宋健李宗義徐國彤金穎

·論著·

誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化形成具有三維結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜樣組織的方法研究

宋健1，3李宗義2徐國彤2金穎1

目的 探討在成分簡單的培養(yǎng)條件下將人胚胎干細(xì)胞（hESCs）通過3D培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)分化為人神經(jīng)視網(wǎng)膜各種細(xì)胞的方法。方法 將不同系的hESCs用消化酶消化后，以團(tuán)塊形式懸浮培養(yǎng)在含有1﹪ Matrigel的培養(yǎng)液中。對于SHhES8系的hESCs在第1天加入BMP4信號通路抑制劑，然后每2天換液以逐漸降低其濃度。在分化的不同時間，通過檢測全能性基因和視網(wǎng)膜標(biāo)志基因的表達(dá)水平以確定hESCs團(tuán)塊的分化狀態(tài)。對于H9系的hESCs，抑制Wnt信號通路以促進(jìn)hESCs分化過程中神經(jīng)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞重要轉(zhuǎn)錄因子CHX10的表達(dá)。數(shù)據(jù)經(jīng)GraphPad Prism 6.0c student's t-test分析處理。結(jié)果 （1）H9系hESC經(jīng)過15 d的分化，各眼區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平都有大幅上調(diào)（與D0相比，D4時SIX3水平上升到720.1±238.6，P = 0.039；SIX6上升到260.0±132.5，P = 0.122；PAX6上升到2661±1353，P = 0.121；LHX2上升到480.4±27.56，P ＜ 0.000；RAX上升到144.9±35.61，P = 0.016），免疫熒光檢測也顯示此時分化的細(xì)胞已經(jīng)具備早期視網(wǎng)膜細(xì)胞的特征；（2）在H9系hESCs分化第7天添加IWR1e抑制Wnt信號通路，可以有效地提高CHX10的表達(dá)，使含CHX10陽性細(xì)胞的團(tuán)塊的比例從0﹪上升到86.6﹪（P = 0.000），表明Wnt信號通路在視網(wǎng)膜細(xì)胞形成中起重要的調(diào)節(jié)作用；（3）SHhES8系的hESCs通過懸浮培養(yǎng)，在第24天時可以檢測到有CHX10陽性的視泡樣結(jié)構(gòu)，繼續(xù)培養(yǎng)至83 d，可以檢測表達(dá)不同的神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞標(biāo)志基因的細(xì)胞，包括CRX陽性的感光細(xì)胞或前體細(xì)胞、AP2α陽性的無長突細(xì)胞和ISLET1陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。結(jié)論 不同系的hESCs對同樣的誘導(dǎo)分化顯示出不同的反應(yīng)；抑制Wnt信號通路可以促使CHX10表達(dá)，實現(xiàn)早期視網(wǎng)膜細(xì)胞的分化成熟；利用無血清懸浮培養(yǎng)的方式，可以使hESCs分化為各種視網(wǎng)膜細(xì)胞和具有一定三維結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜樣組織。

人類； 胚胎干細(xì)胞； 細(xì)胞分化； 視網(wǎng)膜

人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESCs）是來源于人胚胎囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞。在特定培養(yǎng)條件下經(jīng)過體外分離培養(yǎng)所得到的具有無限自我更新和分化多能性的多能干細(xì)胞［1］。通過體外誘導(dǎo)分化，hESCs具有分化為人體所有種類細(xì)胞的潛能。隨著再生醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，人們需要各種不同類型的細(xì)胞進(jìn)行疾病的治療。誘導(dǎo)hESCs分化為人們所需要的細(xì)胞可以為臨床疾病治療提供無限的供體細(xì)胞。

視網(wǎng)膜位于眼球的后部，由神經(jīng)視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮層組成，其功能是將光信號轉(zhuǎn)化為神經(jīng)信號以便大腦產(chǎn)生視覺。它從前腦眼區(qū)起源，逐漸發(fā)育形成視泡、視杯，進(jìn)而成為成熟的視網(wǎng)膜。視網(wǎng)膜的細(xì)胞構(gòu)成包括：視桿細(xì)胞、視錐細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長突細(xì)胞、視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、Müller細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。前七種細(xì)胞構(gòu)成神經(jīng)視網(wǎng)膜，后一種細(xì)胞形成視網(wǎng)膜色素上皮［2］。

誘導(dǎo)hESCs分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞的研究處于干細(xì)胞分化研究的前沿。最初人們主要進(jìn)行單層貼壁細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。隨后，人們發(fā)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)塊也可以誘導(dǎo)hESCs分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞，而且懸浮培養(yǎng)分化得到的視網(wǎng)膜細(xì)胞團(tuán)塊具有一定的視網(wǎng)膜三維結(jié)構(gòu)［3-6］。但是，以往研究建立的誘導(dǎo)分化體系多數(shù)添加了動物源的血清。由于血清成分復(fù)雜，通過這種方法得到的細(xì)胞不利于展開臨床研究和應(yīng)用。因此，有必要建立一種無血清成分的誘導(dǎo)分化體系，使分化得到的細(xì)胞可以更為方便地進(jìn)入臨床應(yīng)用。

材料和方法

一、材料

H9系hESCs和mTeSR購自美國Wicell公司；SHhES8系hESCs為本實驗室自建。DMEM/ F12和neurobasal培養(yǎng)液以及N2 supplement、B27 supplement、NEAA、Glutamine均購自美國Gibco公司；Alexa Fluro 488標(biāo)記的驢抗山羊、山羊抗兔、山羊抗鼠熒光二抗購自美國Proteintech公司。IWR1e購自德國Calbiochem公司，LDN193189購自德國Calbiochem公司，SYBR Green PCR Master Mix購自瑞士Roche公司；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）購自美國HyClone公司，Matrigel購自美國BD公司，中性蛋白酶（美國Sigma公司），β巰基乙醇和DAKO封片劑購自美國Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿用PolyHema（美國Sigma公司）包被；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）濃度為300 nmol/L，RNA逆轉(zhuǎn)錄酶購自天根。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：hESC培養(yǎng)在Matrigel包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)液為mTeSR，每4 ～ 5天用中性蛋白酶消化后以團(tuán)塊傳代。

2.誘導(dǎo)分化：H9系hESCs用中性蛋白酶消化5 ～ 8 min后，用移液槍吹打下來，沉淀后用含1﹪Matrigel的分化培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)（分化培養(yǎng)液的組成成分為1：1 DMEM/F12和neurobasal，0.5﹪ N2 supplement、1﹪ B27 supplement、1﹪ NEAA、1﹪ L-谷氨酰胺，0.1 mmol/L β巰基乙醇，100 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素，每2 d換液1次。SHhES8系hESC用中性蛋白酶消化5 ～ 8 min后，用移液槍吹打下來，沉淀后用含1﹪ Matrigel的分化培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)，并在分化第1天向培養(yǎng)液中添加50 nmol/L BMP4抑制劑LDN193189，之后每2 d換液；分化至第48天時，培養(yǎng)液中不再添加Matrigel。

3. RT-qPCR：提取RNA后用反轉(zhuǎn)錄盒提供的RNA逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA模板。之后以2 μl模板（1：20稀釋）+ 5 μl SYBR Green PCR Master Mix + 3 μl引物的體系在ABI PRISM 7 900實時熒光定量PCR檢測儀上進(jìn)行qPCR反應(yīng)。將D0時基因在RNA水平的表達(dá)量定為1，其他時間點基因在RNA水平的表達(dá)量為其與D0時表達(dá)量的相對值（表1）。

表1 RT-qPCR引物序列

4.免疫熒光：將10 μm厚的樣品切片在室溫放置5 min，然后用4﹪多聚甲醛固定15 min。接著用PBS洗3次，每次5 min，然后用透膜封閉液（10﹪山羊血清 + 0.2﹪ Triton溶解在PBS中）封閉30 min。加一抗后置4℃過夜。用PBS洗3次后加熒光二抗，在37℃避光放置1 h，之后用PBS洗1次，5 min，加DAPI反應(yīng)15 min后，用PBS再洗1次，5 min，最后用DAKO封片劑封片保存（表2）。

表2 免疫熒光一抗的來源及稀釋比例

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

運(yùn)用GraphPad Prism 6.0c 統(tǒng)計分析軟件對三次獨立重復(fù)實驗進(jìn)行student's t-test 分析，表示為，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義。

圖1 H9系hESCs體外視網(wǎng)膜譜系誘導(dǎo)分化時程

結(jié) 果

一、H9系hESCs分化為早期視網(wǎng)膜前體細(xì)胞

圖2 倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)H9系hESCs向視網(wǎng)膜譜系分化不同時間的形態(tài)

圖3 全能性標(biāo)志基因和視區(qū)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平隨分化進(jìn)行而變化

本研究建立了一種無血清的培養(yǎng)方式來誘導(dǎo)hESC向視網(wǎng)膜方向分化。在本實驗中，如圖1所示，H9系的hESCs先在mTeSR培養(yǎng)液中增殖到一定程度，經(jīng)中性蛋白酶消化并沉淀后，用含有1﹪Matrigel的分化培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)。隨著分化的進(jìn)行，神經(jīng)上皮樣細(xì)胞團(tuán)塊開始出現(xiàn)并逐漸增大（圖2）。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，全能性標(biāo)志基因 NANOG和OCT4的表達(dá)水平隨著分化的進(jìn)程逐漸降低，在分化第4天降到很低的水平（與D0相比，D4時NANOG水平下降到0.0245±0.004，P ＜ 0.000； OCT4水平下降到0.0335±0.009，P ＜ 0.000）。與之相反，在分化第4天，眼區(qū)轉(zhuǎn)錄因子SIX3，LHX2和RAX，表達(dá)水平顯著升高（與D0相比，D4時SIX3水平上升到720.1±238.6，P = 0.039；LHX2上升到480.4±27.56，P ＜ 0.000；RAX上升到144.9± 35.61，P = 0.016），至少在到分化15 d期間都保持在雖有波動但都在較高水平的趨勢。與眼區(qū)轉(zhuǎn)錄因子不同，轉(zhuǎn)錄因子SOX2的表達(dá)水平在整個分化過程中沒有出現(xiàn)明顯的變化（圖3）。SOX2的這種表達(dá)譜式體現(xiàn)了它既是全能性細(xì)胞的標(biāo)志基因也是神經(jīng)干（祖）細(xì)胞的標(biāo)志基因。在蛋白水平，免疫熒光檢測顯示，在分化的第4天只有極少數(shù)細(xì)胞表達(dá)全能性因子OCT4，部分細(xì)胞中可以檢測到視網(wǎng)膜譜系的標(biāo)志基因 PAX6和RAX的表達(dá)（圖4），表明此時細(xì)胞團(tuán)塊已經(jīng)開始眼區(qū)的命運(yùn)決定。在分化的第15天，已檢測不到OCT4陽性細(xì)胞，而SOX2在大部分細(xì)胞中都能被檢測到，說明此時大部分細(xì)胞都已經(jīng)向神經(jīng)譜系分化，同時，在大部分細(xì)胞中，視網(wǎng)膜方向的標(biāo)志基因 PAX6和RAX都能被檢測到（圖5）。這些結(jié)果說明在本實驗誘導(dǎo)分化體系中，H9系的hESC被成功地誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜譜系的細(xì)胞。

圖4 光學(xué)顯微鏡下觀察免疫熒光檢測H9系hESCs分化至第4天時全能性及早期視網(wǎng)膜標(biāo)志基因的表達(dá) （免疫熒光染色×20）

圖5 光學(xué)顯微鏡下觀察免疫熒光檢測H9系hESCs分化至第15天全能性及早期視網(wǎng)膜標(biāo)志基因的表達(dá) （免疫熒光染色×20）

二、抑制Wnt信號通路可以促進(jìn)CHX10表達(dá)

在H9系hESCs向視網(wǎng)膜譜系的誘導(dǎo)分化過程中，雖然早期視網(wǎng)膜標(biāo)志基因可以被快速誘導(dǎo)表達(dá)，但是在持續(xù)的培養(yǎng)過程中，眼區(qū)轉(zhuǎn)錄因子RAX在RNA水平的表達(dá)在第7天之后有一定程度的降低，并且一直檢測不到在視網(wǎng)膜發(fā)育中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子CHX10的表達(dá)，造成這種結(jié)果的原因可能是H9系hESCs由于其自身的特性，在這種分化條件下并不適宜繼續(xù)往下分化。本研究嘗試在分化體系中引入Wnt信號通路的抑制劑IWR1e以阻斷Wnt信號通路（圖6），進(jìn)而促進(jìn)CHX10的表達(dá)。如圖7所示，經(jīng)IWR1e（3 μmol/L）處理8 d后，在部分細(xì)胞團(tuán)塊中可檢測到CHX10陽性的細(xì)胞，含有CHX10陽性細(xì)胞團(tuán)塊的比例從未經(jīng)IWR1e處理組的0﹪上升到處理組的86.6﹪（P = 0.0002）這一結(jié)果表明，Wnt信號通路在視網(wǎng)膜譜系分化中起重要的調(diào)節(jié)作用，抑制Wnt信號通路可以有效地促進(jìn)CHX10的表達(dá)。

圖6 抑制Wnt信號通路的H9系hESCs分化時程

三、SHhES8系hESCs分化為具有一定三維結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜樣組織

與H9系hESC的誘導(dǎo)分化不同，SHhES8系hESCs在H9系hESC的誘導(dǎo)分化體系中不能被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)譜系的細(xì)胞，必須在其分化早期加入BMP4抑制劑阻斷BMP4信號通路，才能實現(xiàn)SHhES8細(xì)胞向神經(jīng)譜系的分化（圖8）。通過在第1天加入BMP4抑制劑（LDN193189）的誘導(dǎo)分化，在分化的第13天左右，在細(xì)胞團(tuán)塊的周圍已經(jīng)形成神經(jīng)上皮，并且在大部分細(xì)胞中檢測到早期視網(wǎng)膜標(biāo)志基因 RAX的表達(dá)，表明此時細(xì)胞團(tuán)塊中的大部分細(xì)胞已經(jīng)完成了眼區(qū)的命運(yùn)決定（圖9，10）。在分化的第24天左右，已經(jīng)有視泡樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，在這些視泡樣結(jié)構(gòu)中可以檢測到CHX10陽性的細(xì)胞（圖9，10），說明此時已經(jīng)開始形成早期視網(wǎng)膜。在分化的第40天時，可以檢測到含CHX10陽性細(xì)胞的團(tuán)塊，但沒有檢測到CRX陽性的細(xì)胞（結(jié)果未展示）。在分化到83天時，檢測到含有視網(wǎng)膜終末分化標(biāo)志基因陽性細(xì)胞的視網(wǎng)膜樣組織。這些細(xì)胞包括ISLET1陽性、BRN3陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，AP2α陽性的無長突細(xì)胞，以及CRX陽性、Recoverin陽性的感光細(xì)胞或前體（圖11）。同時，這些視網(wǎng)膜樣組織中依然存在大量的CHX10陽性細(xì)胞（圖11），表明成熟的視網(wǎng)膜組織還沒有形成。

圖7 光學(xué)顯微鏡下觀察抑制Wnt信號通路促進(jìn)CHX10的表達(dá) （免疫熒光染色×20）

圖8 SHhES8系hESC向視網(wǎng)膜譜系分化的時程

圖9 倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)SHhES8系hESCs向視網(wǎng)膜譜系分化不同時間的形態(tài) （×10）

討 論

近年來，有關(guān)誘導(dǎo)hESC向視網(wǎng)膜方向分化研究的報道不斷增多?？傮w上看，主要的策略是利用一些小分子化合物促使hESCs分化為神經(jīng)前體細(xì)胞，然后利用一些生長因子和血清聯(lián)合作用，促使神經(jīng)前體細(xì)胞向視網(wǎng)膜譜系分化［4-6］。由于干細(xì)胞研究主要是以臨床應(yīng)用為目的，而外源的動物源成分如血清的加入，使分化體系中參入了較多不可控因素。這些不可控因素極大地限制了干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用。因此，有必要建立一種無血清的hESCs的誘導(dǎo)分化體系。筆者在前期研究中，分別建立了誘導(dǎo)小鼠和大鼠ESC向視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化的體系，并用以完成視網(wǎng)膜祖細(xì)胞移植后成瘤機(jī)理以及向視網(wǎng)膜神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的調(diào)控研究［7-8］。本研究，進(jìn)一步建立了無血清成分的誘導(dǎo)hESC向神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞的分化體系，不僅豐富了研究體系，更使不可控因素下降了很多，在干細(xì)胞臨床應(yīng)用的道路上邁進(jìn)了一步。

圖10 光學(xué)顯微鏡下觀察免疫熒光檢測SHhES8系hESC分化早期視網(wǎng)膜標(biāo)志基因的表達(dá) （免疫熒光染色）

由于hESC系建系方式不同、所用囊胚發(fā)育階段不同及建系后培養(yǎng)方式不同等因素，不同的hESC系具有不同特性。這種不同細(xì)胞系之間的差異在誘導(dǎo)分化中尤為顯著。此項研究證明了這個事實。也有研究指出，不同的體細(xì)胞重編程所得到的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系之間也存在很大的差異，而這種差異反映到誘導(dǎo)分化中，可能就是同一種分化方法在不同細(xì)胞系之間產(chǎn)生不同結(jié)果［9］。如何能夠使不同細(xì)胞系同步為同一種狀態(tài)，可能是未來多能干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一項重要課題。最近的原始態(tài)（na?ve state）hESCs研究［10］表明，常規(guī)培養(yǎng)的處于始發(fā)態(tài)（primed state）hESCs可以回到原始態(tài)，也許通過這種方法，可以將不同多能干細(xì)胞系進(jìn)行同步。

圖11 光學(xué)顯微鏡下觀察免疫熒光檢測SHhES8系hESC分化形成各種視網(wǎng)膜細(xì)胞 （免疫熒光染色×10）

在hESCs向視網(wǎng)膜譜系細(xì)胞分化過程中，起主要作用的信號通路研究目前還不是很清楚。在實驗中，通過抑制Wnt信號通路有效地提高了視網(wǎng)膜發(fā)育中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子CHX10的表達(dá)，從而使H9系向神經(jīng)視網(wǎng)膜譜系的分化得以進(jìn)行，雖然抑制Wnt信號通路也可以增加SHhES8系hESCs向視網(wǎng)膜譜系分化過程中CHX10的表達(dá)，但是在不添加Wnt信號通路抑制劑的情況下，SHhES8系也可以表現(xiàn)出含有CHX10陽性細(xì)胞的視泡樣結(jié)構(gòu)（結(jié)果未展示），這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明來源于不同hESC系的細(xì)胞可以表現(xiàn)出不同的分化特征。值得說明的是，在分化到83 d已檢測到含有視網(wǎng)膜終末分化標(biāo)志基因（ISLET1等）陽性細(xì)胞的視網(wǎng)膜樣組織中，同時存在大量的CHX10陽性細(xì)胞（圖12），雖然在成熟視網(wǎng)膜中，CHX10在雙極細(xì)胞低水平表達(dá)，甚至也可能會在Müller細(xì)胞有表達(dá)，但這兩種細(xì)胞通常在發(fā)育和分化的更晚期才出現(xiàn)。因此，本研究中這個時間點的CHX10陽性細(xì)胞應(yīng)該主要為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，這一結(jié)果表明，此時視網(wǎng)膜樣組織雖有了一定的三維結(jié)構(gòu)，但依然在發(fā)育中，成熟的視網(wǎng)膜組織還沒有形成。

總而言之，本研究成功地建立了一種簡單的、無血清誘導(dǎo)hESC定向分化為視網(wǎng)膜樣組織的系統(tǒng)，在研究過程中發(fā)現(xiàn)不同hESC系之間呈現(xiàn)不同的分化特性。此外，抑制Wnt信號通路可以有效地促進(jìn)視泡樣結(jié)構(gòu)的形成，盡管目前對Wnt信號通路如何調(diào)控視網(wǎng)膜細(xì)胞分化尚不清楚，還有待于進(jìn)一步研究，但本研究為進(jìn)一步完善hESCs定向分化體系奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Induction of 3D retina-like tissues from human embryonic stem cells

Song Jian1，3， Li Zongyi2，Xu Guotong2， Jin Ying1.1Key Laboratory of Stem Cell Biology， Institute of Health Sciences， Shanghai Institutes for Biological Sciences， Chinese Academy of Sciences/Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200031， China；2Department of Ophthalmology of Shanghai Tenth People' s Hospital， and Lab of Clinical Visual Science of Department of Regenerative Medicine and Tongji Eye Institute， Tongji University School of Medicine， Shanghai 200092， China；3University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China

s: Jin Ying， Email: yjin@sibs.ac.cn； Xu Guotong， Email: gtxu@#edu.cn

Objective To induce human embryonic stem cells（hESCs）to various types of human neural retina cells under a simple culture condition. Methods hESCs from different lines are dissociated into cell clumps and cultured in suspension using the differentiation medium supplemented with 1﹪ Matrigel. In the differentiation of hESCs from SHhES8 line， BMP4 inhibitor will beadded on Day 1 and its concentration will be diluted by medium change.The differentiated cells are identified by the expression of marker genes to determine the differentiation state. To facilitate the expression of the important eye field transcription factor（EFTF）like CHX10 in H9 hESCs during differentiation， the Wnt signaling pathway inhibitor IWR1e is added into the differentiation medium. Results 1. The expression levels of EFTFs were markedly upregulated on D4 and lasted up to D15 of differentiation for hESCs of H9 line（as compared to data of D0， on D4， SIX3 was upregulated to 720.1 ± 238.6， P = 0.039； SIX6 to 260.0 ± 132.5， P = 0.1222； PAX6 to 2661 ± 1353， P = 0.1208；LHX2 to 480.4 ± 27.56， P ＜ 0.0001； and RAX to 144.9 ± 35.61， P=0.0156）. Immunofluorescence staining results also show that differentiated cells express marker genes representing the early stage of retina. 2. The addition of Wnt signaling pathway inhibitor IWR1e at Day7 of differentiation in hESCs from H9 line could significantly facilitate the expression of CHX10， the percentage of aggregates with CHX10 positive cells increased to 86.6﹪ from baseline（P = 0.0002）. The finding indicates that the Wnt signaling pathway plays an important role in the differentiation of retinal cells. 3. After suspension culture of hESCs from SHhES8 line for 24 days， CHX10 positive optic vesicle-like structures could be observed. At day 83， different types of neural retina cells， include CRX positive photoreceptors or precursors， AP2α positive amacrine cells and ISLET1 positive ganglion cells，could be detected. Conclusion Great differences exist between hESCs from different lines in their response to the same differentiation induction； inhibition of the Wnt signaling pathway could promote CHX10 expression as well as differentiation and maturation of early stage retinal cells； using serum free suspension culture， hESCs could be induced to various types of neural retinal cells and could form neural retina- like tissue with the 3D structure.

Human； Embryonic stem cells； Cell differentiation； Retina

2016-04-05）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.03.003

國家自然科學(xué)基金（91419309，31171419），重大科學(xué)研究計劃（2013CB967501）

200031 上海，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院/上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所 中國科學(xué)院干細(xì)胞生物學(xué)重點實驗室1；200092 上海，同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院眼科 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院同濟(jì)眼科研究所和再生醫(yī)學(xué)系臨床視覺科學(xué)研究實驗室2；100049 北京，中國科學(xué)院大學(xué)3

金穎，Email：yjin@sibs.ac.cn；徐國彤，Email：gtxu@#edu.cn

宋健，李宗義，徐國彤.誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化形成具有三維結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜樣組織的方法研究［J/CD］.中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志：電子版， 2016， 6（2）：146-154.