張勇張巍張劍平卓文利吳衛(wèi)真譚建明

·論著·

骨髓間充質干細胞對慢性環(huán)孢素腎病大鼠的治療作用

張勇1張巍2張劍平2卓文利2吳衛(wèi)真2譚建明2

目的 觀察骨髓間充質干細胞對慢性環(huán)孢素腎?。–CN）的治療作用。方法 實驗大鼠分成3組：正常對照組（C組）、模型組（H組）、骨髓間充質干細胞（BMSC）治療組（B組）；動態(tài)監(jiān)測腎臟功能［血清肌酐（Scr）、血清尿素氮（BUN）］及大鼠生長情況變化，28 d處死大鼠并切取腎臟進行組織形態(tài)學檢查和腎間質纖維化（RIF）評估，RIF比較采用方差分析和大鼠體重、Scr、尿素水平采用兩因素重復測量方差分析比較各組差異。結果 與C組比較，H組和治療組的Scr ［（30.07 ± 1.25）μmol/l vs（69.40 ± 1.41）μmol/l，（51.04 ± 1.38）μmol/l，P = 0.00］、BUN水平［（9.05 ± 0.57）mmol/l vs（16.80 ± 0.51）mmol/l，（13.12 ± 0.57）mmol/l，P = 0.00］均顯著升高，體重顯著下降［（329.68 ± 5.71）g vs（199.98 ± 5.59）g，（226.22 ± 5.91）g，P = 0.00］，差異具有統(tǒng)計學意義。與H組比較， B組對大鼠的Scr ［（69.40 ± 1.41）μmol/l vs（51.04 ± 1.38）μmol/l，P = 0.00］、BUN水平有明顯下降［（16.80 ± 0.51）mmol/l vs（13.12 ± 0.57）mmol/l，P = 0.00］，體重增加［（199.98 ± 5.59）g vs（226.22 ± 5.91）g，P = 0.00］，差異具有統(tǒng)計學意義。腎組織形態(tài)上，與C組比較，模型組與治療組都出現(xiàn)了明顯的腎臟損害，腎間質纖維化（RIF）評分均顯著升高（0.253 ± 0.030 vs 2.662 ± 0.025，2.256 ± 0.027，P = 0.00），差異具有統(tǒng)計學意義；與H組比較，B組RIF評分顯著下降（2.662 ± 0.025 vs 2.256 ± 0.027，P = 0.00），差異具有統(tǒng)計學意義。結論 BMSC對CCN大鼠有改善作用，可以顯著減少大鼠Scr、BUN水平，改善大鼠體重情況。

骨髓； 間質干細胞； 腎病； 大鼠； 治療

環(huán)孢霉素A是腎臟病領域治療的常見藥物，主要用于腎移植排斥、腎病綜合征等疾病的治療，最大的副作用是引起慢性環(huán)孢素腎?。╟hronic cyclosporine nephropathy，CCN）并導致腎臟功能進行性下降，其主要病理特征有入球動脈透明樣變、灶狀和條帶狀腎間質纖維化、小管萎縮、炎性細胞浸潤［1］。

干細胞治療技術是近年來醫(yī)學研究的熱點，其依據(jù)來源不同分為胚胎干細胞、成體干細胞、誘導性多能干細胞，成體干細胞主要是骨髓來源的細胞，包括造血干細胞（hemopoietic stem cell，HSC）、間充質干細胞（mesenchymae stem cell，MSC）、羊水干細胞、內皮祖細胞等。近年來關于干細胞在腎臟病的應用報道較多，在急性腎損傷、缺血性腎病治療、減少異體腎移植排斥反應等諸多方面干細胞移植已被證實有顯著療效［2-6］。但是目前尚未發(fā)現(xiàn)干細胞在CCN大鼠治療方面的報道。因此，本研究采用環(huán)孢素腎病大鼠模型，通過定期注射骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cell，BMSC）來觀察其對環(huán)孢素腎病是否有治療作用。

材料與方法

一、實驗對象及主要試劑

實驗對象：雄性SD大鼠［購自福建醫(yī)科大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證SCXK（閩）：2012-0001，使用許可：SYXK（閩）2013-0004］。BMSC分離培養(yǎng)采用的大鼠重量 60 ～ 80 g；環(huán)孢素模型制作所采用的大鼠重量150 ～ 180 g。

主要試劑：蘇木素、麗春紅、酸性品紅購自上海邁新公司，PE標記的小鼠抗大鼠CD34、C45、CD90抗體購自美國BC公司，青霉素、鏈霉素購自山東魯抗醫(yī)藥公司。

二、方法

（一）大鼠BMSC的分離、純化

將大鼠去頸椎脫臼處死，無菌條件下分離皮膚肌肉取下大鼠脛骨和股骨，使用含雙抗溶液（100 U/ml青霉素與100 U/ml鏈霉素）的PBS溶液清洗3 ～ 5次。暴露骨髓腔，沖出骨髓收集于離心管中。離心半徑9.5 cm，l 000 r/min離心5 min，棄脂肪層重懸細胞。加入密度為1.073 g/ml的Percoll分離液分離，按 1：1的比例滴加細胞重懸液，離心半徑9.5 cm，2 800 r/min離心30 min，收集中間層培養(yǎng)液洗滌2次，離心半徑9.5 cm，l 000 r/min離心10 min。棄上清收集分離的單個核細胞。重懸細胞，吹打為單細胞懸液接種于 25 cm2培養(yǎng)瓶內，置于37℃、體積分數(shù)為5﹪CO2培養(yǎng)箱內孵育，每3 d更換培養(yǎng)液1次。

（二）大鼠BMSC表型鑒定

選取生長達到80﹪左右融合、生長良好的 P3代SD大鼠BMSC，用 0.125﹪胰酶消化，用PBS漂洗1 ～ 2次，加入PBS溶液制成2.0 × 106個細胞/ ml的混懸液，再使用300目的尼龍網(wǎng)濾過。將過濾的細胞懸液分裝至6只1.5 ml已消毒的EP管中，分別加入小鼠抗大鼠CD34、CD45、CD90單克隆抗體及其同型對照各10 μl混勻，37℃下避光反應15 min，使用PBS溶液沖洗2遍然后進行流式細胞儀檢測。

（三）BMSC成骨誘導分化

取生長良好的第3代BMSC，加入0.25﹪胰酶消化制成細胞懸液，濃度調整為1.0 × 105/ml，接種于預置蓋玻片的6孔細胞培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合80﹪左右時將培養(yǎng)液換成成骨誘導液，每3 d換液。繼續(xù)誘導2周后取出蓋玻片，PBS溶液洗滌3次，4﹪中性甲醛溶液固定，行改良鈣鈷法染色（von kossa法）后在顯微鏡下觀察。

（四）實驗動物分組和干預方法

SD大鼠90只置于南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學中心飼養(yǎng)，給予低鹽飼料［11］（SPF級，購自廣東省實驗動物中心，鈉質量分數(shù)0.042﹪），自由飲食，適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為3組：正常對照組（n = 30，C組）、環(huán)孢素腎病模型組（n = 30，H組）、BMSC治療組（n = 30，B組）。干預方法：按實驗設計要求，環(huán)孢素溶解于橄欖油中，模型組大鼠按25 mg/（kg·d）灌胃法注入環(huán)孢素，正常對照組注入等量橄欖油；B組在第7、21天通過大鼠尾靜脈注入1.0 × 106個細胞/ml，其余各組注入等量生理鹽水，所有大鼠均于第28天頸椎脫臼法處死；環(huán)孢素腎病大鼠成模標準：腎功能進行性惡化，入球動脈透明樣變、灶狀和條帶狀腎間質纖維化、小管萎縮、炎性細胞浸潤［1］。

（五）實驗大鼠相關指標測定

1.實驗大鼠體重、血清肌酐（serum creatine，Scr）、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）測定：實驗期間大鼠自由飲食，分別在第0，7，14，21，28天稱量所有大鼠體重，同時采用眼眶內眥靜脈法采集靜脈血，運用奧林巴斯全自動生化分析儀測定Scr和BUN。

2. HE、PAS、PAS masson染色觀察腎臟組織病理學改變：實驗第28天采用頸椎脫臼法處死所有大鼠，取出腎臟，分成數(shù)小塊，4﹪多聚甲醛固定過夜后石蠟包埋，2 μm切片，分別行HE、PAS、PAS masson染色，顯微鏡下觀察腎臟組織結構改變。

3.小管間質纖維化程度（RIF）判定［15］：小管間質纖維化程度判定采用Li的半定量法，通過計算每個圖片視野損傷面積的百分比進行半定量分析。采用PAS masson染色切片判定小管間質纖維化程度，選取100倍顯微鏡視野作為評判截圖，盡量避開腎小球和腎臟血管，每例模型采集6個不重復的視野，使用AMS病理圖文分析系統(tǒng)進行半定量分析，標準如下：0分為無病變、正常的腎小管間質，0.5分：每視野下間質損傷面積＜ 5﹪，1分：每視野下小管間質損傷面積約占5﹪～ 15﹪，1.5分：每視野下小管間質損傷面積約占16﹪～ 25﹪，2分：每視野下小管間質損傷面積約占26﹪～ 35﹪，3分：每視野下小管間質損傷面積超過＞ 45﹪；通過計算均值進行統(tǒng)計分析。

三、統(tǒng)計學方法分析

采用SAS8.1進行統(tǒng)計學分析，大鼠體重、腎組織RIF評分、Scr、BUN水平采用± s表示。RIF評分采用單因素方差分析和大鼠體重、Scr、BUN水平采用兩因素重復測量方差分析，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、BMSC的形態(tài)學特征

1. BMSC的形態(tài)學特征：原代BMSC呈圓形，大小不一，培養(yǎng)1 d后逐漸貼壁生長并逐漸長出長短不齊的偽足，2 ～ 3 d后大部分細胞均已貼壁生長，細胞也逐漸拉長呈梭形，3 ～ 4 d后隨著細胞的分裂增殖生長，開始出現(xiàn)漩渦樣的細胞群落，8 ～ 10 d后，細胞基本都呈現(xiàn)為梭形，培養(yǎng)至第三代（P3）時細胞呈較均一的長梭形，排列規(guī)則（圖1）。

圖1 光學顯微鏡下觀察骨髓間充質干細胞形態(tài)（×400）

二、BMSC的鑒定

1.流式細胞儀檢測細胞表面抗原：結果顯示細胞表面抗原CD34-CD45的表達吸收峰僅0.9﹪，而CD90表達吸收峰分別為94.5﹪。符合干細胞的鑒定標準（圖2）。

2. BMSC成骨能力鑒定：P3代BMSC加入成骨誘導劑5 d后，細胞逐漸由梭形改變成多角形，并逐漸出現(xiàn)細胞結節(jié)，von kossa染色可見大量的成骨結節(jié)（圖3）。

三、干細胞對大鼠體重、Scr、尿素的影響

隨著實驗進展，與正常組比較，模型組及干細胞治療組大鼠體重增長速度明顯放緩（P ＜ 0.05）；與環(huán)孢素模型組比較，干細胞治療組大鼠體重增長有所增加（P ＜ 0.05），與環(huán)孢素模型組比較，B組大鼠體重明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05，表1）。模型組及干細胞治療組在給予環(huán)孢素后，Scr及BUN水平較正常對照組明顯升高（P ＜ 0.05）；與環(huán)孢素模型組比較，B組大鼠Scr及BUN水平明顯下降（P ＜ 0.05，表1）。

圖2 流式細胞儀檢測細胞表面抗原

圖3 光學顯微鏡下觀察骨髓間充質干細胞成骨能力鑒定（von kossa染色×400）

表1 干細胞治療對大鼠體重、血肌酐、尿素水平的影響（n = 30，x± s）

四、干細胞對大鼠腎組織的影響

腎臟光鏡、HE、PAS、PASM檢查：正常組大鼠腎臟結構正常，模型組及干細胞治療組大鼠均可見到不同程度小管萎縮空泡變性、間質纖維化增生、炎性細胞浸潤、腎內小動脈壁增厚及動脈透明樣變性，腎小球局灶性硬化等典型的環(huán)孢素腎病特點，但是干預組病變程度較模型組病變程度輕（圖4）。

圖4 光學顯微鏡下觀察大鼠腎臟組織 （× 400）

RIF評分：與C組比較，模型組與治療組均出現(xiàn)了明顯的腎臟損害，腎間質纖維化（RIF）評分均顯著升高（0.253 ± 0.030 vs 2.662 ± 0.025，2.256 ± 0.027，P = 0.00），差異具有統(tǒng)計學意義；與H組比較，B組RIF評分顯著下降（2.662 ± 0.025 vs 2.256 ± 0.027，P = 0.00），差異有統(tǒng)計學意義。

討 論

BMSC由于取材方便，是臨床和基礎研究中常用的一種干細胞，它來源于骨髓基質細胞，MSC僅占其中非常小的一部分，因此在臨床和實驗研究應用中，需要提純分離獲取BMSC。在本研究采用了密度梯度離心法結合貼壁離心法培養(yǎng)和純化BMSC，這種方法可以獲得純度很高的P3代細胞，而且具有很強的分化增殖能力，獲取的BMSC容易擴增應用于后續(xù)的實驗［7］。

在干細胞表型和分化能力鑒定方面，BMSC具有基質細胞和MSC的特點，雖然它與造血干細胞等多種血液細胞共存于骨髓中，但是它并不表達造血干細胞標志性抗原CD34，白細胞標志性抗原CD45等［8］，而基質細胞和間質細胞的表面抗原如CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166有特異性表達［9］。本研究培養(yǎng)的P3代細胞高表達CD90等抗原，而不表達CD34、CD45等抗原，也進一步說明所分離培養(yǎng)的細胞正是BMSC。在進一步的分化能力鑒定中，本研究所培養(yǎng)的細胞能夠成功被誘導為成骨細胞，也說明培養(yǎng)的細胞具有分化能力，而非無分化能力的終末細胞。

干細胞具有潛在的細胞分化和組織修復能力、免疫調節(jié)能力，因此，許多科學家都對其寄予厚望，希望以此為突破口為某些疾病特別是慢性進展性疾病的治療找到新的途徑。多年來，不同來源的干細胞技術已經(jīng)被證實對于急慢性腎功能衰竭、難治性腎病治療、異體腎移植排斥等多個腎病領域有改善作用。CCN是限制環(huán)孢素在臨床使用的重要因素。本研究應用尾靜脈注射BMSC治療CCN，在給予環(huán)孢素灌胃28 d后，模型組及MSC組均出現(xiàn)典型的環(huán)孢素腎病的特點如：入球動脈透明樣變、灶狀和條帶狀腎間質纖維化、小管萎縮、炎性細胞浸潤，這與文獻所報道的相一致［1］，說明造模是成功的。同時，發(fā)現(xiàn)干細胞治療組的大鼠在Scr、BUN水平上均較模型組有明顯改善，大鼠的體重增長也較模型組明顯改善，說明干細胞治療是有效果的，可以改善環(huán)孢素腎病的進展。進一步的組織形態(tài)學檢查也證實了這一效果，干細胞治療組的腎間質纖維化程度明顯輕于模型組。這些結果與既往干細胞應用于慢性梗阻性腎病大鼠的治療研究報道基本一致［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)了干細胞對CCN的治療作用，再次證明干細胞治療在腎臟病領域的有效性，相信隨著研究的深入，干細胞必將成為人類攻克疾病的重要武器。

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Treatment research of bone mesenchymal stem cell on chronic cyclosporine nephropathy in rats

Zhang Yong1， Zhang Wei2， Zhang Jianping2， Zhuo Wenli2， Wu Weizhen2， Tan Jianming2.1the Second Military Medical University， Shanghai 200433， China；2Department of Urology， Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command， Fuzhou 350025， China

s: Tan Jianming， Email:tanjim156@xmu.edu.cn

Objectives To observe therapeutic effect on chronic cyclosporine nephropathy by bone mesenchymal stem cell （BMSC） technology. Methods Experimental rats were divided into 3 groups： Group C： normal group （control）； Group H： chronic cyclosporine nephropathy group； Group B： mesenchymal stem cells therapy group； Dynamically monitor renal function （serum creatinine and urea nitrogen） and rat growth change， take kidney tissue for tectology evaluation on 28d， meanwhile，test the expression levels of TGF-β1. Results Compared with group C， group H and group B have serum creatinine［（30.07 ± 1.25）μmol/l vs （69.40 ± 1.41）μmol/l，（51.04 ± 1.38 ） μmol/l，P = 0.00］and urea nitrogen ［（9.05 ± 0.57）mmol/l vs （16.80 ± 0.51）mmol/l，（13.12 ± 0.57）mmol/l，P = 0.00］significantly raised and body weight［（329.68 ± 5.71）g vs （199.98 ± 5.59）g，（226.22 ± 5.91）g，P = 0.00］ significantly dropped， with statistically significant difference. Compared with group H，rats in group B are improved on body weight and renal function， with serum creatinine［（69.40 ± 1.41）μmol/l vs （51.04 ± 1.38）μmol/l，P = 0.00］ and urea nitrogen levels［（16.80 ± 0.51）mmol/lvs （13.12 ± 0.57）mmol/l，P = 0.00］ significantly dropped and body weight ［（199.98 ± 5.59）g vs（226.22 ± 5.91）g，P = 0.00］gained. For kidney tectology， group H and group B both show significant kidney damage and different degrees of tubular interstitial fibrosis， with RIF scores significantly increased（0.253 ± 0.030 vs 2.662 ± 0.025，2.256 ± 0.027，P = 0.00）； and compared with group H，rats in group B have interstitial fibrosis significantly alleviated， with RIF scores dropped significantly（2.662 ± 0.025 vs 2.256 ± 0.027，P = 0.00）. Conclusion Bone mesenchymal stem cell therapy can improve health of rats with chronic cyclosporine nephropathy.

Bone marrow； Mesenchymal stem cell； Kidney diseases； Rats； Therapy

2016-04-12）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.03.001

福建省重大專項課題（2012YZ0001）

200433 上海，第二軍醫(yī)大學1；350025 福州，南京軍區(qū)福州總醫(yī)院泌尿外科2

譚建明，Email：tanjim156@xmu.edu.cn

張勇， 張巍， 張劍平， 等. 骨髓間充質干細胞對慢性環(huán)孢素腎病大鼠的治療作用［J/CD］.中華細胞與干細胞雜志：電子版，2016， 6（3）：135-140.