西安市中心醫(yī)院普外二科(西安 710004)

秦 勇 馬清涌△ 黨曉燕◇ 孫師元◇▲

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·論著·基礎(chǔ)研究·

白藜蘆醇抑制胰腺癌裸鼠移植瘤生長的實(shí)驗(yàn)研究*

西安市中心醫(yī)院普外二科(西安 710004)

秦 勇馬清涌△黨曉燕◇孫師元◇▲

目的:觀察白藜蘆醇(Res)對人胰腺癌Miapaca-2(PC-2)細(xì)胞構(gòu)建的胰腺癌裸鼠皮下移植瘤生長的抑制作用,并探討其作用機(jī)制。方法:建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型并隨機(jī)分組,分別給予3種不同濃度的白藜蘆醇干預(yù)后處死胰腺癌裸鼠,取出移植瘤,觀察其體積、重量的變化情況；HE染色法觀察移植瘤組織病理學(xué)變化；采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western bolt法測定移植瘤組織Bcl-2、Bax、p53蛋白和mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：Res組移植瘤的體積、重量明顯低于陰性對照組,隨著濃度增加變化越明顯(P<0.01)；3個(gè)濃度組白藜蘆醇作用于胰腺癌裸鼠后,移植瘤組織中Bcl-2、Bax、p53蛋白和mRNA表達(dá)水平較陰性對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且隨著濃度增加表達(dá)水平的差異越明顯。結(jié)論: 白藜蘆醇可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、p53的表達(dá)來抑制胰腺癌移植瘤的生長。

白藜蘆醇(Resveratrol,Res)是存在于虎杖、松樹、葡萄等天然植物當(dāng)中的多酚類化合物,對植物本身起保護(hù)作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)Res具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)活性,近年來其抗腫瘤活性越來越引起人們的關(guān)注。有研究顯示[2-3],Res在體外能抑制胰腺癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長。但目前的研究多集中在Res對腫瘤細(xì)胞的體外研究,而有關(guān)Res對裸鼠移植瘤的體內(nèi)研究甚少。本研究即通過建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型，觀察Res對胰腺癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用,并通過RT-PCR和Western bolt法觀察Res對移植瘤組織中Bcl-2、Bax、p53蛋白和mRNA表達(dá)水平的影響,以探索Res抑制胰腺癌裸鼠移植瘤生長的可能作用機(jī)制。

材料和方法

1 材 料 人胰腺癌細(xì)胞株Miapaca-2購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院。BALB/C裸鼠,購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司,30只實(shí)驗(yàn)用裸鼠,均為雌性,6周齡,體重在l4～l6 g之間。白藜蘆醇購自美國Sigma公司,純度<99.9%,用二甲基亞砜(DMSO)溶解后蒸餾水配成濃度為400 μmol/L,消毒后,-20℃凍存?zhèn)溆谩?-FU注射液購自上海旭東海普藥業(yè)公司。Bcl-2、Bax、p53一抗和二抗購自美國Sant Cruz公司。引物序列由Takara公司合成。PCR MasterMix購自Takara公司。其它常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人胰腺癌Miapaca-2細(xì)胞在37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中,用DMEM培養(yǎng)液(含10%小牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 mg/L鏈霉素、100 IU/ml青霉素)傳代培養(yǎng),待70%～80%融合時(shí),用2.5 g/L胰酶進(jìn)行消化傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞準(zhǔn)備造模。實(shí)驗(yàn)分5組：Res高濃度組(200 μg/ml)、中濃度組(100 μg/ml)、低濃度組(50 μg/ml)、5-FU組(750 μg/ml)、陰性對照組(生理鹽水)。5-FU組為陽性對照組。濃度選擇參照文獻(xiàn)[4]。

3 胰腺癌裸鼠移植瘤模型制備 將BALB/C裸鼠飼養(yǎng)于無菌層流室內(nèi),每籠10只,每3 d換1次飼料、飲水及墊料,保持恒溫25±2℃、恒濕45%～50%。取對數(shù)生長期的細(xì)胞,分別制成細(xì)胞濃度為1×108/ml的懸浮液,再用6號針頭的注射器抽取200 μl細(xì)胞懸液，接種于裸鼠雙側(cè)大腿上方的背部皮下(每組10只)。以皮下結(jié)節(jié)直徑達(dá)0.5 cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn),成瘤時(shí)間約為1周左右,1周后檢查發(fā)現(xiàn)裸鼠體內(nèi)腫瘤長徑約0.8 cm,故判斷胰腺癌裸鼠移植瘤模型造模成功,30只大鼠中有3只死亡,2只造模失敗,所以造模后,隨機(jī)將25只裸鼠分別入組,每組5只。

4 裸鼠抑瘤實(shí)驗(yàn) 5組裸鼠分別用5 ml注射器內(nèi)穿刺針抽取0.2 ml等體積溶液(以培養(yǎng)液定容),對瘤體多點(diǎn)(1～4點(diǎn))注射,1次/d,共14 d。給藥期間每2 d測量裸鼠體重及移植瘤長徑、短徑。末次給藥48 h后用脊髓脫臼法處死裸鼠,仔細(xì)、完整剝離移植瘤后,用PBS液快速沖洗,表面液體用濾紙吸干,然后用電子天平稱進(jìn)行稱重,每個(gè)移植瘤的稱重重復(fù)3次。用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的最長徑L和短徑W,每次重復(fù)3遍。腫瘤體積計(jì)算公式如下：V=L×W2/2,求其平均值。腫瘤重量抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤重量/對照組腫瘤重量)×100%，腫瘤體積抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積/對照組腫瘤體積)×100%。

5 移植瘤組織病理學(xué)檢查 將移植瘤組織進(jìn)行稱重，再用4%多聚甲醛進(jìn)行固定、脫水，最后石蠟包埋，常規(guī)4 μm切片，60℃烘箱烘干、冷卻后HE染色,用中性樹膠封片,光鏡下觀察各組移植瘤組織病理學(xué)變化。

6 移植瘤組織Bcl-2、Bax及p53蛋白檢測 分別提取各組裸鼠移植瘤組織總蛋白,將其進(jìn)行電泳后,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上進(jìn)行封閉,再分別與抗β-actin、Bcl-2、Bax及p53單克隆抗體進(jìn)行雜交和二抗反應(yīng),最后行化學(xué)發(fā)光法檢測陽性條帶。

7 移植瘤組織Bcl-2、Bax及p53 mRNA檢測 按上述分組,將裸鼠移植瘤組織總RNA用Trizol Reagent試劑盒進(jìn)行提取，隨后用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR總反應(yīng)體系為25 μl,內(nèi)含2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl,cDNA產(chǎn)物2 μl,正義引物1 μl ,反義引物1 μl 以及ddH2O(滅菌去離子水)8.5 μl。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性，94℃、5 min；變性,94℃、30 s；退火,60℃、30 s；延伸,72℃、30 s；共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。最后于72℃延伸7 min后結(jié)束。引物序列β-actin：上游引物 5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3',下游引物 5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'，擴(kuò)增基因片段長度為179bp；Ihh：上游引物 5'-CATTGAGACTTGACTGGGCAAC-3'，下游引物 3'-AGAGCAGGCTGAGTTGGGAGTCGC-5',擴(kuò)增基因片段長度為405bp；Smo：上游引物 5'-CCTTTGGCTTTGTGCTCATTACCTT-3',下游引物 3'-CGT-CACTCTGCCCAGTCAACCT-5'，擴(kuò)增基因片段長度為407bp；Ptch: 上游引物 5 -ATGCTGGCGG-GATCTGAGTTCGACT-3,下游引物 3' -GGGTGTGGGCAGGCGGTTCAAG-5',擴(kuò)增基因片段長度為789bp。陰性對照總RNA的反應(yīng)體系用滅菌去離子水代替進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增。然后各取9 μl PCR產(chǎn)物,加入 1 μl 10×Loading Buffer,經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳40 min,在紫外透射分析儀下觀察并拍照。通過GIS22009全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行各條帶光密度的分析,β-actin作為內(nèi)參基因評估各組Bcl-2、Bax及p53 mRNA的相對表達(dá)量。目的基因相對表達(dá)量按照2-ΔΔCt法計(jì)算。

結(jié) 果

1 不同組別裸鼠皮下移植瘤重量及體積變化 見附表。經(jīng)過14 d處理后,Res高濃度組、中濃度組、低濃度組的移植瘤重量及體積明顯小于陰性對照組(P<0.01)；Res高濃度組與中、低濃度組比較，移植瘤重量及體積之間也有明顯差異，且隨著濃度增加腫瘤重量及體積減小越明顯(P<0.01)，但Res中、低濃度組之間差異不明顯；與5-FU組比較，除Res高濃度組外，與其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；同時(shí)腫瘤重量及體積抑制率也呈現(xiàn)同樣的變化。

附表 裸鼠皮下腫瘤體積及重量變化

注：與陰性對照組比較,*P<0.01；與5-FU組比較,#P<0.01；與Res高濃度組比較,▲P<0.01

2 移植瘤病理學(xué)特征 見圖1。經(jīng)石蠟切片后行HE染色,病理確診為胰腺腺癌。光鏡下的形態(tài)特點(diǎn): 可見腫瘤細(xì)胞呈圓形、多角形,分布均勻,排列致密,細(xì)胞核呈圓形、橢圓形,染色質(zhì)深染,分裂像多見,呈異質(zhì)性,胞漿較少,略嗜伊紅,細(xì)胞間質(zhì)少見。陰性對照組基本全是胰腺癌組織，Res組還可見部分正常胰腺組織。

3 Western blot檢測各組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2、Bax及p53的蛋白表達(dá)水平 見圖2。

圖1 移植瘤病理切片(HE×400)

與陰性對照組比較,3組Res注射組中Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯下降(P<0.01)；與5-FU組比較,Res高、中濃度組Bcl-2蛋白顯著下降(P<0.01)。與陰性對照組比較,3組Res注射組的Bax和 p53蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)，效應(yīng)呈濃度效應(yīng)關(guān)系；與5-FU組比較,Res高、中濃度組的Bax蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)，而Res 3個(gè)注射組的p53蛋白表達(dá)水平與5-FU組比較無明顯差異。

(A: Res高濃度組；B: Res中濃度組；C: Res低濃度組；D: 5-FU組；E: 陰性對照組)(與陰性對照組比較，*P<0.01；與5-FU組比較，#P<0.01)

4 RT-PCR方法檢測各組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2、Bax及p53 mRNA的表達(dá)水平 見圖3。結(jié)果顯示：與陰性對照組比較,各濃度Res注射組中Bcl-2 mRNA的水平明顯下降(P<0.01)，效應(yīng)呈濃度效應(yīng)關(guān)系；與5-FU組比較,Res高、中濃度組中Bcl-2的mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.01)。而與陰性對照組比較,各濃度Res注射組中Bax和 p53的mRNA水平均明顯增加(P<0.01)，且效應(yīng)呈濃度效應(yīng)關(guān)系；與5-FU組比較,高濃度Res組中Bax的mRNA水平明顯增高(P<0.01),而p53的mRNA水平在Res高、中濃度組中顯著增高(P<0.01)。

(A: Res高濃度組； B: Res中濃度組；C: Res低濃度組；D: 5-FU組；E: 陰性對照組)(與陰性對照組比較，*P<0.01；與5-FU組比較，#P<0.01)

討 論

建立胰腺癌裸鼠模型,在胰腺癌研究中是不可或缺的。它可以更好地模擬胰腺癌細(xì)胞在人體內(nèi)的生物學(xué)行為[5-6]。本實(shí)驗(yàn)采用BALB/C裸鼠,其無T細(xì)胞免疫力,對異種移植無排斥反應(yīng),具有移植成功率高的特點(diǎn),目前已廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的基礎(chǔ)研究[7]。

經(jīng)過14 d處理后,對Res各濃度組移植瘤組織的重量、體積及其抑制率變化情況的觀察發(fā)現(xiàn),與陰性對照組相比,Res各濃度組對移植瘤生長均有不同程度的抑制作用,Res高濃度組、中濃度組、低濃度組的移植瘤重量及體積明顯小于陰性對照組(P<0.01)；隨著Res濃度的增加,移植瘤組織的重量、體積的減小越明顯,但中、低濃度組之間的差異不顯著；同時(shí),Res高濃度組與5-FU組相比,兩者對移植瘤重量、體積的影響并沒有明顯差異(P>0.05),其抑制率的變化也呈現(xiàn)同樣的特點(diǎn)。移植瘤的病理切片也證實(shí)了Res的抑瘤效果。故表明Res對胰腺癌裸鼠Miapaca-2細(xì)胞株移植瘤的生長具有一定的抑制作用,特別是Res的濃度達(dá)到一定程度時(shí),其對胰腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用與5-FU的效果基本相同，進(jìn)一步說明Res對胰腺癌裸鼠移植瘤的抑制效果與其濃度有關(guān)。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細(xì)胞凋亡與增殖之間的失衡有關(guān),腫瘤細(xì)胞的凋亡由凋亡相關(guān)基因決定。細(xì)胞凋亡基因可分為凋亡促進(jìn)基因和凋亡抑制基因兩大類,其中Bcl-2是一種凋亡抑制基因,Bax是一種凋亡促進(jìn)基因。腫瘤是否發(fā)生凋亡與Bcl-2 和Bax兩者的比例有關(guān),Bcl-2占主導(dǎo)時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,Bax占主導(dǎo)時(shí)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。p53是一種抑癌基因,其通過直接激活Bax基因的表達(dá)及下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。有研究顯示[9]：Res可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,達(dá)到抑制腫瘤生長的作用。故我們又進(jìn)一步測定了胰腺癌裸鼠移植瘤組織中Bcl-2、Bax、p53的表達(dá)情況,結(jié)果也發(fā)現(xiàn),與陰性對照組比較，Res各濃度組能顯著減少移植瘤組織中Bcl-2蛋白及mRNA的表達(dá)(P<0.01),且效應(yīng)呈濃度依賴關(guān)系；同時(shí)發(fā)現(xiàn)其也能顯著增加移植瘤組織中Bax、p53蛋白及mRNA的表達(dá)(P<0.01)，其效應(yīng)同樣呈濃度依賴關(guān)系。與5-FU組比較,除p53蛋白表達(dá)水平與5-FU組比較無明顯差異外,Res高濃度組中Bcl-2的蛋白和mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.01)；Bax、p53的蛋白和mRNA水平明顯增高(P<0.01)，表明Res可降低胰腺癌裸鼠移植瘤組織中Bcl-2的表達(dá),增強(qiáng)Bax、p53的表達(dá),且Res對Bcl-2,Bax、p53的影響效果與其濃度有關(guān),呈濃度效應(yīng)關(guān)系,其中高濃度Res的影響效果比5-FU更顯著。

綜上所述,Res可能通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)、同時(shí)上調(diào)Bax和p53的表達(dá)誘導(dǎo)人胰腺癌Miapaca-2細(xì)胞株發(fā)生凋亡,最終抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生長。這種抑制效果與Res的濃度有關(guān),高濃度Res的抑制作用與5-FU的效果基本相同。但其確切的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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(收稿：2016-03-31)

The tumor inhibition study of resveratrol on pancreatic cancer cell xenograft in nude mice

Department of the Second General Surgery，Xi’an Central Hospital(Xi’an 710004)

Qin Yong Ma Qingyong Dang Xiaoyan et al

Objective：To investigate the antitumor effect of Resveratrol on pancreatic cancer Miapaca-2 cell xenograft on athymic. Methods：The pancreatic cancer Miapaca-2 cell xenograft model in nude mice was established and randomly divided into the blank group, the Res group and the saline negative control group. After intervention with Res, the mice was killed. The weight and volume of tumor were recorded. The pathological change of tumor tissue in each group was observed under microscope with HE staining.Real-time quantitative RT-polymerase chain reaction and western bolt assay were used to confirmed the expression of Bcl-2 and Bax、p53 in tumor tissue at mRNA and protein lever. Results：The weight and volume of tumor in Res group were less than those in the negative control group(P<0.01).RT-PCR and Western blot assay indicated Resveratrol of three different concentrations regulated the protein and mRNA expression of Bcl-2 and Bax、p53 in tumor tissue. At the same time ,the expression levels gradually changed as the concentration increased,the difference was significant (P<0.01) .Conclusion：Resveratrol inhibited the growth of pancreatic cancer Miapaca-2 cells xenograft. The effect may be related to the regulating of Bcl-2 and Bax、p53 at mRNA and protein lever.

Pancreatic neoplasms Neoplasm transplantation Rats,nude Tumor suppressor proteins@Resveratrol

*陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2011K13-01-15)

△西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科

◇西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科

▲通訊作者

胰腺腫瘤 腫瘤移植 大鼠,裸 腫瘤抑制蛋白 @白藜蘆醇

R735.9

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.001