陳璐，米艷華*，萬小銘，尹本林，袁志偉，和麗忠

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學院質量標準與檢測技術研究所，昆明　650221；2.中國科學院地理科學與資源研究所，北京　100101；3.昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，昆明　650101）

砷脅迫下磷對三七砷的微區(qū)及亞細胞組織分布特征的影響

陳璐1，米艷華1*，萬小銘2，尹本林1，袁志偉3，和麗忠1

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學院質量標準與檢測技術研究所，昆明650221；2.中國科學院地理科學與資源研究所，北京100101；3.昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，昆明650101）

通過同步輻射X射線熒光分析（滋-SRXRF）和亞細胞組分分離技術相結合，從植株各部位微區(qū)及亞細胞組分層面揭示了藥用植物三七在外源磷素作用下砷吸收累積的分布特征。結果表明：三七的根部和莖部是砷的主要富集部位，添加外源磷素可以有效降低三七根部、莖部和葉片的砷含量，降低幅度分別為47%、80%和33%；三七各部位的亞細胞組分砷的累積量不同，其中細胞液是砷的主要富集組分，具有一定的區(qū)隔化作用，但不能有效地減少砷對植物細胞新陳代謝的影響和毒害；外源磷素的加入可以顯著降低三七不同部位亞細胞各組分中砷的累積量，其降低幅度由高到低依次為細胞液＞細胞壁＞細胞器，但分析表明，外源磷素的添加對三七各部位的亞細胞組分砷累積量占植株總砷累積量比例的影響不大。

三七；砷；滋-SRXRF；亞細胞組分

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三七（Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen）是五加科人參屬多用生名貴草本中藥材，是我國的特有種，其根、莖和花等部位具有顯著的活血化淤、消腫止痛功效，主要用于冠心病、心絞痛等心腦血管系統(tǒng)疾病的治療［1-2］，并在中醫(yī)藥研究中占有重要的位置。文山州已有400多用的栽培歷史［3-5］，是公認的三七“道地產(chǎn)區(qū)”，位于云南省東南部，東經(jīng)103毅35憶～106毅12憶，北緯22毅40憶～24毅48憶之間，具有低緯、高海拔的氣候，用平均氣溫12.0～23.1益（逸10益），積溫4500～7500益；土壤以紅壤、棕紅壤類型為主，pH5～6呈弱酸性，養(yǎng)分含量不高，土壤有效磷含量極少。三七種植要求土壤疏松、排水良好，喜冬暖夏涼的環(huán)境，畏嚴寒酷熱；喜潮濕但怕積水，土壤含水量要求保持22%～40%，現(xiàn)多栽培于海拔800～1000 m的山腳斜坡或土丘緩坡上。這里氣候、土壤入件有利于三七的生長、皂苷含量及其他有效成分的積累，因此形成了文山三七產(chǎn)量高、品質好的特點。

云南省被譽為“有色金屬王國”，已發(fā)現(xiàn)各類礦產(chǎn)150多種，其中25種礦產(chǎn)儲量位居全國前三名，54種礦產(chǎn)儲量居前十位。隨著各類礦業(yè)的大規(guī)模開采，土壤母質中的金屬元素得到釋放，加上農(nóng)業(yè)耕種中大量施用化肥農(nóng)藥，改變了土壤pH、有機質含量降低及不合理的耕作方式，使土壤存在普遍的砷污染［6-9］。調查中三七種植地66.7%的土壤砷超過國家土壤健康質量標準，60%的土壤鎘超標，33.3%的鉻超標［10］。三七主根、須根、莖、葉、花（或果實）砷超標率分別為24%、81%、14%、57%和44%，其中須根、主根和剪口的砷含量較高［11-12］。閆秀蘭等［12］對三七中砷的累積特征和健康風險進行了評價，認為云南文山三七種植區(qū)砷污染及其導致的藥物砷超標現(xiàn)狀已不容忽視。

磷和砷同屬第V族元素，在自然界中往往是共生，形成相似的磷酸鹽（PO3-4）和砷酸鹽（AsO3-4）。兩者在土壤中存在競爭吸附關系［13］，在植物中主要表現(xiàn)為拮抗和協(xié)同效應［14］。砷超富集植物蜈蚣草在高磷或高砷入件下會表現(xiàn)出協(xié)同作用，即磷肥的添加提高了蜈蚣草對砷的吸收［15-16］。三七不屬于重金屬富集植物［10］，其適宜生長的土壤中有效磷的背景值含量較低，磷素的施用在三七生長過程中是否可以抑制砷的毒害效應尚不清楚。因此，本研究通過外源磷素的施入試驗，利用同步輻射X射線熒光分析（滋-SRXRF）技術進行植物樣品中的砷元素微區(qū)分布掃描，以差速離心法分離三七各部位亞細胞組分中的砷并進行分析測定，深入研究外源磷素對三七吸附砷的微區(qū)和亞細胞組分分布特征，為降低三七的砷含量和提高三七品質提供理論基礎和參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1植物培養(yǎng)

選取試驗基地生長環(huán)境良好，株高18～20 cm、莖粗0.5～0.8 cm、葉片寬約1.5 cm長約3 cm，且植株健壯的一用生三七進行水培試驗。設置高砷（As50 mg· L-1）和高砷添加外源磷素（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）兩組試驗處理，添加的五價砷化合物為Na2HAsO4· 12H2O。水培試驗采用“完全營養(yǎng)液”配方［17］，并結合三七生長特性進行了適當調整，配置營養(yǎng)液的試劑均為分析純，各處理3次重復。放置于遮陰避光、透光率8%～12%、溫濕度適宜、通風入件較好的環(huán)境中，為保證三七根系在營養(yǎng)液中正常呼吸，每3 d更新營養(yǎng)液1次。在加砷處理前5 d進行預培養(yǎng)，在第3 d更新營養(yǎng)液一次，第5 d更換為試驗處理營養(yǎng)液，試驗進行3 d后取樣。

1.2X射線吸收光譜測定

選取新鮮三七幼苗的主根、莖（地上3～5 cm處）和葉片中部，選用進口包埋劑OCT（Optimum cutting temperature compound）包埋后，在LEICA CM1950冷凍切片機-20益下制片［18］，切片厚度為10滋m。將冷凍切片黏附于邁拉膜固定在樣品框上，-80益冷凍干燥后用于滋-SRXRF掃描。滋-SRXRF分析在北京正負電子對撞機同步輻射實驗室（BSRF）4W1B應用微束光束線站進行。試驗入件：儲存環(huán)電子能量為2.5 GeV，束流強度為150～200 mA，調節(jié)水平和垂直兩個狹縫，使入射光斑大小為20滋m×20滋m，探測器為Si（Li）固體探測器及能譜儀系列。樣品與入射光線成45毅，掃描步長為200滋m，每個掃描點的時長為60 s［19］。

1.3亞細胞組分分離

培養(yǎng)5 d后，分別剪取生長良好植株的根、莖和葉組織各2.00 g用于亞細胞組分分級實驗。參照Weigel等［20］及Pathore等［21］建立的亞細胞分級方法，將預冷的勻漿液在玻璃勻漿器中勻漿。勻漿液組成：0.25 mmol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH7.8）和1 mmol·L-1赤蘚糖醇，勻漿液pH7.8。勻漿和分離過程溫度均控制在4益，具體步驟如下：將15～20 mL的勻漿液及組織放入50 mL離心管，組織勻漿液在高速冷凍離心機中于225×g離心10 min，下部沉淀中底層碎片為細胞壁（F1）組分；上清液在18 450×g離心90 min，底層碎片為細胞質（Cytoplasmic or-ganelles）（F2）組分，主要指各種細胞器的膜結構；上層清液為細胞液（Cytoplasmic supernatant）（F3）組分，包括細胞質及液泡內大分子有機物及無機離子［22］。將亞細胞組分F1、F2和F3轉入陶瓷坩堝中，70益烘干至恒重，加入10 mL HNO3和0.5 mL HClO4，搖勻過夜，在電熱板上緩慢加熱消煮至清亮，用超純水定容至50 mL。樣品中的As用電感耦合等離子體質譜儀（ELAN DRC-e）測定，植物樣品分析所用試劑均為±級純，并采用國家標準參比物質（植物：GBW-07403）進行分析質量控制，分析誤差均在允許范圍內。

1.4數(shù)據(jù)來理

同步輻射X熒光射線微束激發(fā)三七樣品的能量數(shù)據(jù)，使用X射線能量分析軟件PyMCA進行熒光數(shù)據(jù)處理，結果通過OriginPro8.0軟件繪制砷元素分布圖。植株各部位亞細胞組分中砷的含量通過SPSS17.0軟件進行相關分析。

2　結果與分析

2.1三七各部位砷元素微區(qū)分布特點

三七根部、莖部和葉片橫切面上元素的熒光吸收光譜分析結果見圖1。圖中綠色至紅色依次表示檢測到元素的熒光強度由弱到強，說明檢測區(qū)域砷元素相對含量由低到高。圖1左側A、C、E對應的是高砷濃度As 50 mg·L-1的三七葉片、莖部和根部砷元素熒光強度分布圖，右側B、D、F對應的是高砷添加外源磷素As 50 mg·L-1+P 100 mg·L-1的三七葉片、莖部和根部的砷元素熒光強度分布圖。

從高砷處理的砷元素熒光分布圖可以看到，砷元素在葉片中檢測強度非常弱，峰值為6.78，說明砷元素的含量很少；在莖部出現(xiàn)砷元素的熒光強度增高，峰值達27.8；根部也同樣出現(xiàn)檢測熒光強度較高的區(qū)域，且分布均勻，但峰值為13.66（約為莖部峰值的1/2），說明三七莖部和根部的砷元素含量都高于葉片，且莖部的砷含量最高。從高砷添加外源磷素處理的砷元素熒光分布圖可以看出，葉片砷元素的熒光檢測強度非常弱，平均強度僅為4.5，略低于高砷處理；莖部的砷元素檢出峰值為5.8，平均強度為5；根部的熒光檢測強度略高于莖部，最高達7.25。對比可知，添加外源磷素后顯著減弱了莖部和根部砷元素的熒光強度，其中莖部表現(xiàn)最為顯著；高砷處理的葉片中砷元素熒光強度僅略高于添加外源磷素試驗處理。

熒光強度的高低可以反映出相應檢測區(qū)域的砷元素含量的高低［23-24］。添加外源磷素可以有效降低三七根部、莖部和葉片中砷元素的含量，降低幅度分別為47%、80%和33%。

2.2不同來理三七各部位亞細胞組分砷累積量的分布特征

高砷處理和高砷添加外源磷素的試驗處理中，三七不同部位的亞細胞組分砷累積量各不相同。從表1可以看出，高砷處理三七各部位砷的累積量均顯著高于高砷添加外源磷素處理，其中根部砷的累積量表現(xiàn)最高，莖部次之，葉片砷累積量最低；試驗中亞細胞組分砷的總累積量均表現(xiàn)為根＞莖＞葉。在兩組試驗處理下，除高砷處理的葉片各組分砷累積量表現(xiàn)為細胞液＞細胞器＞細胞壁外，其余砷累積量均表現(xiàn)為細胞液＞細胞壁＞細胞器；三七葉片中細胞壁和細胞器兩組分間的砷累積量無差異，但低于細胞液組分。分析表明三七各部位中不同亞細胞組分對砷的賦存能力不同，細胞液是三七吸收累積砷的主要亞細胞組分，其含砷量約為細胞壁和細胞器的總和。對比兩組試驗發(fā)現(xiàn)，三七生長介質中添加外源磷素后，可以顯著降低各部位亞細胞組分的砷累積量：根部細胞壁、細胞器和細胞液的降幅分別為29%、49%和43%；莖部細胞壁、細胞器和細胞液的降幅分別為34%、28%和43%；葉片細胞壁、細胞器和細胞液的降幅分別為32%、52%和42%。

圖2表示高砷處理和高砷添加外源磷素處理下，三七各部位亞細胞組分砷累積量占整株砷總累積量的百分比。可以看出三七各部位的砷累積量自上而下變化幅度非常大。兩組試驗處理的葉片亞細胞組分中砷累積量占植株總砷累積量的10%以下，莖部和根部亞細胞組分砷累積量占植株總砷累積量的百分比相差不大，但根部略高。高砷處理下根部、莖部和葉片的細胞液組分中砷累積量占植株總砷累積量分別為25%、24%和4%；高砷添加外源磷素處理下根部、莖部和葉片的細胞液組分中砷累積量占植株總砷累積量分別為23%、23%和4%。添加外源磷素對亞細胞組分砷累積量占植株總砷累積量的比例影響不大。細胞液的砷累積量約是相同處理下對應部位細胞壁和細胞器兩個組分砷累積量之和，是三七吸收累積砷的關鍵組分。對比高砷和高砷添加外源磷素兩組試驗處理發(fā)現(xiàn)，添加外源磷素對三七各部位亞細胞組分的砷累積比例影響較小，說明三七的亞細胞組分對砷的吸收累積比例不會隨著生長介質中磷元素濃度的改變而改變。

圖1　不同來理三七各部位橫切片中砷元素熒光分布圖Figure 1　X-ray fluorescence microscopy（XRF）maps of arsenic concentrations in transverse sections of different parts of P.notoginseng under different treatments

3　討論

植物根部吸收的砷90%以上都會向上運輸［25-26］，介質中的砷通過三七根部表皮組織進入體內并通過維管束組織轉運［27］；對土壤-三七系統(tǒng)重金屬污染調查中，三七各部位砷累積特征表現(xiàn)為根入＞剪口＞塊根＞葉＞莖［10］。本研究結果顯示，三七葉片中砷元素的熒光檢測強度最弱，且添加外源磷素可以降低葉片中砷的含量，但降低不顯著。添加外源磷素入件下，莖部砷元素的熒光強度可從27.8降至5.8，降幅達80%；根部的熒光強度從13.66降至7.25，降幅達47%；葉片中的降低幅度最低，僅為33%。三七的根部和莖部是砷的主要富集部位，添加外源磷素可以有效降低三七根部、莖部和葉片中砷的含量，其中莖部的降幅最大，葉片中砷的含量分布略有下降，但不顯著。

表1　三七各部位亞細胞組分中砷的濃度Table 1　Arsenic concentrations in subcellular fractions of P.notoginseng

圖2　不同來理亞細胞組分的砷含量占植株總砷量的百分比（%）Figure 2　Percentages of As accumulation in various subcellular fractions over total As in P.notoginseng under different treatments

三七主根部亞細胞組分的研究中，砷累積量為細胞液＞細胞壁＞細胞質［27］。細胞液是三七體內的主要貯存部位，是細胞新陳代謝的主要場所［28］，也是植物細胞代謝副產(chǎn)品及廢物囤積的場所［29］。細胞壁具有一定固持砷的能力，在高砷處理下，根部中21%以上的砷被固定在細胞壁上。這應該與組成細胞壁的大量羥基、羧基、醛基、氨基和磷酸基等親金屬離子的配位基團可與金屬離子配位而貯存部分金屬有關，從而減少金屬離子的跨膜運輸，降低細胞原生質體的金屬濃度，從而維持細胞的正常生理代謝［30-31］。前人在對超富集植物的解毒機理研究時發(fā)現(xiàn)［32-33］，金屬元素主要分布在細胞液液泡中，具有明顯的區(qū)隔化作用。陳同斌等［22］認為，超富集植物吸收砷時細胞壁會±先與砷結合，將砷固定在細胞壁上，限制其向內部轉運，但細胞壁對砷的貯存能力有限，因此當體內砷濃度過高時，絕大部分砷都會向上轉移，通過區(qū)隔化作用將砷大量聚集到（蜈蚣草）羽葉的細胞液中。本研究也得出，細胞液中砷的累積量最高，細胞壁次之，細胞器最少，但不同于超富集植物細胞液累積率可達60%以上［22］，三七各部位的細胞液砷累積率最高僅為24%。因此，三七的細胞液組分具有一定的區(qū)隔化作用，但不能有效地減少砷對植物細胞新陳代謝的影響和毒害。添加外源磷素對三七各部位的亞細胞組分砷累積量占植株總砷累積量的比例影響不大，說明三七不同部位各亞細胞組分吸附固持砷的能力是有限的，不會隨生長介質的變化而變化。

4　結論

三七的根部和莖部是砷的主要富集部位，添加外源磷素可以有效降低三七根部、莖部和葉片的砷含量，降幅分別為47%、80%和33%。三七各部位亞細胞組分中，細胞液砷累積量最高，細胞壁次之，細胞器最少；三七莖部和根部細胞液組分砷累積量占植株總砷累積量的比例最高為24%，具有一定的區(qū)隔化作用，但不能有效地減少砷對植物細胞新陳代謝的影響和毒害。添加外源磷素對三七各部位的亞細胞組分砷累積量占植株總砷累積量的比例影響不大。

致謝：本研究工作得到北京正負電子對撞機國家實驗室BSRF的4W1B應用微束光束線站的支持。

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Effects of phosphorus additions on micro+and sub+cellular distribution of As in Panax notoginseng under As stresses

CHEN Lu1，MI Yan-hua1*，WAN Xiao-ming2，YIN Ben-lin1，YUAN Zhi-wei3，HE Li-zhong1
（1.Agri-Food Quality Standard and Testing Technology Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650221，China；2.Institute of Geographic Sciences and Natural Resources Research，CAS，Beijing 100101，China；3.The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650101，China）

Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen is one of the traditional precious herbal medicines in China.Arsenic（As）pollution in P. notoginseng has attracted wide attention.In this study，we examined the effects of phosphorus additions on micro-and sub-cellular distribution of As in P.notoginseng using synchrotron radiation X-ray fluorescence（SRXRF）and subcellular separation methods.Results showed that large amounts of As was accumulated in roots and stems.Exogenous phosphorus effectively reduced As concentrations in roots，stems and leaves by 47%，80%and 33%，respectively.The amount of As accumulation was different in different parts of subcellular components. Cytochylema was the main component of As enrichment，showing As compartmentation.However，such compartmentation did not effectively reduce As toxicity to plant cell metabolism.Additions of phosphorus significantly decreased the accumulation of As in various components，in order of cytochylema＞cytoderm＞organelle，but had little effect on the ratios of As in subcellular components to total As.

Panax notoginseng；arsenic speciation；synchrotron radiation X-ray fluorescence（滋-SRXRF）；subcellular component

X503.23

A

1672-2043（2016）04-0654-07

10.11654/jaes.2016.04.007

2015-11-15

云南省科技計劃青用項目（2014FD063）；國家自然科學基金項目（21267024）；云南省創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目（2014HB059）

陳璐（1984—），女，碩士，從事農(nóng)產(chǎn)品質量安全研究。E-mail：clcc_006@163.com

米艷華E-mail：zhoumiqu@163.com