魏敏，陳義坤，羅誠(chéng)浩，宋旭艷，李冉，潘曦

（湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，湖北武漢430040）

生物轉(zhuǎn)化麩皮提取物的揮發(fā)性成分GC/MS分析

魏敏，陳義坤，羅誠(chéng)浩，宋旭艷，李冉*，潘曦

（湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，湖北武漢430040）

利用從香莢蘭莖中分離出1株能轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素的產(chǎn)香菌株桑腸桿菌（L4-3），生物轉(zhuǎn)化小麥麩皮，得到生物轉(zhuǎn)化麩皮提取物，并與其對(duì)照-麩皮提取物進(jìn)行揮發(fā)性香氣成分GC/MS對(duì)比分析。結(jié)果表明：生物轉(zhuǎn)化麩皮提取物的香氣物質(zhì)有了很大程度的改變和改善，其中香氣主要成分3-羥基-2丁酮，相對(duì)百分含量40.935％，稀釋后賦予生物轉(zhuǎn)化麩皮浸膏濃郁的奶油香氣。

桑腸桿菌（L4-3）；生物轉(zhuǎn)化麩皮浸膏；GC/MS

目前，我國(guó)煙用香料主要由各種分離手段直接從煙草或其它植物中提取的天然香料［1］或化學(xué)合成香料，受到植物資源的有限性和化工合成香料香氣單一性限制，且有的尚不能人工合成或成本太高。將微生物發(fā)酵工程應(yīng)用于香精香料的生物合成中，以工農(nóng)業(yè)廢料為原料，利用微生物可以生產(chǎn)各種天然香料，是一種很好的解決途徑［2-4］。

麩皮為小麥最外層的表皮，是小麥加工面粉后得到的副產(chǎn)品，主要用作飼料，經(jīng)濟(jì)價(jià)值不高。小麥麩皮含有大量人體必需的營(yíng)養(yǎng)成分，如相當(dāng)豐富的維生素、蛋白質(zhì)、含有硫胺素、核黃素、尼克酸等生長(zhǎng)素，富含纖維素和半纖維素，此外，還含有豐富的酶類［5-6］。麩皮作為中藥的一味，具有潤(rùn)肺、滋潤(rùn)皮膚，防癌抗癌，健脾和胃，烏發(fā)固發(fā)，清理腸胃等作用。

本研究利用從香莢蘭莖中分離出的能轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素的產(chǎn)香菌株桑腸桿菌（L4-3）［7-9］，生物轉(zhuǎn)化小麥麩皮，得到生物轉(zhuǎn)化麩皮提取物，并與其未經(jīng)處理對(duì)照-麩皮提取物（以下簡(jiǎn)稱對(duì)照）進(jìn)行揮發(fā)性香氣成分GC/MS對(duì)比分析，研究產(chǎn)香菌對(duì)麩皮進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化后，其致香成分的變化情況，旨在為生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在作物廢料中開(kāi)發(fā)高價(jià)值天然香料的應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料和儀器

1.1.1菌種

桑腸桿菌Enterobactermori VL4-3CCTCCM2012020，從香莢蘭植物的莖中篩選得到，于2012年1月16日保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2斜面培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，BR：馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂13 g/L。

原始種子培養(yǎng)基（麥芽糖蛋白胨培養(yǎng)基）：麥芽糖50 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：為麩皮回流提取液的濾液。

1.1.3原料和藥品

農(nóng)家小麥麩皮；葡萄糖；瓊脂；麥芽糖；蛋白胨；氯化鈉；二氯甲烷；無(wú)水硫酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR；95％乙醇（食用級(jí)）。

1.1.4儀器

SHP-080生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YX.350Z滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；HQL 300B恒溫?fù)u床：武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；6890N-5973C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫科技公司。

1.2方法

1.2.1麩皮發(fā)酵香料的制備

種子液培養(yǎng)方法：用接種環(huán)挑取一環(huán)L4-3到裝有200mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃，150 r/min培養(yǎng)24 h。

1）將干燥的麩皮和水按質(zhì)量比1：25混合，回流提取1 h～3 h后過(guò)濾，取濾液，115℃滅菌25min；

2）斜面培養(yǎng)：將桑腸桿菌L4-3接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中30℃下、pH自然，靜置培養(yǎng)24 h～72 h后置于4℃冰箱中；

3）制備種子培養(yǎng)液：用上述步驟2）中所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在25℃～35℃，轉(zhuǎn)速100 r/min～150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h～36 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接1～4次后制得種子培養(yǎng)液；

4）生物轉(zhuǎn)化：將步驟3）中所得的種子培養(yǎng)液按體積比2％～20％接種到上述步驟1）中的麩皮濾液中，上述濾液的裝罐量為20％，在pH自然，溫度30℃～32℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，不避光條件下發(fā)酵24 h～72 h；

5）將步驟4）中所得的發(fā)酵液和95％乙醇按體積比1∶3，沉淀過(guò)夜后抽濾，除去雜質(zhì)保留濾液，并減壓濃縮除去溶劑，制得黃褐色浸膏，密度約為1.12左右，為生物轉(zhuǎn)化麩皮提取物。

1.2.2揮發(fā)性香氣成分GC/MS分析

1.2.2.1同時(shí)蒸餾萃取

將5 g生物轉(zhuǎn)化麩皮提取物裝入圓底燒瓶中，加入400mL水，用電熱套加熱至沸騰，另一側(cè)的圓底燒瓶中加入200mL的二氯甲烷，60℃水浴沸騰，待中間分液管處液面出現(xiàn)分層后計(jì)時(shí)萃取2 h。萃取結(jié)束后，向二氯甲烷萃取液中加入無(wú)水硫酸鈉，過(guò)夜，過(guò)濾并濃縮至1mL，濃縮液用于進(jìn)行GC/MS分析。同樣的方法進(jìn)行5 g未發(fā)酵麩皮提取物浸膏的同時(shí)蒸餾萃取，用于進(jìn)行GCMS分析。

1.2.2.2GC/MS分析

HP-5MS（50m×0.25mm×0.25μm）毛細(xì)管柱；進(jìn)樣溫度：250℃；分流比20∶1；載氣：He，1mL/min；升溫程序：從50℃（1min）以5℃/min升到250℃（5min）；傳輸線溫度：250℃；離子源：EI源；電子能量：70 eV；掃描范圍：50 amu～400 amu；使用WILEY和MINILAB譜庫(kù)進(jìn)行檢索。

2　結(jié)果與分析

通過(guò)GC/MS對(duì)生物轉(zhuǎn)化麩皮提取物及其對(duì)照進(jìn)行揮發(fā)性香氣成分對(duì)比分析，從下表1中可以看出，生物轉(zhuǎn)化麩皮提取物共鑒定出40種香氣成分，對(duì)比其對(duì)照，香氣有了很大程度的變化與改善。消失的香氣物質(zhì)主要為烷烴類、苯酚類和鄰苯二甲酸酯類；增加的香氣物質(zhì)包括：丙酮醛具有刺激性辛辣氣味和焦糖樣甜味；2，3-丁二酮具有甜的、奶油、黃油香氣，有天然存在；乙酸是重要的有機(jī)酸，呈刺激性特殊香氣；3-羥基-2丁酮，相對(duì)百分含量40.935％，大量稀釋后呈奶油香氣；1，1-2乙氧基乙烷，呈愉快的堅(jiān)果和新鮮青水果香氣，有天然品存在；異丁酸具有強(qiáng)烈的似哈敗奶油氣味和干酪味；丁酸具有呈強(qiáng)烈的奶油和干酪香氣及奶油脂肪酸敗氣味；2，3-丁二醇具有香氣微弱的水果香，有天然存在；糠醛具有焦香味；3-甲基-2-丁烯，1％或更高濃度的乙醇溶液，具有漿果樣果香香氣，有尖刺的酸氣，并帶有發(fā)酵蜜糖樣香調(diào)，屬于天然等同香料；對(duì)乙烯基愈創(chuàng)木酚呈強(qiáng)烈香辛料、丁香和發(fā)酵似香氣，有炒花生氣息。另外相對(duì)百分含量有變化的香氣物質(zhì)：苯乙醇具有特殊玫瑰香氣，丁酸-2-甲基-2-苯乙酯具有青香、花香、甜的果香和蠟樣香氣。所有這些香氣糅合在一起賦予生物轉(zhuǎn)化麩皮提取物具有甘甜奶香氣。

3　結(jié)論

本研究利用從香莢蘭莖中分離出的能轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素的產(chǎn)香菌株桑腸桿菌（L4-3）［7-9］，生物轉(zhuǎn)化小麥麩皮，得到生物轉(zhuǎn)化麩皮提取物，并與其未經(jīng)處理對(duì)照-麩皮提取物（以下簡(jiǎn)稱對(duì)照）進(jìn)行揮發(fā)性香氣成分GC/MS對(duì)比分析。結(jié)果表明：生物轉(zhuǎn)化麩皮提取物的香氣物質(zhì)相比其對(duì)照有了很大程度的改變和改善，其中香氣主要成分3-羥基-2丁酮，相對(duì)百分含量40.935％，稀釋后賦予生物轉(zhuǎn)化麩皮浸膏濃郁的奶油香氣。本方法所用原料來(lái)源廣泛，工藝條件溫和、步驟簡(jiǎn)單，易于操作和實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，成本低，綠色環(huán)保，旨在為生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在作物廢料中開(kāi)發(fā)高價(jià)值天然香料的應(yīng)用提供參考。

表1　生物轉(zhuǎn)化麩皮提取物與其對(duì)照的揮發(fā)性香氣成分對(duì)比分析Table1 Comparativeanalysisof aroma components in biotransformated bran extractand its control

續(xù)表1生物轉(zhuǎn)化麩皮提取物與其對(duì)照的揮發(fā)性香氣成分對(duì)比分析Continue table1 Comparativeanalysisof arom a com ponents in biotransformated bran extractand its control

［1］胡文，何靜，樊永明，等.植物性天然香料及其提取技術(shù)［J］.精細(xì)與專用化學(xué)品，2004，12（6）：6-9

［2］趙偉睿，馬海樂(lè)，劉斌.微生物揮發(fā)性物質(zhì)及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.食品科技，2009，34（8）：32-37

［3］孟慶豪，李繼峰，劉巖梅，等.生物技術(shù)在食品添加劑生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.山東食品發(fā)酵，2011（2）：49-52

［4］羅誠(chéng)浩，喻林，魏敏，等.微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香蘭素的研究進(jìn)展［J］.化學(xué)與生物工程，2011，28（12）：11-16

［5］林琳.小麥麩皮的營(yíng)養(yǎng)成分及其開(kāi)發(fā)利用［J］.農(nóng)業(yè)科技與裝備，2010（3）：41-42

［6］江暉，何珣.小麥麩皮功能性成分的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（2）：834-835

［7］陳勇，魏敏，羅誠(chéng)浩，等.桑腸桿菌及利用其生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)天然香蘭素的方法：ZL 201210117028.4［P］.2012-4-19

［8］羅誠(chéng)浩，魏敏，陳義坤，等.桑腸桿菌及其生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵型煙用麩皮浸膏的方法和應(yīng)用：ZL 201210117406.9［P］.2012-4-19

［9］喻林，魏敏，陳義坤，等.桑腸桿菌L4-3轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素［J］.湖北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，34（3）：286-291

GC/MSAnalysis of Biotransform ated Bran Extract's Volatile Com ponents

WEI Min，CHEN Yi-kun，LUO Cheng-hao，SONG Xu-yan，LI Ran*，PAN Xi
（Technology Center of China Tobacco Hubei Industry Limited-liability Company，Wuhan 430040，Hubei，China）

Wheat bran was biotrans for mated by aroma producing strain Enterobactermori（L4-3），whichwas isolated from the stem vanilla and could conversion of ferulic acid to generate vanillin.And the obtained biotransformated bran extractwas compared with the untreated control-bran exactby GC/MS.The results showed that the aroma ofbiotransformated bran extracthas a large degree of change and improvement.Themain aroma componentsof3-hydroxy-2methylethylketone，the relative contentof40.935％，which can give biotransformated bran extract rich creamy aromaafterdilution.

Enterobactermori（L4-3）；biotransformatedbranextract；GC/MS

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.030

2010年湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2010CDB07301）

魏敏（1979—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：生物技術(shù)開(kāi)發(fā)天然食品添加劑。

李冉（1982—），男（漢），工程師，博士，研究方向：卷煙增香保潤(rùn)。

2015-06-03