321553.4/5.478.0/5.745順烏頭酸酶aconitase,putative蓖麻Ricinuscommunis2555795882498.5/5.9101.0/5.847順烏頭酸酶putativeaconitase甜櫻桃Prunusavium348511201098.8/6.098.8/6.049轉(zhuǎn)酮醇酶1transketolase1菠菜Spinaciaoleracea25293421280.2/5.685.0/5.9512,3-二磷酸甘油酸非依賴型的磷酸甘油酸變位酶2,3-bisphosphoglyce-rate-independentphospho-glyceratemutase扁桃Prunusdulcis15858332753.4/5.477.2/5.652磷酸甘油酸變位酶apgm(phospho-glyceromutase)蘋(píng)果Malus×domestica41655502760.8/5.478.0/5.659磷酸甘油酸酯激酶phosphoglyceratekinase,chloroplast,putative小果野芭蕉Musaacuminata1021400372750.0/8.752.0/6.2蛋白質(zhì)代謝Proteinmetabolism5富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白glycine-richRNA-bindingprotein陸地棉Gossypiumhirsutum2119064741517.0/7.814.0/5.414真核翻譯起始因子5A2eukaryotictranslationinitiationfactor5A2歐洲山楊×河北楊Populustremula×Populusal-ba3331085673317.5/5.617.0/5.323糖基轉(zhuǎn)移酶glycosyltransferase75小麥Triticumaestivum3010724923841.5/5.746.1/5.924核RNA結(jié)合蛋白CnuclearRNAbindingproteinC菠菜Spinaciaoleracea64922702627.1/5.356.0/6.737延伸因子EF-2elongationfactorEF-2擬南芥Arabidopsisthaliana3321952172993.8/5.973.5/5.248延伸因子2elongationfactor2玉米Zeamays1956469722993.9/5.999.0/6.058TCP結(jié)構(gòu)域類轉(zhuǎn)錄因子TCPdomainclasstranscriptionfactor蘋(píng)果Malus×domestica3023990675559.8/6.073.2/6.062富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白1putativeglycine-richRNA-bindingprotein1平邑甜茶(湖北海棠)Malushupehensis3117802876416.2/6.414.6/6.0其他蛋白Otherproteins2調(diào)節(jié)顆粒AAA的ATP酶3regulatoryparticletriple-AATPase3擬南芥Arabidopsisthaliana3320096463945.7/5.451.0/5.317β-氰丙氨酸合酶1beta-cyanoalaninesynthase1蘋(píng)果Malus×domestica933592593940.9/7.644.0/5.527黃烷酮醇還原酶putativedihydro-flavonolreductase大星牽牛Ipomoeatrifida459351332645.5/5.855.0/5.718假定蛋白hypotheticalproteinSelmodraft_90998江南卷柏Selaginellamoellendorffii3027706252036.5/6.037.1/5.925未知蛋白u(yù)nknown蒺藜狀苜蓿Medicagotruncatula2170740845947.4/5.051.4/4.831假定蛋白hypotheticalproteinVITISV_000951葡萄Vitisvinifera1478151122344.8/7.054.2/5.936未知蛋白u(yù)nknown大豆Glycinemax2556287011720.1/9.012.9/5.238未知蛋白u(yù)nknown大豆Glycinemax2556314082219.0/5.217.6/5.061未命名的蛋白u(yù)nnamedproteinproduct鹽芥Thellungiellahalophila3122834273417.8/5.919.9/6.3

注：表中蛋白點(diǎn)序號(hào)與圖2中2-DE凝膠上的蛋白點(diǎn)序號(hào)一致

Note: Spot No. in the table corresponds to the 2-DE gel in Figure 2

圖中蛋白點(diǎn)序號(hào)與圖2中2-DE凝膠上的蛋白點(diǎn)序號(hào)一致圖3　枇杷果皮56個(gè)差異蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化Spot No. in this figure corresponds to the 2-DE gel in Figure 2Fig. 3　Relative expression quantities of 56 differential expressed proteins in loquat pericarp

同時(shí)，這56個(gè)差異表達(dá)蛋白在JZH和HHB枇杷果皮中的表達(dá)模式是不同的(圖3)。其中，5個(gè)蛋白在2種枇杷中表達(dá)均差異顯著，蛋白點(diǎn)4、5和60在2種枇杷中均下調(diào)表達(dá)，蛋白點(diǎn)6在2種枇杷中上調(diào)表達(dá)，而蛋白點(diǎn)7在JZH枇杷中上調(diào)表達(dá)，在HHB枇杷中下調(diào)表達(dá)；33個(gè)蛋白只在JZH枇杷果皮中的表達(dá)差異顯著，有11個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá)，22個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)；另外18個(gè)蛋白只在HHB枇杷果皮中的表達(dá)差異顯著，有9個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá)，9個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)。在所有鑒定出的蛋白中，還有6個(gè)蛋白未知其功能。

2.2日灼枇杷果皮細(xì)胞膜透性以及MDA含量的變化

植物在逆境環(huán)境下會(huì)發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，MDA是其產(chǎn)物之一，因此，MDA的含量可以反映出膜質(zhì)的過(guò)氧化程度和植物對(duì)逆境反應(yīng)的強(qiáng)弱。當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，細(xì)胞膜受到破壞，膜透性會(huì)增大。圖4，A顯示，經(jīng)過(guò)90 min日灼誘導(dǎo)處理后，JZH枇杷果皮的膜透性顯著增大，而HHB枇杷果皮的膜透性略微增大。同時(shí)，與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)90 min日灼誘導(dǎo)處理后，JZH和HHB枇杷果皮的MDA含量分別增加了2.0倍和0.9倍，差異均達(dá)到極顯著水平(圖4，B)。由此可知，日灼脅迫對(duì)枇杷果皮細(xì)胞膜的損害較大，而且抗日灼能力弱的JZH枇杷的膜傷害程度明顯大于抗性強(qiáng)的HHB。

*和**分別表示日灼處理與對(duì)照之間在0.05和0.01水平存在顯著性差異；下同圖4　日灼枇杷果皮的細(xì)胞膜傷害率(A)和MDA含量(B)*and ** above the bars indicate a significant difference between the sunburn and control at 0.05,and 0.01 level,respectively;The same as belowFig. 4　Membrane injury (A) and MDA content (B) in sunburn loquat pericarp

圖5　日灼枇杷果皮PPO活性Fig. 5　PPO activity in loquat pericarp

2.3日灼枇杷果皮多酚氧化酶活力的變化

植物在逆境條件下，多酚氧化酶(PPO)的活性會(huì)發(fā)生變化。由圖5可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)90 min的日灼誘導(dǎo)處理，JZH枇杷果皮細(xì)胞中PPO活性降低了50%，而HHB枇杷果皮細(xì)胞中PPO活性卻提高了4.0倍。由此可見(jiàn)，抗日灼能力不同的2種枇杷在抵御日灼傷害時(shí)所表現(xiàn)出來(lái)的PPO活力變化情況正好相反，抗性弱的JZH枇杷果皮中PPO活性極顯著下降，而抗性強(qiáng)的HHB枇杷卻極顯著上升。

2.4日灼枇杷果皮HSP 70和cAPX免疫印跡分析

HSP 70是一種非常重要的熱激蛋白，在植物響應(yīng)高溫脅迫中起著作用。前面的2-DE結(jié)果發(fā)現(xiàn)，日灼處理的JZH枇杷果皮的HSP 70含量顯著增加，而日灼HHB枇杷果皮的HSP 70含量略微增加；此外，在日灼處理的JZH枇杷果皮中cAPX蛋白顯著下降，在日灼HHB枇杷果皮中cAPX蛋白卻顯著增加。由圖6可知，經(jīng)過(guò)HSP 70和cAPX抗體的免疫印跡分析，HSP 70蛋白在2個(gè)品種日灼處理枇杷果皮中均顯著增加，而cAPX蛋白在JZH枇杷果皮中顯著下降，卻在HHB枇杷果皮中顯著增加，這與2-DE的結(jié)果基本一致。

3　討　論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在日灼脅迫下JZH枇杷果皮中有38個(gè)差異表達(dá)蛋白，在HHB枇杷果皮中有23個(gè)差異表達(dá)蛋白。這些差異蛋白的生物學(xué)功能主要涉及到脅迫響應(yīng)與防御、光合作用、碳水化合物和能量代謝等生理過(guò)程。

3.1脅迫響應(yīng)與防御相關(guān)蛋白

高溫強(qiáng)光會(huì)引起植物體內(nèi)活性氧(ROS)含量的增加，植物可通過(guò)提高抗氧化酶含量或活性來(lái)抵御高溫強(qiáng)光脅迫[23-25]。蘋(píng)果、紅地球葡萄果皮中APX活性的提高有助于抗高溫強(qiáng)光能力的增強(qiáng)[8,10]。胞質(zhì)APX是植物體內(nèi)重要的脫氫過(guò)氧化物酶，參與活性氧的清除，維持細(xì)胞內(nèi)平衡[26]。此外，PPO可參與植物組織的衰老和氧化褐變，同時(shí)PPO活性的提高可加速H2O2的清除進(jìn)而有利于草莓的保鮮[27]，PPO對(duì)采后油桃中H2O2清除也有直接作用[28]。本研究發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)APX和PPO含量在HHB枇杷中均上調(diào)表達(dá)，而在JZH枇杷中均下調(diào)表達(dá)，同時(shí)PPO酶活性的變化趨勢(shì)與此一致。這可能原因是在JZH枇杷受到日灼過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)多的活性氧進(jìn)而引起細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致MDA含量增加和膜透性顯著增大，導(dǎo)致了酶活力的下降；相反，在HHB枇杷中這兩種酶為了更好地清除細(xì)胞產(chǎn)生的大量活性氧而提高了自身活力，進(jìn)而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的活性氧代謝平衡，因而這是一種應(yīng)激保護(hù)。以上結(jié)果表明JZH枇杷果皮細(xì)胞的抗氧化能力弱于HHB枇杷。

植物在受到逆境脅迫時(shí)，細(xì)胞中的錯(cuò)誤折疊蛋白或多肽就會(huì)增多，因此植物需要產(chǎn)生多種分子伴侶蛋白(如熱激蛋白HSP)來(lái)指導(dǎo)蛋白或多肽的正確折疊。當(dāng)植物遭受高溫脅迫時(shí)，植物細(xì)胞就會(huì)產(chǎn)生多個(gè)高分子量HSP(60～110 kD)和小分子量HSP(15～45 Da)[23, 29]。這些HSP能夠聚合脅迫導(dǎo)致的變性蛋白并且使變性蛋白去折疊，從而恢復(fù)其天然的生物學(xué)功能[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)所有檢測(cè)到的HSP在兩種枇杷中均上調(diào)表達(dá)，其中HHB枇杷中有3個(gè)(蛋白點(diǎn)13、15和21)，而JZH枇杷中有6個(gè)(蛋白點(diǎn)34、53～57)，這可能是因?yàn)镴ZH枇杷的抗熱性弱，在日灼處理過(guò)程中會(huì)形成更多的錯(cuò)誤蛋白或多肽，因此需要產(chǎn)生更多的HSP來(lái)維持細(xì)胞蛋白的正常功能從而抵抗熱脅迫。然而，HHB枇杷的抗熱性強(qiáng)，對(duì)高溫強(qiáng)光不敏感，在短期日灼處理時(shí)未形成過(guò)多的錯(cuò)誤折疊蛋白，因此不需要太多的HSP來(lái)維持正常的功能。在JZH枇杷果皮中除了有HSP參與錯(cuò)誤折疊蛋白或多肽的去折疊外，還有ClpC亞基的參與。有研究表明，Clp是一種非常重要的蛋白酶，用于降解錯(cuò)誤的蛋白，而ClpC亞基是其主要的調(diào)控成分[32]。由此認(rèn)為，JZH枇杷中ClpC亞基的上調(diào)表達(dá)可以提高Clp蛋白酶的降解能力，從而加速清除細(xì)胞中錯(cuò)誤折疊的蛋白，這也說(shuō)明JZH枇杷比HHB枇杷對(duì)日灼更敏感。

3.2光合作用相關(guān)蛋白

高溫強(qiáng)光脅迫誘導(dǎo)植物的光合作用發(fā)生變化。本研究共檢測(cè)到8個(gè)與光合作用相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，其中JZH枇杷果皮中有6個(gè)蛋白(蛋白點(diǎn)4、10、28、40、41和43)均下調(diào)表達(dá)，只有蛋白6和32上調(diào)表達(dá)，而HHB枇杷果皮中蛋白6也上調(diào)表達(dá)，蛋白32略微上調(diào)，蛋白4和10下調(diào)表達(dá)。植物中RuBisCO是光合作用碳反應(yīng)中重要的羧化酶，由RuBisCO大亞基和小亞基組成[33]。RuBisCO大、小亞基組裝成全酶需要RuBisCO亞基結(jié)合蛋白的參與[34]。RuBisCO大亞基結(jié)合蛋白α亞基(蛋白點(diǎn)6)在2種枇杷中均顯著上調(diào)表達(dá)，RuBisCO大亞基結(jié)合蛋白β亞基(蛋白點(diǎn)32)在JZH枇杷中顯著上調(diào)表達(dá)，而在HHB枇杷中略微上調(diào)。然而，調(diào)控RuBisCO酶活性的RuBisCO活化酶(蛋白點(diǎn)41)以及RuBisCO大亞基(蛋白點(diǎn)10和28)在JZH枇杷中的表達(dá)量顯著下降，而在HHB枇杷中變化不明顯。此外，氧參與增強(qiáng)子蛋白1(蛋白點(diǎn)43)是光系統(tǒng)Ⅱ中心的裝配及穩(wěn)定性的一種必需蛋白[35-36]。質(zhì)體藍(lán)素參與光合過(guò)程中電子的傳遞，可以將電子從水傳遞給NADP+，最后形成氧分子。這兩種蛋白在JZH枇杷中均下調(diào)表達(dá)，而在HHB枇杷中未發(fā)生顯著變化。這些表現(xiàn)意味著JZH枇杷對(duì)高溫日灼更為敏感，光合作用受到的抑制更加嚴(yán)重。

3.3呼吸作用相關(guān)蛋白

高溫強(qiáng)光脅迫不僅可以使植物中光合作用和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性發(fā)生改變，還會(huì)影響呼吸作用[37]。其中，與糖酵解途徑相關(guān)的磷酸果糖激酶(蛋白點(diǎn)30)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(蛋白點(diǎn)11)和磷酸甘油酸變位酶(蛋白點(diǎn)44、51和52)在JZH枇杷果皮中均顯著上調(diào)表達(dá)，而在HHB枇杷中只有磷酸丙糖異構(gòu)酶顯著上調(diào)表達(dá)，另外2種酶均未發(fā)生顯著變化。此外，丙酮酸脫氫酶E1和硫辛酰胺脫氫酶參與了氧化代謝，可將丙酮酸轉(zhuǎn)化為2個(gè)乙酰CoA，其表達(dá)量的降低會(huì)造成植物三羧酸(TCA)循環(huán)障礙[38]。在TCA循環(huán)中，順烏頭酸酶能夠摧化檸檬酸轉(zhuǎn)化為異檸檬酸，而且3-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶催化異檸檬酸轉(zhuǎn)化為2-酮戊二酸。本研究發(fā)現(xiàn)丙酮酸脫氫酶(蛋白點(diǎn)9)、丙酮酸脫氫酶E1 β亞基(蛋白點(diǎn)20)、3-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶(蛋白點(diǎn)22)和硫辛酰胺脫氫酶(蛋白點(diǎn)7)在HHB枇杷中均下調(diào)表達(dá)，而在JZH枇杷中順烏頭酸酶(蛋白點(diǎn)45和47)卻上調(diào)表達(dá)，其他酶無(wú)明顯變化。此外，轉(zhuǎn)酮醇酶1(蛋白點(diǎn)49)在戊糖磷酸途徑中起重要作用，它在JZH枇杷果皮中顯著上升，在HHB枇杷中只是略微上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)在JZH枇杷果皮中與碳水化合物及能量相關(guān)的差異蛋白大部分都上調(diào)表達(dá)，而在HHB枇杷中只有2個(gè)差異蛋白(蛋白點(diǎn)11和49)上調(diào)表達(dá)，其他均下調(diào)表達(dá)或無(wú)明顯差異。這表明在日灼脅迫條件下JZH枇杷果皮中糖酵解途徑、三羧酸途徑和戊糖磷酸途徑均表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)，而在HHB枇杷中還是以下調(diào)表達(dá)為主，這可能是因?yàn)榭篃嵝匀醯腏ZH枇杷需要更多的能量來(lái)抵御日灼脅迫。抗性弱的JZH枇杷在呼吸作用上的變化與‘WDYDB’枇杷果皮響應(yīng)高溫強(qiáng)光脅迫的蛋白質(zhì)變化模式一致[12]。

3.4蛋白質(zhì)代謝相關(guān)蛋白

在8個(gè)與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的差異蛋白中，RNA結(jié)合蛋白(蛋白點(diǎn)24)和富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白(蛋白點(diǎn)5和62)參與轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控，包括前體mRNA的拼接與帶帽、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)及翻譯，它們?cè)谥参锏纳L(zhǎng)發(fā)育以及抗逆境脅迫中具有重要的作用[39]。起始因子5A(蛋白點(diǎn)14)能夠通過(guò)控制mRNA核輸出率而選擇性地翻譯蛋白質(zhì)[40]。延伸因子2(蛋白點(diǎn)37和48)參與新生肽鏈的延伸。糖基轉(zhuǎn)移酶(蛋白點(diǎn)23)能夠?qū)⑻腔D(zhuǎn)移到蛋白上，對(duì)蛋白進(jìn)行糖基化修飾，進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白功能。本研究發(fā)現(xiàn)，在JZH枇杷中，這些蛋白的含量總體上呈下降趨勢(shì)，而在HHB枇杷中總體上沒(méi)有發(fā)生顯著變化，這表明抗熱性弱的枇杷因日灼傷害造成蛋白質(zhì)合成量減少，而抗性強(qiáng)的枇杷所受到的影響較小。

綜上所述，本研究比較了JZH枇杷(日灼抗性弱)和HHB枇杷(日灼抗性較強(qiáng))果皮在日灼脅迫下的差異蛋白表達(dá)模式。相對(duì)于HHB枇杷，對(duì)日灼抗性較弱的JZH枇杷果皮細(xì)胞中多種HSP含量顯著上升，能夠減少因高溫強(qiáng)光脅迫造成的過(guò)多錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)；參與呼吸作用的蛋白含量增加，可以產(chǎn)生更多的能量以維持果皮細(xì)胞正常的生理活動(dòng)；但是大部分與光合作用有關(guān)的蛋白質(zhì)含量下降，說(shuō)明其光合作用受到嚴(yán)重的抑制；清除ROS的酶系統(tǒng)中APX和PPO含量與PPO活性均下降，導(dǎo)致活性氧的增加，脂膜系統(tǒng)受到破壞。根據(jù)以上結(jié)果我們認(rèn)為，提高枇杷果皮的抗日灼性，需要較高的清除ROS酶的含量和活性來(lái)清除過(guò)多的ROS，同時(shí)需要一定量的HSP以維持蛋白的正確折疊和正常功能，還需要保持正常的呼吸作用和光合作用以維持細(xì)胞物質(zhì)和能量的正常供應(yīng)。

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(編輯:裴阿衛(wèi))

Effect of Sunburn Stress on Pericarp Proteomics in Loquat Fruits

PAN Dezhuo1, DENG Chaojun2, Lü Xiaojie1, SONG Xiaomin1, QIU Zhimin3,GONG Huiwen1, JIANG Jimou2, CHEN Wei1*

(1 College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2 Fruit Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China; 3 College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

The objective of this work was to investigate the changes of differential expressed proteins in response to sunburn stress on loquat pericarp. The fruits of loquat cultivar ‘Jinzhong’ and ‘Honghouben’ sunburned for 90 min at 40 ℃ during color changing period were selected as experiment materials, among which the ‘Jinzhong’ loquat is poorer than ‘Honghouben’ at sunburn resistance. Total proteins in pericarp were separated using two-dimensional electrophoresis and differentially expressed proteins were identified using matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF-MS). (1) Total 64 proteins were changed at least 2-fold differences in abundance, among which 56 proteins were successfully identified with 38 in ‘Jinzhong’ and 23 in ‘Honghouben’. (2) These identified proteins were involved in stress response and defense (accounting for 30.3%), photosynthesis(14.3%), respiration (25.0%), protein metabolism(14.3%)and some other physiological processes. (3) Compared to ‘Honghouben’, the abundance of many heat shock protein (HSP) was increased, and the abundance of proteins participating in respiration was also increased in order to generate more energy in ‘Jinzhong’. But the contents of many proteins related to photosynthesis as well as ascorbic acid peroxidase (APX) and polyphenol oxidase (PPO) removing reactive oxygen species (ROS) were all decreased, otherwise the activity of PPO was declined in ‘Jinzhong’. It is suggested that in order to enhance sunburn resistance in loquat, the content and activity of the enzymes removing ROS may be increased, the amount of HSP may need to some extent, and respiration and photosynthesis might be kept at the normal level.

Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.; pericarp; sunburn; differential expressed proteins

1000-4025(2016)09-1801-12doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1801

2016-05-05;修改稿收到日期:2016-09-12

福建省自然科學(xué)基金(2014J01099)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201003073)

潘德灼(1982-)，男，在讀博士研究生，主要從事植物生理與分子生物學(xué)研究。E-mail: pdz_006@163.com

陳偉，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物生理與分子生物學(xué)研究。E-mail: weichen909@163.com

Q945.78; Q591.2

A