薛改　韓華　陳澤紗　吳紅海　劉建芳　侯艷寧

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·論著·

體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為肝細(xì)胞的研究

薛改韓華陳澤紗吳紅海劉建芳侯艷寧

目的對(duì)肝組織勻漿上清液(LHS)體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSC)定向分化為肝細(xì)胞的功能特性進(jìn)行檢測(cè)。方法選取第3代hUCMSC，采用LHS作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和LHS處理誘導(dǎo)組，每組有3、5、7 d 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)；誘導(dǎo)后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行AFP、CK18、TPH2、CYP3A4、Alb、HGF的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色；并測(cè)定誘導(dǎo)前后CYP3A酶活性、Alb、HGF和尿素的分泌量。結(jié)果LHS誘導(dǎo)3 d后細(xì)胞表達(dá)肝特異性蛋白AFP、CK18、TPH2、CYP3A4、Alb和HGF；對(duì)照組hUCMSC不同時(shí)間點(diǎn)CYP3A酶特異性代謝底物咪達(dá)唑侖的代謝量為0.026～0.030 ng/mg，LHS誘導(dǎo)3、5和7 d后細(xì)胞代謝量分別為(30.14±1.19)、(50.20±6.24)和(120.85±15.52) ng/mg，與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.01)；對(duì)照組細(xì)胞3、5和7 d HGF的分泌量分別為(0.24±0.14)、(0.42±0.20)和(0.18±0.15) ng/mg，LHS誘導(dǎo)后細(xì)胞HGF的分泌量分別為(4.06±1.35)、(3.35±0.17)和(3.83±0.42) ng/mg，與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.01)；LHS誘導(dǎo)后各組細(xì)胞尿素分泌量增加14倍以上，與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.01)；對(duì)照組3、5和7 d Alb的分泌量分別為(22.66±2.99)、(16.99±2.90)和(15.37±1.86) μg/mg，誘導(dǎo)3、5和7 d后Alb的分泌量分別為(36.40±3.53)、(46.66±2.50)和(54.82±4.28) μg/mg，與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論在體外經(jīng)LHS誘導(dǎo)后，hUCMSC能夠分化為具有成熟肝細(xì)胞功能的肝細(xì)胞。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；誘導(dǎo)分化；肝組織勻漿上清液；肝細(xì)胞

近年來，臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC)以其顯著的優(yōu)點(diǎn)引起越來越多研究者的重視[1-2]。UCMSC可經(jīng)體外誘導(dǎo)分化為各種組織細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞，骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，心肌細(xì)胞等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，有關(guān)肝細(xì)胞發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子和肝祖細(xì)胞標(biāo)志物在UCMSC中高表達(dá)，說明UCMSC在向肝細(xì)胞誘導(dǎo)方面更具有優(yōu)勢(shì)[4]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，UCMSC在治療肝臟疾病的同時(shí)在體內(nèi)可定向分化為肝樣細(xì)胞[5]，然而其機(jī)制還不十分清楚。體外研究顯示，UCMSC體外誘導(dǎo)可定向分化為肝樣細(xì)胞[6-8]。研究者們多采用各種細(xì)胞因子如：肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF )和致瘤素M(oncostatin M，OSM)等來進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定指標(biāo)一般為肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物或功能蛋白，如AFP、CK18、CK19、Alb、TDO等。Campard等[9]對(duì)所誘導(dǎo)的UCMSC進(jìn)行了肝細(xì)胞功能鑒定，包括CYP3A4活性、糖元儲(chǔ)備、葡萄糖-6-磷酸酶活性、尿素的檢測(cè)等。以往的研究普遍存在誘導(dǎo)時(shí)間長、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率低等缺點(diǎn)，探尋一種體外誘導(dǎo)時(shí)間短，誘導(dǎo)率高且誘導(dǎo)后具備成熟肝細(xì)胞功能的誘導(dǎo)方式成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)室已成功分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSC)，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫表型符合MSC的免疫表型特征，且具有向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的潛能。前期研究表明，肝組織勻漿上清液(liver homogenate supernatants，LHS)能夠誘導(dǎo)hUCMSC定向分化為具有肝細(xì)胞特異標(biāo)志物和功能蛋白的肝樣細(xì)胞，為進(jìn)一步探討誘導(dǎo)的細(xì)胞是否具有肝細(xì)胞功能，本研究選取能代表肝細(xì)胞功能的CYP3A酶、白蛋白、尿素及人肝細(xì)胞生長因子等作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察誘導(dǎo)后的細(xì)胞功能，以期為臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療終末期肝病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

資料和方法

一、主要試劑和儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Hyclone 公司；0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液購于德國Sigma 公司；HuHGF ELISA試劑盒和HuAlb ELISA試劑盒均購于上海BlueGene公司；BUN檢測(cè)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；HP-1100液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國Agilent公司)；VersaMax連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(250±20)g，購于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(清潔Ⅱ級(jí)，合格證號(hào)：1305066)。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)，實(shí)驗(yàn)過程對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。肝勻漿上清液制備方法參考文獻(xiàn)[10]。

臍帶來源：取自白求恩國際和平醫(yī)院婦產(chǎn)科剖腹產(chǎn)足月健康胎兒，約20 cm，經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，產(chǎn)婦及家屬知情同意。hUMSCs的分離培養(yǎng)、表型及分化潛能鑒定：具體方法參照文獻(xiàn)[11]。

三、實(shí)驗(yàn)分組

取第3代hUMSC，以1.2×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，待細(xì)胞長至80%匯合，吸棄培養(yǎng)液，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組分為①對(duì)照3 d組；②對(duì)照5 d組；③對(duì)照7 d組；④誘導(dǎo)3 d組；⑤誘導(dǎo)5 d組；⑥誘導(dǎo)7 d組。對(duì)照組正常培養(yǎng)，誘導(dǎo)組加入LHS，于不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行處理，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清液。

四、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)誘導(dǎo)后肝細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)

誘導(dǎo)3 d后將誘導(dǎo)液取出，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，檢測(cè)前用含0.3%Tritonx-100 PBS漂洗3次，每次5 min，含5%山羊血清 PBS封閉1 h，一抗AFP(1∶200)、CK18(1∶100)、CYP3A4(1∶100)HGF(1∶50)和Alb(1∶400))4℃過夜，PBS漂洗3次，每次5 min，二抗37℃孵育1 h，復(fù)染核后PBS漂洗3次，每次5 min，封片。

五、CYP3A酶活性的測(cè)定

(一)細(xì)胞處理選用咪達(dá)唑侖作為CYP3A酶的作用底物，具有CYP3A酶活性的細(xì)胞可代謝咪達(dá)唑侖，咪達(dá)唑侖濃度的減少代表CYP3A酶活性的變化。于誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)(3、5、7 d)取出細(xì)胞上清液(-20℃凍存?zhèn)溆?，加入含有CYP3A的相應(yīng)底物咪達(dá)唑侖(200 ng/mL)的無血清培養(yǎng)基2 mL，放入培養(yǎng)箱中孵育2 h，反應(yīng)終止后將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，離心取上清液。

(二)CYP3A酶底物咪達(dá)唑侖的測(cè)定方法采用HPLC-MS法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中咪達(dá)唑侖的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度：500 ng/mL，200 ng/mL，100 ng/mL，50 ng/mL，20 ng/mL，10 ng/mL，內(nèi)標(biāo)為安定，濃度為100 ng/mL。

六、上清液中HGF、Alb和尿素含量的測(cè)定

采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞HGF和Alb分泌水平；采用比色法檢測(cè)BUN水平，即代表細(xì)胞分泌尿素水平，嚴(yán)格按照說明書操作。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

一、誘導(dǎo)后細(xì)胞的肝細(xì)胞特異性蛋白免疫熒光組化染色

誘導(dǎo)后細(xì)胞免疫熒光組化染色結(jié)果顯示：誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)由長梭形變?yōu)槎噙呅位虿灰?guī)則形，肝細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白AFP、CK18高表達(dá)，肝細(xì)胞特異功能蛋白Alb、CYP3A4、TPH2、HGF均有表達(dá)，而未誘導(dǎo)的干細(xì)胞形態(tài)仍為長梭形，肝細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)陰性。結(jié)果見圖1。

注：AFP為甲胎蛋白；CK18為角蛋白18；Alb為白蛋白；CYP3A4為細(xì)胞色素P-3A4酶；TPH2為色氨酸 2，3-加雙氧酶；HGF為肝細(xì)胞生長因子；Ctr為對(duì)照

二、誘導(dǎo)后細(xì)胞CYP3A酶活性的變化

咪達(dá)唑侖的代謝量代表了細(xì)胞CYP3A的酶活性，對(duì)照組干細(xì)胞幾乎無代謝咪達(dá)唑侖的能力，不同時(shí)間點(diǎn)的代謝量為0.026～0.030 ng/mg；3、5和7 d誘導(dǎo)組代謝量分別為(30.14±1.19)、(50.20±6.24)和(120.85±15.52) ng/mg。與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組咪達(dá)唑侖的代謝量顯著增加，且代謝量隨誘導(dǎo)時(shí)間的增長而增加(P<0.01)，說明誘導(dǎo)后細(xì)胞具有CYP3A酶的活性，而且酶活性隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增強(qiáng)。

三、誘導(dǎo)后細(xì)胞分泌HGF水平的變化

對(duì)照組干細(xì)胞有分泌少量HGF的能力，3、5和7 d組HGF的分泌量分別為(0.24±0.14)、(0.42±0.20)和(0.18±0.15) ng/mg，誘導(dǎo)3、5和7 d HGF的分泌量分別為(4.06±1.35)、(3.35±0.17)和(3.83±0.42) ng/mg，與每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組分泌的HGF均顯著增高(P<0.01)。

四、LHS對(duì)hUCMSC分泌尿素水平的影響

對(duì)照組干細(xì)胞幾乎無分泌尿素的能力，分泌量最高為1.80 μmol/mg，誘導(dǎo)后細(xì)胞分泌量增加14倍以上，誘導(dǎo)3、5和7 d尿素的分泌量分別為(20.59±2.61)、(26.64±5.79)和(28.55±4.80) μmol/mg，與每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組分泌的尿素均顯著增高(P<0.01)。

五、LHS對(duì)hUCMSC分泌Alb水平的影響

對(duì)照組干細(xì)胞有分泌Alb的能力， 3、5和7 d組Alb的分泌量分別為(22.66±2.99)、(16.99±2.90)和(15.37±1.86) μg/mg，誘導(dǎo)3、5和7 d Alb的分泌量分別為(36.40±3.53)、(46.66±2.50)和(54.82±4.28) μg/mg，與每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組分泌的Alb均顯著增高(P<0.05或P<0.01)。

討　　論

研究表明，干細(xì)胞所處的組織微環(huán)境可對(duì)其增殖和分化進(jìn)行調(diào)控，使其分化為其他類型的功能細(xì)胞，干細(xì)胞移植后可遷移至受損組織器官并改善受損組織器官的功能。將hUCMSC移植到CCl4所致的慢性肝硬化模型小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞可分化為具有肝細(xì)胞特征和部分功能的肝樣細(xì)胞，改善肝損傷的情況，替代部分肝臟功能[12,13]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者移植hUCMSC后，Alb水平升高，總膽紅素水平降低，腹水等癥狀減輕，但其作用機(jī)制仍不清楚[14-16]。有研究者在體外條件下采用組織提取物模擬組織微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，研究在特定的組織微環(huán)境中干細(xì)胞能否向該組織細(xì)胞定向分化及調(diào)控其分化的關(guān)鍵因素。2005年Choi等[17]在體外條件下采用大鼠胰腺組織提取物誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，誘導(dǎo)后細(xì)胞能夠分泌胰島素、胰高血糖素、胰多肽、生長抑素等。Wang等[11]采用大鼠腦組織勻漿上清液誘導(dǎo)hUCMSC，分化后的細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NSE和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP。研究結(jié)果表明，體外條件下組織提取液能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞向該組織細(xì)胞定向分化。

目前，國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用各種細(xì)胞因子于干細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化的研究中[18-20]，對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞除進(jìn)行標(biāo)志物的鑒定外，檢測(cè)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是否具有成熟肝細(xì)胞的功能，因?yàn)镸SC是否具有功能替代作用是決定其能否應(yīng)用于肝臟再生的關(guān)鍵。目前，主要從Alb分泌、尿素產(chǎn)生、氨代謝和糖原儲(chǔ)存等方面進(jìn)行功能檢測(cè)。大多數(shù)代謝和解毒酶類直至肝臟發(fā)生的最終階段才具備其功能，因此可通過測(cè)定細(xì)胞色素P450酶系的活力來對(duì)細(xì)胞代謝功能進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，LHS可誘導(dǎo)hUCMSC定向分化為具有AFP、CK18及TPH2表達(dá)的肝樣細(xì)胞，并在蛋白和RNA水平得到驗(yàn)證。本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗(yàn)證了分化后細(xì)胞的成熟肝細(xì)胞功能。CYP450酶系是一組由許多同工酶組成的大家族，其中重要的同工酶有CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4，參與人體內(nèi)約90%以上藥物的代謝[21]。其中CYP3A4含量最高(29%)，代謝底物種類最多，因此，CYP3A酶的活力改變是評(píng)價(jià)細(xì)胞代謝功能的一個(gè)重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組干細(xì)胞幾乎無酶代謝功能，與對(duì)照組相比，酶底物的代謝量顯著增加，且隨誘導(dǎo)時(shí)間增長而增加，說明誘導(dǎo)后的細(xì)胞已具備了肝細(xì)胞酶的代謝功能，是成熟肝細(xì)胞的表現(xiàn)之一。尿素的產(chǎn)生和白蛋白的分泌亦是檢測(cè)肝細(xì)胞功能的有效手段。LHS誘導(dǎo)3 d，細(xì)胞即有大量尿素分泌，尿素氮的水平達(dá)到對(duì)照組的14.78倍，誘導(dǎo)7 d，尿素氮的水平為對(duì)照組的66.26倍。LHS誘導(dǎo)后，細(xì)胞的Alb分泌量亦顯著升高，進(jìn)一步說明采用LHS誘導(dǎo)hUCMSC可使其定向分化為具有分泌功能的成熟肝細(xì)胞。

干細(xì)胞的誘導(dǎo)可能是多種因子共同作用的結(jié)果，研究者多選取不同細(xì)胞因子的組合和誘導(dǎo)時(shí)間來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，HGF、FGF、EGF和OSM等均對(duì)干細(xì)胞的分化有明顯的調(diào)節(jié)作用，LHS體外誘導(dǎo)hUCMSC后，HFG水平明顯增高[22]。HFG是肝細(xì)胞生長增殖的一個(gè)關(guān)鍵因子，可由肝細(xì)胞分泌，并促進(jìn)肝細(xì)胞的生長增殖，其水平的增高可能是其發(fā)揮肝臟修復(fù)的一個(gè)因素。

本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了LHS可體外誘導(dǎo)hUCMSC定向分化為具備成熟肝細(xì)胞功能的細(xì)胞，且誘導(dǎo)效率高，所需時(shí)間短。研究結(jié)果表明，肝組織勻漿上清液能夠模擬肝臟組織微環(huán)境誘導(dǎo)hUCMSC定向分化為有功能的肝細(xì)胞，表達(dá)肝細(xì)胞特異性蛋白AFP、CK18、TPH2，并且分泌Alb、尿素和HGF，具備CYP3A酶的活性，具有成熟肝細(xì)胞的功能?？傊?，肝組織勻漿上清液體外誘導(dǎo)法是一種有效的誘導(dǎo)hUCMSC定向分化為肝細(xì)胞的方法，并為干細(xì)胞的肝臟修復(fù)機(jī)制提供了數(shù)據(jù)。

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(本文編輯：錢燕)

Differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into functional hepatocyte induced by liver homogenate supernatants in vitro

XUEGai,HANHua,CHENZe-sha,WUHong-hai,LIUJian-fang,HOUYan-ning.

DeparmentofPharmacology,BethuneInternationalPeaceHospital,Shijiazhuang050082,ChinaCorrespondingauthor:HouYan-ning,Email:biph2011@163.com

ObjectiveTo investigate functional characteristics of hepatocytes that differentiating from human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs) induced by liver homogenate supernatants (LHS). MethodsThe 3rd Passage of hUCMSCs were selected and divided into control group and LHS group. At three time points (3d, 5d, 7d) after being induced, the immunofluorescence-cytochemistry staining of alpha-fetoprotein (AFP), cytokeratin 18 (CK18), tryptophan hydroxylase 2 (TPH2), cytochrome P450 3A4 (CYP3A4), albumin (Alb) and hepatocyte growth factor (HGF) were performed, and the CYP3A enzyme activity and levels of HGF, Alb and BUN were detected. ResultsThe cells had expressed liver specific protein at the third day after LHS inducing, including AFP, CK18, TPH2, CYP3A4, Alb and HGF. In LHS group, the metabolism yield of midazolam, the specific metabolic substrates of enzyme CYP3A was increased significantly than that in control group (30.14±1.19, 50.20±6.24 and 120.85±15.52 ng/mg versus 0.026 to 0.030 ng/mg,P<0.01). Compared with control group, the secretion levels of HGF and Alb in LHS group were increased significantly at 3 time points. Additionally, the urea production of cells in LHS induction group increased 14 times more than that in control group (P<0.01). ConclusionThe study has demonstrated that hUCMSCs could differentiate into hepatocytes with mature functions in vitro after LHS induction.

Human umbilical cord mesenchymal stem cells; Inducting and differentiation; Liver homogenate supernatants; Hepatocyte

河北省衛(wèi)生廳青年科技課題(20150122)；軍隊(duì)“十二五”重點(diǎn)課題(BWS11J002)

050082石家莊白求恩國際和平醫(yī)院藥劑科(薛改，吳紅海，劉建芳)；河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科(韓華)；河北省兒童醫(yī)院藥劑科(陳澤紗)；河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院(侯艷寧)

侯艷寧，Email: biph2011@163.com

2016-03-21)