刁競芳 莫嘉強(qiáng) 趙祥 華赟鵬 郭宇 何軍明

·論著·

miR-30a-5p對CD133+Huh7人肝癌干細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

刁競芳 莫嘉強(qiáng) 趙祥 華赟鵬 郭宇 何軍明

目的 本研究采用磁珠法對肝癌干細(xì)胞進(jìn)行分選，進(jìn)而使用miR-30a-5p模擬物和抑制物進(jìn)行基因治療，觀察其對肝癌干細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，并探討其可能的分子生物學(xué)機(jī)制。方法 采用免疫磁珠分選法分選CD133+Huh7肝癌干細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測分選后CD133+細(xì)胞比例，分別采用miR-30a-5p模擬物或抑制物轉(zhuǎn)染肝癌干細(xì)胞設(shè)為模擬物轉(zhuǎn)染組（30aM組）和抑制物轉(zhuǎn)染組（30aI組），并設(shè)立空白對照組（NC組）。采用RT-PCR法檢測細(xì)胞miR-30a表達(dá)水平，Transwell法測細(xì)胞侵襲和遷移能力，western blot法檢測功能蛋白表達(dá)量，熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)測定Wnt/β-catenin信號通路熒光素酶活性，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。肝癌干細(xì)胞分選效率、miR-30a-5p表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。結(jié)果 磁珠分選后的Huh7細(xì)胞中CD133陽性率為（84.6±0.56）﹪，明顯高于未進(jìn)行分選的Huh7肝癌細(xì)胞的CD133陽性率（1.38±0.12）﹪，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t = -16.41，P = 0.01）。30aM組CD133+Huh7肝癌干細(xì)胞中的相對表達(dá)水平（6.23±0.12）較NC組的（1.00±0.04）明顯上調(diào)；miR-30a-5p抑制物轉(zhuǎn)染組（30aI組）的相對表達(dá)水平（0.07±0.01）較NC組明顯下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t =15.98，-7.76，P = 0.00，0.00）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，NC組、30aM組和30aI組的CD133+Huh7肝癌干細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)量分別為（28.33±2.10）個/孔、（12.52±1.03）個/孔和（72.09±7.11）個/孔，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 15.00，-23.01，P = 0.01，0.00）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組、30aM組和30aI組的CD133+Huh7肝癌干細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)量分別為（21.76±1.21）個/孔、（8.74±1.96）個/孔和（145.51±11.23）個/孔，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 8.09，-33.10，P = 0.02，0.00）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，30aM組的兔抗人波形蛋白（Vimentin）、wnt1、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2、MMP3蛋白的表達(dá)量較NC組低，上皮-鈣粘素（E-cadherin）蛋白的表達(dá)量較NC組高，神經(jīng)-鈣粘素（N-cadherin）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Snail）、MMP9蛋白的表達(dá)量沒有明顯差異；30aI組的Vimentin、wnt1、MMP2、MMP3蛋白的表達(dá)量較NC組高，E-cadherin蛋白的表達(dá)量較NC組低，N-cadherin、Snail、MMP9蛋白的表達(dá)量沒有明顯差異。熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，30aM組Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)錄活性（3.23±0.51）明顯低于NC組的（16.45±1.22）（t = -16.33，P = 0.01）。30aI組Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)錄活性（27.16± 0.96）與NC組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 20.94，P = 0.00）。30aM組Vimentin的轉(zhuǎn)錄活性（4.98±0.33）明顯低于NC組的（7.80±0.64）（t = -13.01，P = 0.02）。30aI組Vimentin的轉(zhuǎn)錄活性（9.31±1.50）與NC組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t =12.39，P = 0.02）。結(jié)論 miR-30a-5p對CD133+Huh7肝癌干細(xì)胞的侵襲和遷移具有明顯的抑制效果，有望通過對肝癌干細(xì)胞的治療提高肝癌基因治療的效果。

腫瘤干細(xì)胞； 微RNAs； 細(xì)胞運(yùn)動； 腫瘤侵潤

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發(fā)病率及死亡率均一直居高不下，每年全世界約有57萬人因HCC死亡［1］。盡管目前外科手術(shù)、局部消融術(shù)、化療、放療等HCC治療手段得到了極大的發(fā)展，但患者總體預(yù)后仍不夠理想，因此基因療法、激素療法及免疫療法等HCC的新型治療方法成為提高肝癌患者預(yù)后的希望［2-3］。近年來，miRNAs被證實(shí)不僅具有對正常細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控作用，其異常表達(dá)也與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。在很多研究中證實(shí)，相當(dāng)部分的miRNAs可以作為潛在的腫瘤診斷、治療位點(diǎn)。miR-30家族也參與調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)功能，miR-30a-5p是其中的一員［5］。miR-30a-5p被證實(shí)與包括侵襲遷移在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)，可能成為HCC的有效治療靶點(diǎn)［6］。侵襲遷移是肝癌細(xì)胞最主要的惡性表型之一，肝癌干細(xì)胞被證實(shí)在肝癌細(xì)胞的侵襲遷移過程中扮演重要角色［7］。但目前對miR-30a-5p在肝癌干細(xì)胞侵襲遷移中的作用尚不明確。本研究采用磁珠法對肝癌干細(xì)胞進(jìn)行分選，進(jìn)而使用miR-30a-5p模擬物和抑制物進(jìn)行基因治療，觀察其對肝癌干細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。

材料與方法

一、材料

miR-30a-5p模擬物（miR-30a-5p mimics）和抑制物（miR-30a-5p inhibitors）、miR-30a-5p及內(nèi)參照RNU6的PCR引物由廣州亞科生物科技有限公司設(shè)計合成。脂質(zhì)體2000（LipofectamineTM2000）購自美國Invitrogen公司。人肝癌細(xì)胞株Huh7由廣東省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室凍存。免疫磁珠干細(xì)胞分選系統(tǒng)購自美國Miltenyi公司。兔抗人波形蛋白（Vimentin）、wnt1、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2、MMP3、上皮-鈣粘素（E-cadherin）、神經(jīng)-鈣粘素（N-cadherin）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子（snail）、MMP9、β-actin等抗體購自美國BD公司。熒光素酶報告基因檢測試劑盒（luciferase reporter gene assay kit）Top-luc-luciferaseTMReport購自廣州愛科生物技術(shù)有限公司。

二、方法

1.肝癌干細(xì)胞的分選和流式檢測：同前方法復(fù)蘇培養(yǎng)Huh7肝癌細(xì)胞，以含10﹪胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，嚴(yán)格按照免疫磁珠分選系統(tǒng)說明書進(jìn)行細(xì)胞分選操作。取對數(shù)生長期Huh7細(xì)胞，與CD133抗體的微磁珠進(jìn)行交聯(lián)后過分離柱進(jìn)行分選，收集CD133+細(xì)胞。分別取分離前細(xì)胞和分離后得到的CD133+細(xì)胞加入CD133-FITC熒光抗體，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組培養(yǎng)：磁珠分選所得的CD133+Huh7肝癌細(xì)胞分為如下三組，按照說明書要求，以LipofectamineTM2000作為基因載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染：（1）未轉(zhuǎn)染空白對照（NC）組；（2）miR-30a-5p模擬物轉(zhuǎn)染（30aM）組；（3）miR-30a-5p抑制物轉(zhuǎn)染（30aI）組。各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。

3. miR-30a-5p表達(dá)檢測：按照文獻(xiàn)報道方法分別提取三組CD133+Huh7細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行RT-PCR檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以RNU6作為內(nèi)參照，以未轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞數(shù)據(jù)為1，實(shí)驗(yàn)測得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt分析法進(jìn)行分析計算。miR-30a-5p上游引物序列：GGAACAAGAGACGCCAG；miR-30a-5p下游引物序列：CAGGGCTGAGGTGTCCAG；RNU6上游引物序列：GCAGCACCTGCGCTTCA；RNU6下游引物序列：GAACCGTACCTTCTTTGAAG。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.細(xì)胞侵襲能力檢測：稀釋Matrigel膠加入Transwell小室上室，靜置，凝固。取各組轉(zhuǎn)染后48 h的CD133+Huh7肝癌干細(xì)胞細(xì)胞接種入Transwell小室上室，在下室中置入650 μl含胎牛血清的培養(yǎng)基，于常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1 d，取出上室后去除上室上表面生長的未穿膜貼壁細(xì)胞，固定上室下表面穿膜后貼壁生長的腫瘤細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，普通光鏡觀察。穿膜細(xì)胞的量可以表示細(xì)胞的侵襲能力。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5.細(xì)胞遷移能力檢測：Transwell小室上室不加入Matrigel膠，取各組轉(zhuǎn)染后48 h的CD133+Huh7細(xì)胞進(jìn)行接種，在下室中置入650 μl含胎牛血清的培養(yǎng)基，放入上室進(jìn)行培養(yǎng)，1 d后同前法處理上室，去除上面細(xì)胞，固定、染色下面穿膜細(xì)胞后進(jìn)行觀察。以細(xì)胞穿膜情況代表細(xì)胞的遷移能力。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6.侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)檢測：取各組轉(zhuǎn)染后48 h的CD133+Huh7細(xì)胞提取總蛋白后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉(zhuǎn)后加入一抗抗體恒溫孵育過夜。洗滌辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗處理、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色，膠片曝光觀察蛋白表達(dá)、自動電泳凝膠成像分析儀對照內(nèi)參檢測蛋白相對表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7.熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測CDl33+Huh7細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路和Vimentin活性：各組細(xì)胞嚴(yán)格按照試劑盒說明書，采用Top-lucluciferaseTMReport試劑盒處理后，于酶標(biāo)儀中測定Wnt/β-catenin信號通路和Vimentin熒光素酶活性。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。肝癌干細(xì)胞分選效率、miR-30a-5p表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用± s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、肝癌干細(xì)胞的分選效率

對磁珠分選前后的Huh7細(xì)胞中CD133陽性率進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測后發(fā)現(xiàn)，分選后的Huh7細(xì)胞中CD133陽性率為（84.6±0.56）﹪，明顯高于未進(jìn)行分選的Huh7肝癌細(xì)胞的CD133陽性率（1.38 ±0.12）﹪，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t = -16.41，P = 0.01）。（圖1）

二、三組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-30a-5p表達(dá)水平的比較

RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測miR-30a-5p表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，30aM組CD133+Huh7肝癌干細(xì)胞中的相對表達(dá)水平（6.23±0.12）較NC組的（1.00±0.04）明顯上調(diào)；miR-30a-5p抑制物轉(zhuǎn)染組（30aI組）的相對表達(dá)水平（0.07±0.01）較NC組明顯下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 15.98，-7.76，P = 0.00，0.00）。（表1）

三、三組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力的比較

如圖2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組、30aM組和30aI組的CD133+Huh7肝癌干細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)量分別為（28.33±2.10）個/孔、（12.52± 1.03）個/孔和（72.09±7.11）個/孔。NC組的穿膜細(xì)胞數(shù)量與30aM組和30aI組的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 15.00，-23.01，P = 0.01，0.00）。

四、三組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力的比較

如圖3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組、30aM組和30aI組的CD133+Huh7肝癌干細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)量分別為（21.76±1.21）個/孔、（8.74± 1.96）個/孔和（145.51±11.23）個/孔。NC組的穿膜細(xì)胞數(shù)量與30aM組和30aI組的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 8.09，-33.10，P = 0.02，0.00）。

五、三組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)比較

如圖4 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，30aM組的Vimentin、wnt1、MMP2、MMP3蛋白的表達(dá)量較NC組低，E-cadherin蛋白的表達(dá)量較NC組高，N-cadherin、Snail、MMP9蛋白的表達(dá)量沒有明顯差異；30aI組的Vimentin、wnt1、MMP2、MMP3蛋白的表達(dá)量較NC組高，E-cadherin蛋白的表達(dá)量較NC組低，N-cadherin、Snail、MMP9蛋白的表達(dá)量沒有明顯差異。

圖1 磁珠分選前后人肝癌Huh7細(xì)胞CD133表達(dá)率的比較

表1 三組細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較（± s）

表1 三組細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較（± s）

分組miR-30a-5p表達(dá)水平侵襲細(xì)胞數(shù)量（個/孔）轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)量（個/孔）Wnt/β-catenin信號通路活性Vimentin活性30aM 6.23±0.1212.52±1.03 8.74± 1.96 3.23±0.514.98±0.33 30aI 0.07±0.0172.09±7.11145.51±11.2327.16±0.969.31±1.50 NC 1.00±0.0428.33±2.10 21.76± 1.2116.45±1.227.80±0.64 F值13.55 22.27 35.32 8.53 7.80 P值 0.01 0.00 0.00 0.02 0.02

圖2 光學(xué)顯微鏡下觀察各組肝癌干細(xì)胞侵襲能力的比較 （n = 3，結(jié)晶紫染色×20）

圖3 光學(xué)顯微鏡下觀察各組肝癌干細(xì)胞遷移能力的比較 （n = 3，結(jié)晶紫染色×20）

圖4 各組肝癌干細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)記蛋白Vimentin表達(dá)量的比較

六、三組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路的比較

熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，30aM組Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)錄活性（3.23±0.51）明顯低于NC組的（16.45±1.22）（t = -16.33，P = 0.01）。30aI組Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)錄活性（27.16±0.96）與NC組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 20.94，P = 0.00）。30aM組Vimentin的轉(zhuǎn)錄活性（4.98±0.33）明顯低于NC組的（7.80±0.64）（t = -13.01，P = 0.02）。30aI組Vimentin的轉(zhuǎn)錄活性（9.31±1.50）與NC組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 12.39，P = 0.02）。

討 論

包括肝癌在內(nèi)的惡性腫瘤都被證實(shí)是由不同表型的惡變細(xì)胞亞群組成。這些細(xì)胞亞群中，有少量具有干細(xì)胞樣特征。這些干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲遷移、耐藥性和多向分化潛能強(qiáng)于普通腫瘤細(xì)胞，被稱為腫瘤干細(xì)胞［8］。目前已經(jīng)證實(shí)，肝癌干細(xì)胞與肝癌的增殖、侵襲和遷移密切相關(guān)［9］。開發(fā)可以有效抑制肝癌干細(xì)胞的基因治療手段已經(jīng)成為肝癌治療研究中的熱點(diǎn)。CD133是一種早期造血和神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，目前被作為單一或共同標(biāo)志物，廣泛用作包括肝癌在內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞篩選［10］。除肝癌外，膠質(zhì)瘤、生殖系統(tǒng)腫瘤、結(jié)直腸癌、泌尿系腫瘤中均發(fā)現(xiàn)以CD133為標(biāo)志物的腫瘤干細(xì)胞［11］。在肝癌干細(xì)胞的研究中，也會采用其他表面標(biāo)記蛋白進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞的篩選。CD90蛋白被發(fā)現(xiàn)在肝干（前體）細(xì)胞、骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞及乳腺癌和膠質(zhì)瘤的干細(xì)胞中表達(dá)，目前也有應(yīng)用CD90作為干細(xì)胞標(biāo)志從肝癌細(xì)胞中分離干細(xì)胞的報道［12］。上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EPCAM）也被部分學(xué)者認(rèn)為是肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)志，其在肝癌細(xì)胞表面高表達(dá)，介導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和分化更生物學(xué)過程［13］。卵圓細(xì)胞標(biāo)記蛋白-1和-6也是目前肝干細(xì)胞較好的標(biāo)記分子，在部分研究中被用來分離干細(xì)胞樣肝癌細(xì)胞［14］。本研究基于研究團(tuán)隊(duì)前期結(jié)果，選取了應(yīng)用最為廣泛的CD133分子作為肝癌干細(xì)胞分選的標(biāo)志，采用了免疫磁珠法，對CD133陽性肝癌干細(xì)胞進(jìn)行了篩選［6］。經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)測定篩選后細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，分選后的Huh7細(xì)胞中CD133陽性率高達(dá)（84.6 ±0.56）﹪，說明該法分選肝癌干細(xì)胞的效率滿意，可以用于提取Huh7肝癌細(xì)胞的中肝癌干細(xì)胞的研究。

miR-30家族參與細(xì)胞分化、脂肪組織形成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞衰老和惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種細(xì)胞生物學(xué)功能［15-16］。該家族中的miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d 和miR-30e等成員位于第1、6、8號染色體，miR-384-5p位于X染色體［15-16］。該家族成員的轉(zhuǎn)錄前體均為miR-30，所以其核苷酸序列和參與調(diào)控的靶基因相似，并有可能參與類似的細(xì)胞生物學(xué)功能［17-18］。miR-30家族被發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤中發(fā)揮類似抑癌基因的作用，并可以通過與人蝸牛同源物蛋白（Snail）的3'UTR結(jié)和，調(diào)控惡變細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，影響其侵襲、遷移［19-21］。miR-30a-5p由miR-30a前體莖環(huán)的5'臂加工修飾而來，被證實(shí)在包括肝癌在內(nèi)的多數(shù)惡性腫瘤中低表達(dá)，可能被用作惡性腫瘤的抑制劑［22-24］。然而，也有部分研究顯示，miR-30a家族在諸如胰腺癌等其他惡性腫瘤干細(xì)胞中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用，這可能與不同腫瘤及不同的細(xì)胞系具有特異型分子生物學(xué)機(jī)制有關(guān)［25］。miR-30a-5p對肝癌干細(xì)胞侵襲和遷移的治療效果尚缺乏報道，所以本研究采用該micro RNA作為肝癌干細(xì)胞基因治療的靶點(diǎn)。筆者首先采用RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所采用的miR-30a-5p模擬物可以明顯升高細(xì)胞miR-30a-5p表達(dá)水平，同時證實(shí)，選用的miR-30a-5p抑制物明顯降低了miR-30a-5p的表達(dá)水平，說明本研究采用的基因治療手段可以發(fā)揮期望的基因調(diào)控效果。本研究進(jìn)一步采用Transwell實(shí)驗(yàn)對分組處理后的CD133+Huh7肝癌干細(xì)胞侵襲和遷移能力進(jìn)行測定。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，30aM組CD133+Huh7肝癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30a-5p模擬物后，侵襲和遷移能力明顯受到抑制，說明可能通過提高肝癌細(xì)胞中miR-30a-5p的含量對肝癌干細(xì)胞的侵襲和遷移進(jìn)行抑制。而30aI組CD133+Huh7肝癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30a-5p抑制物后，侵襲和遷移能力明顯受到促進(jìn)，驗(yàn)證了miR-30a-5p的低表達(dá)與肝癌干細(xì)胞的侵襲遷移相關(guān)。目前諸多報道認(rèn)為肝癌干細(xì)胞的存在是導(dǎo)致肝癌化療失敗和肝癌遠(yuǎn)處遷移的主要原因，且己有研究認(rèn)為肝癌干細(xì)胞比非干細(xì)胞的肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和遷移能力。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化通過下調(diào)上皮標(biāo)記蛋白如E-Cadherin和上調(diào)間質(zhì)標(biāo)記蛋白如Vimentin、N-Cadherin，使黏附的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入移動狀態(tài)，這一過程與脾瘤細(xì)胞的侵襲和遷移密切相關(guān)，是早期腫瘤向侵襲性腫瘤進(jìn)展的重要標(biāo)志。此外，金屬蛋白酶家族（MMPs）在惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移中也至關(guān)重要。本研究評估m(xù)iR-30a-5p是否可以通過調(diào)控EMT和MMPs的標(biāo)記物調(diào)控肝癌干細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)30aM組的Vimentin、wnt1、MMP2、MMP3蛋白的表達(dá)量較NC組低，E-cadherin蛋白的表達(dá)量較NC組高，N-cadherin、Snail、MMP9蛋白的表達(dá)量沒有明顯差異；30aI組的Vimentin、wnt1、MMP2、MMP3蛋白的表達(dá)量較NC組高，E-cadherin蛋白的表達(dá)量較NC組低，N-cadherin、Snail、MMP9蛋白的表達(dá)量沒有明顯差異。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-30a-5p的起效機(jī)制，對Wnt/β-catenin信號通路活性進(jìn)行了檢測，在western blot實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，30aM組wnt1蛋白的表達(dá)量較NC組低，而30aI組wnt1蛋白的表達(dá)量較NC組高；熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)顯示，30aM組Wnt/β-catenin信號通路活性和Vimentin轉(zhuǎn)錄活性較NC組低，30aI組Wnt/β-catenin信號通路活性和Vimentin轉(zhuǎn)錄活性較NC組高。國際上有諸多報道認(rèn)為，Wnt/β-catenin信號通路的活性與EMT相關(guān)標(biāo)志物和MMPs家族在細(xì)胞中的表達(dá)密切相關(guān)［26-29］。通過上述研究認(rèn)為，miR-30a-5p可能通過對Wnt/β-catenin信號通路活性的調(diào)節(jié)，進(jìn)而調(diào)控Vimentin、E-cadherin、MMP2、MMP3等EMT和MMPs的標(biāo)記物調(diào)控肝癌干細(xì)胞的侵襲和遷移［30］。所以，本研究開發(fā)的促進(jìn)miR-30a-5p在細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)的手段，有可能通過對肝癌干細(xì)胞抑制促進(jìn)對肝癌的有效治療。

綜上所述，miR-30a-5p對CD133+Huh7肝癌干細(xì)胞的侵襲和遷移具有明顯的抑制效果，有望通過對肝癌干細(xì)胞的治療提高肝癌基因治療的效果。

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Influence of miR-30a-5p on the migration and invasion behavior of CD133+Huh7 human liver cancer stem cell line

Diao Jingfang， Mo Jiaqiang， Zhao Qiang， Hua Yunpeng， Guo Yu， He Junming.Department of Hepatobiliary Surgery， Traditional Chinese Medical Hospital of Guangdong Province，Guangzhou 510000， China

Objective This study uses magnetic beads method to separating the liver cancer stem cells. Using miR-30a-5p mimics and inhibitors for gene therapy. Observe the effects on liver cancer stem cell invasion and metastasis， and to explore its possible molecular mechanisms. Methods Using magnetic activated cell sorting method sorting CD133+Huh7 liver cancer stem cells. Flow cytometry was used to detect proportion of CD133+cells. Using miR-30a-5p mimetic or inhibitor transfected liver cancer stem cells， contribute 30aM group or 30aI group and blank control group NC. The expression level of miR-30a was detected by RT-PCR method. Cell invasion and metastasis were measured by Transwell method. Western blot assay was used to detect the expression of functional protein. Luciferase reporter gene assay was used to measure luciferase activity in Wnt/ beta-catenin signaling pathway. The experiment was repeated 3 times in each group. Liver cancer stem cell sorting efficiency， miR-30a-5p expression level of experimental data were analyzed using single factor analysis of variance and t test. Results significantly higher than that CD133 positive rate of no sorting Huh7 hepatoma cells（1.38 ± 0.12）﹪， the difference has statistical significance（t = -16.41， P = 0.01）. Liver cancer CD133+Huh7 stem cell 30aM group relative expression level（6.23 ± 0.12）compared with the NC group（1.00 ± 0.04）significantly increased； relative expression level of mir-30a-5p in 30aI group（0.07 ± 0.01）was significantly reduced compared with NC group，the difference has statistical significance（t = 15.98， -7.76， P = 0.00， 0.00）. Transwell invasion assay showed that stem cells in the NC group， 30aM group and 30aI group CD133+Huh7 hepatocellular carcinoma the number of cell membrane respectively（28.33 ± 2.10）/ pore，（12.52 ± 1.03）/ hole and（72.09 ± 7.11）/ hole， the difference is statistically significant（t =15.00， -23.01， P = 0.01，0.00）. Transwell transfer experiments results show that stem cells in the NC group， 30aM group and 30aI group CD133+Huh7 hepatocellular carcinoma to wear the number of cell membrane respectively（21.76 ± 1.21）/ pore，（8.74 ± 1.96）/ hole and（145.51 ± 11.23）/ hole， the difference is statistically significant（t = 8.09， -33.10， P = 0.02， 0.00）. Western blot results showed that 30aM group of Vimentin， wnt1， MMP2 and MMP3 protein expression level was lower than that of the NC group， the expression of E-cadherin protein was higher than that of the NC group， the expression of N-cadherin，snail， MMP9 protein no significant difference； Vimentin， Wnt1， MMP2， MMP3 protein expression of 30aI group was higher than that of the NC group， the expression of E-cadherin protein was low compared with the NC group， the expression of N-cadherin， snail， MMP9 protein without significant difference. The luciferase reporter gene assay showed that the transcription activity of Wnt/β-catenin（3.23 ± 0.51） in the 30aM group was significantly lower than that in the NC group（16.45 ± 1.22）（t = -16.33， P = 0.01）. The transcription activity of Wnt/β-catenin in 30aI group（27.16 ± 0.96）was statistically significant higher（t = 20.94， P = 0.00）compared with the NC group. The luciferase reporter gene assay showed that the transcription activity of Vimentin（4.98 ± 0.33）in the 30aM group was significantly lower than that in the NC group（7.80 ± 0.64）（t = -13.01， P = 0.02）. The transcription activity of Vimentin in 30aI group（9.31 ± 1.50）was statistically significant higher（t = 12.39， P = 0.02）compared with the NC group. Conclusion MiR-30a-5p has obvious inhibitory effect on CD133+Huh7 liver cancer stem cell invasion and metastasis， is expected through the treatment of liver cancer stem cells to improve the effect of gene therapy of hepatocellular carcinoma.

Neoplastic stem cells； MicroRNAs； Cell movement； Neoplasm invasiveness

2016-04-24）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.03.006

國家自然科學(xué)基金（81201918）；廣東省科技計劃項(xiàng)目（2012B031800099）

510000 廣州，廣東省中醫(yī)院肝膽外科

何軍明，Email：hejunming0101@sina.com

刁競芳， 莫嘉強(qiáng)， 趙祥， 等. miR-30a-5p對CD133+Huh7人肝癌干細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響［J/CD］.中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志：電子版， 2016， 6（3）：167-173.