吳益峰，朱柯磊，陳磊，王靜文，蔣存兵，李定耀，陳明良

肝細(xì)胞性肝癌中磷酸化PED/PEA-15和P-p27T187的表達(dá)及臨床意義

吳益峰，朱柯磊，陳磊，王靜文，蔣存兵，李定耀，陳明良

目的探討磷酸化蛋白PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187在肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)，揭示兩者在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的可能作用機(jī)制。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western印跡檢測(cè)40份（40例患者）肝細(xì)胞性肝癌和相應(yīng)癌旁組織（距離腫瘤邊緣2 cm以外）及12份（12例患者）正常肝組織中PED/ PEA-15（s-116）和P-p27T187的表達(dá)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系，并采用Spearman秩相關(guān)法分析兩者之間的相關(guān)性。結(jié)果肝細(xì)胞性肝癌組織中PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187蛋白的表達(dá)均明顯高于癌旁組織和正常肝組（均P＜0.05）。PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187的表達(dá)與病理分級(jí)、臨床分期及有無(wú)門靜脈癌栓均有關(guān)（均P＜0.05）；而與發(fā)病年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目及甲胎蛋白（AFP）水平等均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187蛋白在肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.056，P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)ED/PEA-15（s-116）和P-p27T187在肝細(xì)胞肝癌中呈高表達(dá)，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)并有可能成為肝細(xì)胞性肝癌基因治療的新靶點(diǎn)。

腫瘤；肝細(xì)胞性癌；PED/PEA-15（s-116）；P-p27T187

［Modern Practical Medicine，2016，28（9）:1134-1138］

肝細(xì)胞性肝癌（HCC）是惡性程度極高、預(yù)后極差的惡性腫瘤之一［1-2］，目前對(duì)其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的精確分子機(jī)制尚不完全清楚。PED/PEA-15是一種廣譜抗凋亡蛋白質(zhì)，在腫瘤的形成過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，其通過(guò)調(diào)控凋亡關(guān)鍵因子［如天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（caspases）］介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路而阻斷凋亡途徑，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。p27蛋白屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDKI）家族成員，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及分化等，p27的磷酸化可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)p27蛋白水平下降，引發(fā)細(xì)胞周期調(diào)控紊亂并促進(jìn)細(xì)胞異常增殖，抑制細(xì)胞的凋亡［3］。本研究采用免疫組織化學(xué)及Western免疫印跡研究磷酸化PED/PEA-15和P-p27T187在肝細(xì)胞性肝癌的表達(dá)情況，對(duì)比研究?jī)烧叩南嚓P(guān)性，分析揭示其肝細(xì)胞肝癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中的可能作用機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鄞州醫(yī)院2012年10月至2015年12月手術(shù)切除的40份（40例患者）HCC組織及相應(yīng)的癌旁組織（距腫瘤邊緣2 cm以外，切緣經(jīng)病理證實(shí)未見癌細(xì)胞），其中男25例，女15例；年齡30～71歲，平均（47.6±10.0）歲。按照Edmondson分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級(jí)10例，Ⅱ級(jí)12例，Ⅲ級(jí)15例，Ⅳ級(jí)3例；高中分化21例，低分化19例。所有病例均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實(shí)，術(shù)前未接受放療、化療等干預(yù)措施。另收集同期肝血管瘤旁和肝外傷正常肝組織12份（12例患者）作為正常對(duì)照組。標(biāo)本采集后立即將組織塊用0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行反復(fù)清洗，以去除血液，并盡可能剪去多余的其他組織，置于-80℃冰箱保存。標(biāo)本采集均通過(guò)倫理委員會(huì)討論同意。

1.2主要試劑及材料兔抗人多克隆抗體PED/ PEA-15（s-116）和P-p27T187購(gòu)于美國(guó)santaCrus公司，兔抗人多克隆抗體actin購(gòu)于美國(guó)santaCrus公司，山羊抗兔二抗購(gòu)于美國(guó)santaCrus公司。免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。蛋白質(zhì)電泳與電轉(zhuǎn)移裝置（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)定位和半定量檢測(cè)PED/ PEA-15（s-116）和P-p27T187的表達(dá)標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚0.4m，常規(guī)HE染色，光鏡下行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，確定病理診斷、分組及細(xì)胞定位。免疫組化染色采用Elivison二步法檢測(cè)PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187表達(dá)情況，按試劑盒說(shuō)明操作。以PBS代替一抗、二抗做陰性對(duì)照。

1.3.2Western免疫印跡定量檢測(cè)PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187的表達(dá)取約50mg組織液氮研磨后，加入1 ml預(yù)冷組織裂解液（10 mmol/L Tris-HCl，1%Triton X-100，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L PMSF，65 mmol/L DTT，30 mol/L焦磷酸鈉，50 mmol/L NaF，1 mmol/L Na3VO4，2% CocKtail），冰上靜置1h，4℃低溫12000轉(zhuǎn)離心30min，取上清液，考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白濃度。取10g蛋白樣品加入1/4樣品體積的5×上樣緩沖液，100℃煮5min變性后，結(jié)合臨床資料按因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組并分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)誤差在有效范圍內(nèi)。行12%聚丙烯酰胺凝膠（SD-PAGE）電泳分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜，用含5%脫脂牛奶的TBS封閉2h，加入一抗（P-p27T187以1∶300稀釋），4℃冰箱中過(guò)夜，TBST液洗膜15 min×3次，加入二抗中（1∶5 000稀釋），反應(yīng)1 h，TBST洗膜15min×3次后作ECL化學(xué)發(fā)光，X片（Kodak）曝光顯影，利用凝膠成像儀灰度分析軟件QuantityOne進(jìn)行光密度值分析測(cè)定目的顯影條帶和內(nèi)參照Actin的光密度OD值，結(jié)果以比值（樣本光密度OD值/內(nèi)參光密度OD值）表示。

1.4免疫組化結(jié)果判定PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187在免疫組化中的陽(yáng)性表達(dá)體現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)棕黃色顆粒樣物質(zhì)的沉積，根據(jù)顯色強(qiáng)度判斷其陽(yáng)性程度：標(biāo)本無(wú)色為0分；淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕黑色、棕褐色為3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在觀察細(xì)胞中所占的比例分為：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積＞3分為陽(yáng)性［4］。

1.5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，率的比較采用2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，指標(biāo)之間用Spearman秩相關(guān)法進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HCC/癌旁組織及正常肝組織中PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187表達(dá)PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187蛋白陽(yáng)性表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，為粗細(xì)不一的棕黃色顆粒樣物質(zhì)（封三彩圖1～2）。40份HCC組織中PED/PEA-15（s-116）（29份，72.5%）和P-p27T187（31份77.5%）的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織和正常肝組織（2≥11.95，均P＜0.05）；蛋白定量分析結(jié)果提示肝細(xì)胞性肝癌中PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187蛋白的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常肝組織（t≥15.64，均P＜0.05）。見表1。

2.2PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187的表達(dá)與病理分級(jí)、臨床分期及有無(wú)門靜脈癌栓均有關(guān)（均P＜0.05）；而與發(fā)病年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目及甲胎蛋白（AFP）水平等均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。表2。

2.3肝細(xì)胞性肝癌中PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187表達(dá)的相關(guān)性分析PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.056，P＜0.05）。

表1　PED/PEA15（s-116）、P-p27T187在HCC、癌旁及正常肝組織的表達(dá)

3　討論

表2　PED/PEA15（s-116）、P-p27T187的表達(dá)與HCC臨床病理特征關(guān)系

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，不僅對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)有很重要的作用，而且還可以通過(guò)清除變異的細(xì)胞和改變基因表達(dá)來(lái)阻止細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，而細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控往往發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄后階段，通過(guò)蛋白質(zhì)修飾來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化過(guò)程調(diào)節(jié)著細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡等幾乎所有的生命活動(dòng)。如果凋亡被抑制，發(fā)生基因突變的細(xì)胞就會(huì)得以繼續(xù)生存，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。因此，細(xì)胞凋亡調(diào)控的紊亂與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變具有十分密切的關(guān)系。近年來(lái)，隨著細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路研究的不斷深入，凋亡相關(guān)因子的作用及其特異性調(diào)控機(jī)制已成為腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及治療研究的靶點(diǎn)［5］，其中轉(zhuǎn)錄后階段的蛋白質(zhì)磷酸化修飾扮演著重要的作用［6］。因此，深入探討磷酸化蛋白PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路中的作用，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究具有重要意義。

PED/PEA-15是從II型糖尿病患者的組織中克隆得到，屬于IAPs家族成員［7］，是一種具有廣譜抗凋亡功能的小分子蛋白質(zhì)（分子量15kD），由131個(gè)氨基酸組成，其前80個(gè)氨基酸形成規(guī)范的“死亡效應(yīng)區(qū)（DED）”；后51個(gè)氨基酸形成結(jié)構(gòu)不規(guī)則的C末端尾（含有磷酸化位點(diǎn)）。PED/PEA-15主要參與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控以及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)［8-10］。研究表明［8-12］，磷酸化PED/PEA-15（s-116）可通過(guò)其DED區(qū)域與其他含有該區(qū)域的蛋白相結(jié)合，從而抑制死亡誘導(dǎo)復(fù)合體（DISC）形成，使caspase-8、caspase-10等信號(hào)傳導(dǎo)分子失活，阻止caspase系統(tǒng)的級(jí)聯(lián)激活，從而阻斷凋亡過(guò)程，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移；磷酸化PED/PEA-15也可通過(guò)結(jié)合細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶（ERK），通過(guò)ERK-MAP信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，最終抑制caspase的級(jí)聯(lián)激活，阻斷細(xì)胞凋亡過(guò)程，發(fā)揮其抑制凋亡的生物學(xué)效應(yīng)。

p27蛋白屬于CDKI家族成員，由198個(gè)氨基酸組成，是一種高度保守的蛋白質(zhì)分子，其進(jìn)入細(xì)胞核后，通過(guò)其N末端的CDK結(jié)合區(qū)，結(jié)合cyclin和CDK，能夠抑制Cyclin-CDK復(fù)合物的激酶活性，阻礙細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，使細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞的增殖，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起負(fù)向調(diào)控作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。研究表明，p27蛋白水平和功能的障礙可嚴(yán)重?fù)p害細(xì)胞周期的“制動(dòng)”機(jī)制，導(dǎo)致正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，多種腫瘤中均存在p27蛋白的表達(dá)下調(diào)或功能障礙［14-16］，然而，p27蛋白在基因水平極少發(fā)生缺失或突變，在細(xì)胞周期中保持穩(wěn)定，因此，其在蛋白水平的表達(dá)修飾及其在亞細(xì)胞中的分布改變可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)在P-p27T187定位于HCC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并在HCC細(xì)胞中呈高表達(dá)（P＜0.05），其可能作用機(jī)制為在HCC的發(fā)生過(guò)程中，p27蛋白發(fā)生磷酸化后由胞核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，改變了亞細(xì)胞定位，啟動(dòng)了Skp2分子介導(dǎo)的泛素/蛋白酶體降解途徑，促進(jìn)p27的多聚泛素化及隨后的蛋白酶體降解，從而引發(fā)細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖，加快腫瘤細(xì)胞的播散與侵襲，因此p27基因轉(zhuǎn)錄后階段的磷酸化修飾有著重要的作用，P27-T187可降低p27蛋白的表達(dá)水平及干擾細(xì)胞周期穩(wěn)定，通過(guò)AKT/ ERK-MAP信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，最終抑制caspase的級(jí)聯(lián)激活，阻斷細(xì)胞凋亡過(guò)程，發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)效應(yīng)。

本研究中免疫組織化學(xué)及Western免疫印跡結(jié)果顯示，磷酸化蛋白PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187在肝細(xì)胞性肝癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于癌旁組織和正常組織，提示PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187在HCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，其機(jī)制可能在HCC的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中，PED/ PEA-15（s-116）、p27T187的過(guò)表達(dá)參與了細(xì)胞凋亡過(guò)程，通過(guò)相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮其抗凋亡作用，導(dǎo)致基因突變的積聚，促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖及惡性轉(zhuǎn)化。這表明基因轉(zhuǎn)錄后階段的磷酸化修飾是細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要組成部分，其可調(diào)控、干擾甚至阻斷信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞的正常凋亡及分化，促進(jìn)其增殖，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn)PED/ PEA-15（s-116）和P-p27T187蛋白的表達(dá)與HCC患者的發(fā)病年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、AFP水平大小無(wú)關(guān)；而與HCC的Edmondson病理分級(jí)、臨床分期及轉(zhuǎn)移相關(guān)，腫瘤分化程度越低、臨床晚期及有門靜脈癌栓的HCC組織中表達(dá)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。提示PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187對(duì)HCC的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移可能具有促進(jìn)作用，此外，HCC組織中PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者在抗凋亡作用中發(fā)揮著協(xié)同作用。

總之，磷酸化蛋白PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，二者可能通過(guò)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路共同參與了細(xì)胞的凋亡過(guò)程，并協(xié)同抑制HCC細(xì)胞的凋亡，本研究結(jié)果為今后進(jìn)一步深入研究二者在HCC發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的相互作用機(jī)制奠定了有利基礎(chǔ)。磷酸化蛋白PED/ PEA-15（s-116）和P-p27T187可能成為肝細(xì)胞肝癌臨床治療和藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)。

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（本文編輯：姜曉慶）

Express and clinical significance of phosphoryprotein PED/PEA-15 and P-p27T187 in hepatocellular carcinoma

WUYifeng，ZHUKelei，CHENLei，WANGJingwen，LIDingyao，CHENMingliang.（Yinzhou HospitalAffiliated to Ningbo university，Ningbo 315040，Zhejiang，China）
Corresponding author:CHEN Mingliang，Email:wyf5495@163.com

ObjectiveTo investigate the expression of phosphoryprotein PED/PEA-15（s-116）and P-p27T187 in hepatocellular carcinoma（HCC），and to reveal the possible action mechanism of carcinogenesis and cancerometastasis in HCC.MethodsThe protein expressions of PED/PEA-15（s-116）and P-p27T187 were detected by immunohistochemistry and Western blot in resected liver tumor tissues and corresponding adjacent noncancerous tissues from 40 HCC patients and normal liver tissues from 12 patients with benign lesions，their relationship with HCCwas analyzed by Spearman rank correlation.ResultsThe protein expressions of PED/PEA-15（s-116）and P-p27T187 were significantly higher than those in adjacent tissues and normal tissues（all P＜0.05），and they were significantly associatedwiththepathologicalgrade，clinicalstageandmetastasizeofHCC（allP＜0.05）.Howevertherewasnosignificant correlation with age，gender，size oftumor，numbers oftumorand alpha fetoprotein（AFP）level（allP＞0.05）.Spearman rank correlation analysis showed that PED/PEA-15（s-116）was correlated with P-p27T187 in HCC tissues（r=0.056，P＜0.05）.ConclusionsPED/PEA-15（s-116）and P-p27T187 are highly expressed in HCC，which are associated with the occurrence，development and metastasis of HCCand may become a newtarget for gene therapy of HCC.

Hepatocellular carcinoma；PED/PEA-15（s-116）；P-p27T187

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.09.005

R735.7

A

1671-0800（2016）09-1134-05

寧波市科技計(jì)劃（201401C5010016）

315040寧波，寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鄞州醫(yī)院（吳益峰、朱柯磊、陳磊、蔣存兵、李定耀、陳明良）；大連醫(yī)科大學(xué)（王靜文）

陳明良，Email：wyf5495@163.com

2016-03-11