孫耀 張斌 陳虎

·綜述·

靶向CD123抗原嵌合受體T細胞治療急性髓系白血病的研究

孫耀 張斌 陳虎

急性髓系白血?。ˋML）是一種預后較差的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，迫切需要新的治療手段。隨著嵌合抗原受體（CAR）T細胞（CAR-T）技術(shù)的發(fā)展并在B細胞腫瘤中取得顯著療效，人們把目光投入更多的實體瘤與血液腫瘤靶點中。CD123分子是CAR-T治療AML的潛在靶點，抗CD123 CAR-T具有靶向清除白血病干細胞（LSCs）及原始細胞的能力。本研究總結(jié)了目前在靶向CD123 CAR-T治療急性髓系白血病目前的研究進展。

白血病，急性； 抗原； 受體； 干細胞； 白細胞介素3受體α亞單位； T細胞

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是血液系統(tǒng)的一種惡性腫瘤，以克隆性增殖異常分化的惡性細胞浸潤骨髓、血液及其他組織為特點［1-2］。大量研究表明AML起源于一群數(shù)量相對較小的干祖細胞，即白血病干細胞（leukemia stem cells，LSCs）。CD123是一種包含360氨基酸的糖蛋白，廣泛地表達在白血病原始細胞和白血病干細胞表面，尤其是AML。目前已研發(fā)出幾種靶向CD123的單克隆抗體類藥物并正在進行臨床前及臨床試驗，靶向CD123的抗原受體（chimeric antigen receptor-modifyin，CAR）T細胞（CAR-T）治療也已完成臨床前研究并顯示出顯著的抗瘤效應，目前處于Ⅰ期臨床試驗階段。

一、AML治療現(xiàn)狀

自40多年前阿糖胞苷3 d，環(huán)磷酰胺7 d化療方案取得成功后，AML不再是不治之癥，但此后在AML治療上沒有突破性進展［3］。至今AML仍是一種威脅生命的惡性腫瘤，總生存率為70﹪，在60歲以下成人中治愈率為35～40﹪，而在60以上成人中治愈率僅為5﹪～15﹪［4-5］。對于誘導緩解失敗的患者，5年生存率僅7﹪～12﹪［6］。對于復發(fā)難治AML最好的治療辦法仍然是異基因造血干細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT），而其造成的移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）、感染等嚴重并發(fā)癥也影響了患者的生存。

二、CD123是AML的治療靶點

（一）CD123是白血病干細胞主要標志

隨著對白血病發(fā)病機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)在髓系白血病中存在一群保持自我更新分化能力的白血病細胞，即LSCs，其在白血病細胞中數(shù)量較少，主要呈靜止狀態(tài)［7］。LSCs在表面分子上以CD34+，CD38-，CD71-，HLA-DR-，CD90-，CD123-，CLL-1+，TIM3+等為特點［7-11］。

目前許多化療藥物治療腫瘤的機制是殺滅分裂期細胞，AML化療也是如此并極易復發(fā)，LSCs的存在也許解釋了AML化療后易復發(fā)的原因。并且，相關(guān)報道已證實LSCs在一定程度上對柔紅霉素加阿糖胞苷方案不敏感［7］。所以有效針對LSCs的治療，可能會成為治療復發(fā)難治AML的新策略。

表1 基于CD123單抗藥物現(xiàn)狀

（二）CD123表達情況

CD123是一種糖蛋白，同時也是白細胞介素3受體跨膜α亞單位（IL-3Ra），與CD131一起組成高親和力的IL-3受體，一旦與IL-3結(jié)合，則促進細胞增殖及存活。

1. CD123正常表達

CD123主要在造血系統(tǒng)中表達，CD123在正常CD34+CD38-細胞中低表達或者不表達［12］，Taussig等［13］發(fā)現(xiàn)，在臍帶血中大多數(shù)CD34+/CD38-細胞表達CD123，而骨髓CD34+/CD38-細胞中CD123+細胞比例較低。此外，正常情況下在髓系祖細胞、B淋巴祖細胞中CD123有較高表達，而紅系祖細胞和多向分化潛能祖細胞中低表達或不表達［14-15］；漿細胞樣樹突狀細胞與嗜堿性粒細胞中高表達，而在嗜酸性粒細胞、單核細胞和髓系樹突狀細胞中低表達［16］。

2.CD123異常表達

CD123在AML-LSC及AML原始細胞均高表達［12，17-18］。在NSG小鼠模型中，CD34+/CD38-/CD123+細胞群較 CD34+/ CD38-/CD123+細胞群有更強的重建AML能力；AML原始細胞中CD123的高表達與信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子5（signal transducer and activator of transcription 5， STAT5）信號通路的活化相關(guān)。在臨床上，初診時原始細胞數(shù)量越高的患者，CD123的表達水平越高；CD123高表達的患者與CD123正常患者相比預后更差［19］。這些研究都說明CD123可能與白血病的發(fā)生密切相關(guān)。

除了在AML中表達，CD123在慢性粒細胞白血病，骨髓增生異常綜合癥及肥大細胞增多癥，B-細胞急性淋巴細胞白血?。˙-cell acute lymphocytic leukemia，B-ALL）［20］中也有所表達。最近，Du等［21］首次報道T-細胞急性淋巴細胞白血?。═-cell acute lymphocytic leukemia，T-ALL）也表達CD123。

Jingmei等［22］發(fā)現(xiàn)CD123在造血干細胞移植后急性GVHD患者中升高，可作為一個重要輔助指標用于鑒別急性GVHD及巨細胞病毒感染，特別是對于胃腸道病變。

CD123是LSCs的主要標志，同時在AML原始細胞中表達比例明顯高于正常細胞，尤其是CD34+CD38-細胞，使CD123成為AML靶向治療可行靶點，并且有望為AML治療帶來新的突破。

（三）靶向CD123抗體藥物

目前關(guān)于CD123單抗藥物的研究總結(jié)見表1。靶向CD123的抗體藥物雖然均處于早期臨床試驗階段，也并未展現(xiàn)出突出療效，但仍是目前研究的熱點。Ⅰ期臨床研究中患者表現(xiàn)展現(xiàn)出良好的耐受性，沒有出現(xiàn)嚴重的血液系統(tǒng)不良反應。針對漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤的治療（SL-401）取得了較高緩解率，其中一名患者緩解時間長達20個月以上，但初始有反應的3名患者復發(fā)后再次治療均無效［23］。而在另一項針對AML臨床研究（CSL360）中完全反應率較低，僅1/27達CR［20］，說明靶向CD123的抗體藥物尚需要通過優(yōu)化抗體親和力、多靶點抗體結(jié)合等方法，增強抗腫瘤活性。

表2 CART123臨床前研究匯總

（四）CD123 CART臨床前研究

目前關(guān)于CD123的臨床前研究匯總于表2，部分研究中發(fā)生造血系統(tǒng)毒性，安全性有待商榷。Pizzitola等［25］將CD28、OX40共刺激分子作為胞內(nèi)段，較二代CAR增加了IFN-γ，TNF-α，TNF-β和IL-2等細胞因子分泌水平，提高了抗腫瘤效應，且沒有增加其對造血系統(tǒng)的毒性。Moretti等［16］研究發(fā)現(xiàn)，來自臍血的CD34+正常造血祖細胞與CART123共培養(yǎng)后仍保留正常增殖分化能力。Gill等［26］首次提出CART123安全性問題，他們在體外及胎肝CD34+細胞重建的NSG小鼠模型中均觀察到CART123引起嚴重的造血系統(tǒng)，主要是CD34+CD38-細胞，及B淋巴細胞、血小板及髓系細胞數(shù)量的減少，并建議將CART123作為一種HSCT前的清髓方案更加安全。當然，不同來源造血組織CD123表達水平不一，Huang等［15］指出在CD34+胎肝細胞中CD123表達水平高于臍血或骨髓來源CD34+細胞。由于個體、組織來源不同均可導致CD123表達水平的差異，故靶向表達CD123正常細胞引起的毒性反應不可避免。選擇合理閾值采取干預措施，或通過scFv，CAR結(jié)構(gòu)的改善提高特異性，可能成為未來提高CART123安全性的策略?？紤]到AML移植后患者易感染EB病毒，巨細胞病毒等病毒且常規(guī)藥物治療療效差或副作用大，最近Zhou等［28］設(shè)計了一種CD123-CAR-VST，既能殺傷CD123+AML細胞又對EMV等病毒感染有一定的控制作用。

表3 其他治療AML的CART研究進展

Tasian等［29］假設(shè)CART123清除體內(nèi)AML細胞后及時清除CART細胞，能夠在一定程度上保持對AML的控制同時減少靶向CD123毒性發(fā)生，并且比較了3種不同方法清除CART的效果。

Ruella等［30］發(fā)現(xiàn)80﹪的B-ALL原始細胞中表達CD123，并在CD19陰性復發(fā)的B-ALL腫瘤細胞中檢測到。在體外實驗和動物模型中，CART123不僅能有效清除B-ALL腫瘤細胞，并且CART19聯(lián)合CART123相比CART19能更有效清除CD19陰性復發(fā)腫瘤細胞，可能解決目前CART19治療后復發(fā)率的問題。

Celletis公司繼UCART19后，研發(fā)了異體UCART123，通過TALEN技術(shù)敲除TCRα消除GvHD作用，從而可實現(xiàn)“off-the-shelf”，即通過正常供者T細胞大規(guī)模制備CART，較自體CART明顯縮短制備時間［31］。

（五）CD123 CAR-T臨床試驗方案

截至目前，有兩個CD123 CAR-T治療AML患者的Ⅰ期臨床試驗在開展中。第一個是由美國希望之城醫(yī)學中心注冊（NCT02159495），采用CAR123-28z結(jié)構(gòu)，以減少CAR-T體內(nèi)存留時間，因為文獻表明以CD28作為胞內(nèi)段的第二代CAR結(jié)構(gòu)在體內(nèi)存活時間僅1個月［32］；并且攜帶有自殺基因EGFRt，能夠在EGFR單抗作用下清除CAR-T。此外，他們將CART123作為allo-HSCT前的清髓方案，以最大限度減少腫瘤負荷［6］。第二個是由Pennsylvania大學注冊的CD123-BBz二代CAR（NCT02623582），由于前期研究中發(fā)現(xiàn)了對造血系統(tǒng)的損傷，在臨床試驗中采用電轉(zhuǎn)RNA-CART多次輸注策略確保安全。

在57th ASH會議上，Luo等［27］口頭報告了首例CART123治療AML患者案例。他們設(shè)計的CD123-scFv/ CD28/CD137/CD27/CD3ζ-iCasp9（4SCAR123）4代CAR在患者接受預處理（CTX 250mg/kg/day3天方案）后輸注。輸注后患者出現(xiàn)了嚴重細胞因子風暴綜合癥，通過單次給與妥珠單抗Tocilizumab（IL-6R拮抗劑）后得到控制。患者的骨髓原始細胞治療前59﹪，CART輸注后20 d降低至40﹪，并尚未觀察到嚴重毒副作用。

（六）其他治療AML的CAR-T細胞靶點

目前治療AML的CAR-T研究臨床試驗注冊情況如表3所示，除CD123以外，僅靶向CD33和Lewis Y的研究公布了臨床試驗階段的數(shù)據(jù)。目前主要的AML治療靶點有CD33，Lewis Y，F(xiàn)Rβ。此外，TIM-3，CLL-1等由于其表達特異性，也有望成為AML治療靶點［11，33］。

1. CD33：CD33（Siglec-3）在90﹪的AML原始細胞中持續(xù)表達，同時在多能髓系祖細胞，成熟粒、單細胞及單能干細胞等細胞中表達［34-39］。CD33是AML中第一個用于單抗藥物及免疫治療治療的表面分子。但由于白血病細胞及正常造血細胞中表達水平相近，缺乏特異性，在臨床試驗中觀察到明確的毒性而致使安全性未得到一直公認［40］。一些關(guān)于CART-33的臨床前研究顯示了其抗腫瘤效應［41］，其中Marin等［42］觀察到其對nHPCs的毒性，解放軍總醫(yī)院Wang等［39］開展了全球首例CART-33臨床試驗（NCT01864902）并且治療了1例AML患者。盡管觀察到了短暫的療效，其安全性及有效性仍待進一步探討。不幸的是介于CD33單抗藥物GO的嚴重副作用，關(guān)于CD33的臨床試驗目前被暫停。而Pizzitola等［25］研究發(fā)現(xiàn)相比于CART33，CART123有同等的抗AML效應且安全性更好。

2. Lewis Y：Lewis Y是一種功能尚未知的巖藻糖抗原，它在大量蛋白中均可檢測到，包括腫瘤相關(guān)抗原［43］。并且在包括AML在內(nèi)的廣泛惡性腫瘤中表達拷貝數(shù)很高，而在正常組織中表達較低，其表達越多預后越差［44］。

3.FRβ：葉酸受體（FR）家族由α，β，γ和δ 4個已知成員組成的一組葉酸結(jié)合蛋白受體，并且這些受體的分布具有組織特異性：FRα主要分布于上皮組織，而FRβ主要分布于髓系造血細胞中［45］。這些受體在惡性腫瘤中普遍出現(xiàn)上調(diào)，其中FRβ在70﹪左右的AML患者腫瘤中檢測到，使其成為一個AML治療具有潛力的靶點［46-47］。

五、結(jié)論

將目前基于7G3序列的CD123單抗藥物在Ⅰ期臨床試驗中的結(jié)果并不理想，而相應的CART123在臨床前的試驗中顯示出明顯的抗腫瘤效應［25，48］，說明了CAR-T在髓系腫瘤上應用的潛能。研究已表明，從CAR結(jié)構(gòu)上，4-1BB胞內(nèi)段能避免T細胞無反應性，并促進T細胞增殖及產(chǎn)生記憶細胞，對T細胞在體內(nèi)的持續(xù)明顯優(yōu)于CD28，且4-1BBL優(yōu)于4-1BB胞內(nèi)段設(shè)計，而CD28胞內(nèi)段設(shè)計則優(yōu)于CD80胞外段［49］，意味著未來CAR-T設(shè)計將不斷優(yōu)化，獲得更好療效。而同時介于CART123可能帶來的造血毒性，增加CART123可控性成為開展臨床試驗的必要前提。除了瞬時轉(zhuǎn)染、序貫以allo-HSCT以外，還可采用iCAR-T［50］、synNotch CAR［51-52］等設(shè)計可能會減少其脫靶效應的發(fā)生率；另一方面，采用HSV-TK kinases自殺基因策略，可殺滅增殖中的CAR-T細胞，控制GVHD作用，而保有少量CAR-T在體內(nèi)，起到免疫監(jiān)視作用［53］，最新的相關(guān)“分子開關(guān)”機制，通過抗體藥物或小分子藥物調(diào)控CAR-T在體內(nèi)發(fā)揮作用［54-57］，也給CAR-T治療可控性帶來了新的思路?？偠灾行У目鼓[瘤效果結(jié)合適當?shù)目煽匦?，將是未來CART123治療AML 的發(fā)展方向。

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Chimeric Antigen Receptor-modifying Tagainst CD123 for the treatment of AML

Sun Yao，Zhang Bin， Chen Hu. Department of Hematopoietic Stem Cell Transplantation， Affiliated Hospital & Cell and Gene Therapy Center， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100071， China

s: Chen Hu， Email:chenhu217@aliyun.com； Zhang Bin， Email:zb307ctc@163. com

Acute myeloid leukemia（AML）is a refractory hematologic malignancies which still lacks a good prognosis and craves a new treatment. With the progress of the chimeric antigen receptor-modifying（CAR）T cell（CAR-T）technology and the achievement got on the B-cell malignancies，an increasing targets are been investigated， ranging from kinds of hematology to solid tumors. CD123 molecule is a potential target of leukemia stem cells（LSCs）and leukemia blasts，while anti-CD123 CAR-T has the ability to clear the AML leukemia stem cells（LSCs）and blasts. We summarize the current progress and the direction about the treatment of anti-CD123 CAR-T.

Leukemia； Acute； Antigen； Receptor； Stem cells； Interleukin-3 Receptor alpha Subunit； T cells

2016-02-21）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.03.009

100071 北京，軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院造血干細胞移植科 軍事醫(yī)學科學院細胞與基因治療中心

陳虎，Email：chenhu217@aliyun.com；張斌，Email：zb307ctc@163.com

孫耀， 張斌， 陳虎. 靶向CD123抗原嵌合受體T細胞治療急性髓系白血病的研究［J/CD］.中華細胞與干細胞雜志：電子版，2016， 6（3）：184-190.