倪輝，王淑玲，周玉香，蘇梅，韓承業(yè)

（南京柯菲平醫(yī)藥科技有限公司新藥研究部，江蘇南京210016）

·綜述·

HPLC 法測(cè)定羅氟司特含量的研究

倪輝，王淑玲，周玉香，蘇梅，韓承業(yè)

（南京柯菲平醫(yī)藥科技有限公司新藥研究部，江蘇南京210016）

目的建立一種高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定羅氟司特片的含量。方法采用HPLC法，色譜柱為Inertsil ODS-3（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），以0.01 mol/L甲酸銨緩沖液（pH 4.0）-乙腈（50∶50）作為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，流速為1.5 mL/min，柱溫為25℃，測(cè)定羅氟司特的含量。結(jié)果羅氟司特濃度在7.496～44.973 μg/mL時(shí)線性關(guān)系良好，回歸方程Y=76.76X-4.53，相關(guān)系數(shù)（r）=1.000 00（n=6）；高、中、低3種濃度平均回收率為99.91%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.11%（n=3），中間精密度試驗(yàn)的RSD為0.12%（n=6）。結(jié)論建立的HPLC法簡(jiǎn)便、靈敏，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性和耐用性良好，可作為羅氟司特片含量的檢驗(yàn)方法。

磷酸二酯酶抑制劑；色譜法，高壓液相；質(zhì)量控制；羅氟司特

羅氟司特片由瑞士奈科明（Nycomed）公司及其美國(guó)合作伙伴Forest實(shí)驗(yàn)室公司共同開發(fā)。2010年7月，歐洲藥品管理局（EMA）批準(zhǔn)羅氟司特片上市，批準(zhǔn)適應(yīng)證：該藥作為支氣管擴(kuò)張劑治療的添加藥物，用于有頻發(fā)急性加重史的成人患者慢性支氣管炎相關(guān)的重度慢性阻塞性肺疾病（COPD）的維持治療［1-3］。2011年2月，美國(guó)食品藥品管理局（FDA）也批準(zhǔn)了羅氟司特片上市。羅氟司特片適用于有慢性支氣管炎和急性加重期重度COPD患者的治療［4-7］，以降低COPD急性加重的風(fēng)險(xiǎn)。本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定羅氟司特片的含量，建立該藥的含量測(cè)定方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器Agilent 1100型液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，VWD紫外檢測(cè)器）；AL104型電子天平（梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司），AUW120D型電子天平［島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司］；PB-10型精密pH計(jì)［賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司］。

1.1.2試劑羅氟司特對(duì)照品（自制，批號(hào)：110301，含量：99.93%）；羅氟司特片（自制，批號(hào)：110501、110502、110503）；乙腈為色譜純；水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1色譜條件色譜柱：InertsilODS-3（4.6 mm×250.0 mm，5 μm，日本島津公司）。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01 mol/L甲酸銨緩沖液（pH 4.0）-乙腈（50∶50）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm；流速為1.5 mL/min；柱溫為25℃。

1.2.2溶液的制備

1.2.2.1對(duì)照品溶液取羅氟司特對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每毫升約含15 μg的溶液。

1.2.2.2供試品溶液取羅氟司特片30片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于羅氟司特1.5 mg）置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲處理，使羅氟司特片溶解，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液。

1.2.2.3空白對(duì)照溶液取缺羅氟司特其他組分，按處方工藝制成空白樣品，按1.2.2.2項(xiàng)下方法制成空白對(duì)照溶液。

1.2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)取1.2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，考察理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性。

1.2.4空白干擾專屬性試驗(yàn)取1.2.2.3項(xiàng)下的空白對(duì)照溶液，精密量取20 mL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.5線性與范圍取1.2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，用流動(dòng)相稀釋制成一系列濃度，在上述色譜條件下，分別精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；以濃度（C）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)作圖，進(jìn)行回歸計(jì)算，繪制回歸曲線，得出回歸方程。

1.2.6溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液（批號(hào)：110501），分別于0、2、4、6、8 h精密量取20 μL注入液相色譜儀，考察溶液的穩(wěn)定性。

1.2.7精密度試驗(yàn)

1.2.7.1重復(fù)性試驗(yàn)按1.2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。同法操作6份。同時(shí)制備羅氟司特對(duì)照品溶液。精密量取上述溶液各20 μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.7.2中間精密度試驗(yàn)按含量測(cè)定方法，由不同分析人員在不同時(shí)間分別測(cè)定其含量，考察隨機(jī)變動(dòng)因素對(duì)精密度的影響。

1.2.8準(zhǔn)確度試驗(yàn)精密稱取羅氟司特對(duì)照品適量，按處方量加入空白輔料，分別制成低、中、高3個(gè)不同濃度的片劑（分別含羅氟司特80%、100%、120%），每個(gè)濃度分別制備3份進(jìn)行含量測(cè)定。

1.2.9耐用性試驗(yàn)精密稱取羅氟司特對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每毫升含150 μg的溶液。量取羅氟司特溶液5 mL置于50 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋制成15 μg/mL的溶液。精密量取上述溶液各20 μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

通過(guò)將色譜條件的流動(dòng)相初始比例、pH值、流速、柱溫及色譜柱更換進(jìn)行微小的變動(dòng)，考察該色譜條件的耐用性。

1.2.10樣品含量測(cè)定取不同批號(hào)的樣品，分別按1.2.2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，精密量取上述溶液各20 μL分別注入液相色譜儀，測(cè)定3批樣品羅氟司特的含量。

2　結(jié)果

2.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果本系統(tǒng)理論板數(shù)按羅氟司特峰計(jì)算約為13 000.000，重復(fù)性良好。見表1。

表1　系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.2空白干擾專屬性試驗(yàn)結(jié)果輔料在與供試品主峰保留時(shí)間相同處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，不干擾本品的含量測(cè)定，表明該方法專屬性良好。

2.3線性與范圍羅氟司特的回歸方程為Y=76.759 93X-4.527 53，相關(guān)系數(shù)（r）=1.000 00，表明本品在7.496～44.973 μg/mL時(shí)線性關(guān)系良好。見圖1。

圖1　羅氟司特線性關(guān)系曲線

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果含量測(cè)定羅氟司特供試品溶液于量瓶中室溫放置8 h峰面積（A）無(wú)明顯變化，RSD為0.16%，提示該溶液穩(wěn)定性良好。見表2。

表2　溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1重復(fù)性試驗(yàn)羅氟司特供試品的平均含量為99.86%，RSD為0.10%，表明該方法重復(fù)性良好。見表3。

表3　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5.2中間精密度試驗(yàn)結(jié)果不同分析人員在不同時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果的RSD為0.12%，表明該方法的中間精密度良好。見表4。

表4　中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果采用HPLC法測(cè)定片劑中羅氟司特含量的平均回收率為99.91%，RSD為0.11%，表明該方法的準(zhǔn)確度高、可靠性好。見表5。

表5　準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.7耐用性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)色譜條件進(jìn)行微小變動(dòng)，各變異條件下對(duì)本品含量檢測(cè)無(wú)明顯影響，提示該方法耐用性良好。見表6。

表6　耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.8樣品含量測(cè)定測(cè)定3批羅氟司特片（110501、110502、110503）的含量分別為99.92%、100.11%、100.23%。

3　討論

目前國(guó)內(nèi)有關(guān)羅氟司特含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道不多［8-10］。本研究建立了一種采用HPLC法測(cè)定羅氟司特片含量的方法，結(jié)果顯示，羅氟司特在7.496～44.973 μg/mL時(shí)線性關(guān)系良好（Y=76.759 93X-4.527 53，r=1.000 00），羅氟司特供試品的平均含量為99.86%，RSD為0.10%，表明該方法重復(fù)性良好；耐用性試驗(yàn)對(duì)色譜條件進(jìn)行了微小變動(dòng)，各變異條件下對(duì)羅氟司特的含量檢測(cè)無(wú)明顯影響，表明該方法耐用性良好；且該方法準(zhǔn)確性高，操作方便，能有效控制羅氟司特片的含量。根據(jù)實(shí)際3批樣品含量測(cè)定結(jié)果，將羅氟司特片含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)暫定為含羅氟司特標(biāo)示量的90.0%～110.0%。

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Study on HPLC method for determining roflumilast content

Ni Hui，Wang Shuling，Zhou Yuxiang，Su Mei，Han Chengye
（Department of New Drug Research，Nanjing Carephar Medical Science and Technology Co.，Ltd.，Nanjing，Jiangsu 210016，China）

ObjectiveTo establish a HPLC method for the content determination of roflumilast tablets.MethodsThe high-performance liquid chromatography（HPLC）method was adopted with the Inertsil ODS-3（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）as the chromatographic column.0.01 mol/L ammonium formate buffer solution（adjusting pH to 4.0）-acetonitrile（50∶50）served as the mobile phase，the roflumilast content was detected at the detection wavelength of 215 nm，the flow rate of 1.5 mL/min and the column temperature of 25℃.ResultsThe roflumilast concentration in the range of 7.496-44.973 μg/mL had a good linear relationship，the regression equation was Y=76.76X-4.53，r=1.000 00（n=6），the average recovery rate of high，middle and low concentrations was 99.91%，RSD=0.11%（n=3）；RSD in the intermediate precision test was.0.12%（n=6）.ConclusionThe established HPLC method is simple，sensitive and accurate in detection results with good reproducibility and durability，which is suitable for the content determination method of roflumilast tablets.

Phosphodiesterase inhibitors；Chromatography，high pressure liquid；Quality control；Roflumilast

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.20.015

A

1009-5519（2016）20-3139-03

倪輝（1984-），本科，主要從事藥物分析及藥物研發(fā)申報(bào)工作。

（2016-03-16

2016-07-05）