陳文捷許赤

·論著·

抑制營(yíng)養(yǎng)缺乏自噬因子1表達(dá)對(duì)肝癌LM3細(xì)胞增殖的影響

陳文捷1許赤2

目的 探討以透明質(zhì)酸-聚乙烯亞胺/透明質(zhì)酸-聚乙二醇（HA-PEI/HA-PEG）作為基因載體傳遞NAF1-siRNA對(duì)人肝細(xì)胞LM3進(jìn)行增殖能力抑制的效果。方法 將納米復(fù)合物HA-PEI/HA-PEG與NAF1-siRNA復(fù)合，轉(zhuǎn)染LM3細(xì)胞建立HNS組，等量NAF1-siRNA轉(zhuǎn)染建立NSI組，另設(shè)未轉(zhuǎn)染對(duì)照對(duì)照組，等量HA-PEI/HA-PEG干預(yù)細(xì)胞建立HAH組。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞NAF1 mRNA的表達(dá)水平，采用Western blotting法檢測(cè)NAF1、cyclin D1蛋白表達(dá)。采用MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制效果。4組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果 以對(duì)照組NAF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為100﹪進(jìn)行檢測(cè)。HNS組NAF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（2.12±0.17）﹪，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 14.17，P = 0.04）。HNS組LM3細(xì)胞的NAF1蛋白和CyclinD1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.07±0.01、0.06±0.00，而對(duì)應(yīng)蛋白在對(duì)照組LM3細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.37±0.08、0.16±0.03，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 37.72，20.96，P = 0.01，0.03）。HNS組細(xì)胞測(cè)得的細(xì)胞增殖抑制率為（73.20±0.43）﹪，與對(duì)照組的（0.49±0.02）﹪相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 11.92，P = 0.01）。HNS組LM3細(xì)胞的平板克隆形成率（8.35±0.33）﹪明顯低于對(duì)照組的（23.61±0.10）﹪（t = 17.75，P = 0.00，0.02）。結(jié)論 納米復(fù)合物HA-PEI/HA-PEG可高效遞送NAF1-siRNA，對(duì)肝癌LM3細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，抑制NAF1表達(dá)，進(jìn)而通過降低Cyclin D1表達(dá)水平抑制肝癌細(xì)胞LM3的增殖。

納米技術(shù)； 基因； RNA，小分子干擾； 癌，肝細(xì)胞

肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，目前仍以肝切除和肝移植等手術(shù)治療手段為主，療效尚不能令人滿意，急需開發(fā)包括基因治療在內(nèi)的新型治療手段［1］。然而，如何將siRNA在內(nèi)的基因治療手段高效、準(zhǔn)確地導(dǎo)入肝癌細(xì)胞，克服其容易降解的缺點(diǎn)仍然是基因治療研究中的重要問題。目前利用納米基因載體技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞的高效基因治療和增殖抑制是研究的熱點(diǎn)［2-3］。聚醚酰亞胺（polyetherimide，PEI）為陽(yáng)離子納米基因載體，是目前最有效的基因載體之一，廣泛用于質(zhì)粒、寡聚核苷酸的傳輸。通過透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）對(duì)其進(jìn)行改性可以進(jìn)一步增強(qiáng)PEI的腫瘤細(xì)胞傳輸性能［4-5］。近年的研究發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)缺乏自噬因子1（nutrient-deprivation autophagy factor-1，NAF1）是一種屬于NEET家族的細(xì)胞能量代謝調(diào)控蛋白，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起明顯的促進(jìn)作用，有望成為包括肝癌等多種惡性腫瘤良好的基因治療靶點(diǎn)［6］。本研究采用透明質(zhì)酸-聚乙烯亞胺/透明質(zhì)酸-聚乙二醇（HA-poly（ethyleneimine）/ HA-poly（ethylene glycol），HA-PEI/HA-PEG）納米復(fù)合物載體負(fù)載NAF1-siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌LM3細(xì)胞，觀察其促進(jìn)siRNA轉(zhuǎn)染的能力及對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的抑制效果。

材料與方法

一、材料

1.細(xì)胞株：肝細(xì)胞癌LM3細(xì)胞株由本院疫苗研究所實(shí)驗(yàn)室凍存。

2.主要試劑：HA-PEI/HA-PEG納米基因載體復(fù)合物轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自廣州愛科生物技術(shù)有限公司。NAF1小干擾RNA（NAF1-siRNA）、RT-PCR引物由廣州亞科生物科技有限公司合成。DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰酶、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。兔抗人NAF1、Cyclin D1（細(xì)胞周期素D1）、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

3.主要儀器：LightCycler?2.0實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

二、方法

1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：肝細(xì)胞癌LM3細(xì)胞以含有10﹪FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為含有5﹪CO2和飽和濕度的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。嚴(yán)格遵照HA-PEI/HA-PEG納米載體使用說明書使NAF1-siRNA與HA-PEI/HA-PEG復(fù)合。準(zhǔn)備好納米復(fù)合物后，培養(yǎng)細(xì)胞至70﹪ ～ 80﹪融合度時(shí)，使用siRNA終濃度為53 nmol/L的納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，建立HA-PEI/HA-PEG-NAF1-siRNA（HNS）組。采用等量未復(fù)合載體的NAF1-siRNA轉(zhuǎn)染LM3細(xì)胞，建立NAF1-siRNA（NSI）組。采用等體積PBS干預(yù)細(xì)胞設(shè)立未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，采用等量不含RNA的HA-PEI/HA-PEG干預(yù)細(xì)胞設(shè)立單純載體對(duì)照HAH組。

2.熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NAF1表達(dá)：3組LM3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2 d。分別按照常規(guī)方法提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的單鏈DNA。以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR引物序列分別為：NAF1上游引物5'- AAGTATAATC GAACAAGAGAGTT-3'，NAF1下游引物5'-CAC AGTTAGTTTACACGAATC-3'；β-actin上游引物5'-ACAATCATGTGAGAACTTGGC-3'，下游引物5'-TGATTTGATCAACGCTAGCA -3'。PCR反應(yīng)條件：92℃預(yù)變性5 min，92℃變性23 s，51℃退火32 s，70℃熒光檢測(cè)7 s，63個(gè)循環(huán)后，68℃延伸6 min。測(cè)得的數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法計(jì)算各組的相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3. Western blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá)：3組LM3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2 d，分別提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行蛋白分離。聚偏二氟乙烯膜電轉(zhuǎn)移后，封閉2 h，加入NAF1、Cyclin D1和β-actin一抗抗體，恒溫過夜后洗滌，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗抗體。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色，膠片曝光檢查蛋白表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4. MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率：取轉(zhuǎn)染后的3組肝癌細(xì)胞，1×104/孔接種于96孔板。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，嚴(yán)格按照試劑說明書操作加入MTT試劑，二甲亞砜溶解，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度（A）值。根據(jù)如下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率﹪=（對(duì)照組細(xì)胞A-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞A）/對(duì)照組細(xì)胞A×100﹪。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力：取轉(zhuǎn)染后的3組肝癌細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，分別以400個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，慢速均勻晃動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞懸液均勻分布于孔板中。同細(xì)胞轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)條件，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8 d。多聚甲醛固定細(xì)胞。用濃度為1﹪的結(jié)晶紫進(jìn)行細(xì)胞染色。設(shè)定細(xì)胞數(shù)大于25個(gè)的克隆為1個(gè)有效克隆，在光鏡下觀察計(jì)數(shù)每孔的有效細(xì)胞克隆數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。mRNA的表達(dá)量、蛋白表達(dá)量、增殖抑制率、克隆形成能力數(shù)據(jù)以± s表示，HNS、NSI、Ctrl、HAH 4組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，兩兩數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)。以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組LM3細(xì)胞NAF1 mRNA的表達(dá)量

以對(duì)照組NAF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為100﹪進(jìn)行檢測(cè)。HNS組NAF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（2.12 ± 0.17）﹪，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 14.17，P = 0.00）。而NSI組NAF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（106.83 ± 1.85）﹪，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 1.48，P = 0.29）。HAH組NAF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（103.35 ± 0.32）﹪，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 2.00，P = 0.36）。說明包含了NAF1-siRNA的納米復(fù)合物實(shí)現(xiàn)了對(duì)LM3細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)染，實(shí)現(xiàn)了對(duì)NAF1-siRNA的高效輸送，進(jìn)而降低了NAF1 mRNA的水平（表1）。

表1 四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中LM3細(xì)胞各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)的比較（n = 3，x± s）

二、Western blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá)

HNS組LM3細(xì)胞的NAF1蛋白和CyclinD1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.07 ± 0.01、0.06 ± 0.00，而對(duì)應(yīng)蛋白在對(duì)照組LM3細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.37 ± 0.08、0.16 ± 0.03，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 37.72，20.96，P = 0.01，0.00）。NSI組細(xì)胞中NAF1蛋白和Cyclin D1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.36 ± 0.07、0.19 ± 0.05，與對(duì)照組對(duì)應(yīng)蛋白的表達(dá)量相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 1.67，0.95，P = 0.47，0.61）。HAH組細(xì)胞中NAF1蛋白和Cyclin D1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.39 ± 0.05、0.16 ± 0.02，與對(duì)照組對(duì)應(yīng)蛋白的表達(dá)量相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 1.41，2.20，P = 0.22，0.39）。

三、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

HNS組細(xì)胞測(cè)得的細(xì)胞增殖抑制率為（73.20 ± 0.43）﹪，與對(duì)照組的（0.49 ± 0.02）﹪相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 11.92，P = 0.01）。而NSI組的（0.48 ± 0.08）﹪與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t = 0.22，P = 0.33）。而HAH組的（0.45 ± 0.06）﹪與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 0.29，P = 0.41）。說明HA-PEI/HA-PEG-NAF1-siRNA納米復(fù)合物實(shí)現(xiàn)了對(duì)LM3細(xì)胞增殖能力的有效抑制。

四、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力

如圖1所示，HNS組LM3細(xì)胞的平板克隆形成率（8.35 ± 0.33）﹪明顯低于對(duì)照組的（23.61 ± 0.10）﹪（t = 17.75，P = 0.01）。而NSI組的平板克隆形成率（24.73 ± 0.24）﹪與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 0.96，P = 0.08）。HAH組的平板克隆形成率（22.13 ± 0.62）﹪與對(duì)照組無(wú)明顯差異（t = 0.76，P = 0.36）。

圖1 觀察比較四組LM3細(xì)胞克隆形成能力 （結(jié)晶紫染色）

討 論

本研究采用的HA-PEI/HA-PEG納米載體屬于陽(yáng)離子聚合物的一種，是一種多氨基聚合物，該聚合物溶于水中后，氨基發(fā)生質(zhì)子化，使整個(gè)納米載體帶正電荷［7-8］。帶正電荷的納米載體與帶負(fù)電荷的核酸片段通過靜電作用進(jìn)行結(jié)合，保護(hù)所攜帶的基因在遞送過程中不被降解，同時(shí)，HA-PEI/HA-PEGNAF1-siRNA復(fù)合物表面帶有的正電荷，與帶負(fù)電的細(xì)胞膜接觸后可以促進(jìn)細(xì)胞的內(nèi)吞作用，高效遞送siRNA進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行基因治療［9］。

NAF1在包括肝癌在內(nèi)的很多消化道惡性病變中異常高表達(dá)，有可能成為肝癌診斷和基因治療的良好靶標(biāo)［10］。本課題驗(yàn)證了通過納米基因載體復(fù)合物HA-PEI/HA-PEG攜帶靶向NAF1基因的NAF1-siRNA，可以在肝癌細(xì)胞LM3中有效沉默NAF1基因，抑制NAF1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而高效抑制LM3細(xì)胞的增殖。本研究的結(jié)果顯示，HA-PEI/HA-PEG負(fù)載NAF1-siRNA后，可實(shí)現(xiàn)對(duì)人肝癌LM3細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)染，HNS組NAF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的2.12﹪左右，NAF1蛋白的表達(dá)量也明顯下降。本研究進(jìn)一步利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了沉默NAF1表達(dá)后對(duì)LM3細(xì)胞增殖能力影響，發(fā)現(xiàn)HNS組細(xì)胞在納米復(fù)合物的作用下，增殖能力明顯降低，而單純siRNA治療不能起到抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。同樣，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)也證明，經(jīng)過納米復(fù)合物處理的HNS組細(xì)胞克隆形成數(shù)量和克隆形成率均明顯降低。本研究通過進(jìn)一步測(cè)定細(xì)胞中Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)了NAF1-siRNA抑制肝癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。Cyclin D1是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白［11-14］。Cyclin D1主要干預(yù)細(xì)胞的G1期，它的表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞周期有很大影響［15-17］。在進(jìn)行納米復(fù)合物的基因治療后，Cyclin D1蛋白表達(dá)水平發(fā)生明顯下降，表明HA-PEI/HA-PEG負(fù)載的NAF1-siRNA能有效降低LM3細(xì)胞中的NAF1 mRNA水平，進(jìn)而降低NAF1蛋白表達(dá)水平，之后可能通過影響Cyclin D1表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制。

總之，納米復(fù)合物HA-PEI/HA-PEG可高效遞送NAF1-siRNA，對(duì)肝癌LM3細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，抑制NAF1表達(dá)，進(jìn)而通過降低Cyclin D1表達(dá)水平抑制肝癌細(xì)胞LM3的增殖。通過進(jìn)一步的深入研究，有望實(shí)現(xiàn)納米復(fù)合物HA-PEI/HA-PEG負(fù)載的肝癌高效基因治療，提高肝癌治療的整體療效。

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Via nano particles gene delivery technology inhibits expression of NAF1 to influence proliferation of hepatocellular carcinoma LM3 cell

Chen Wenjie1， Xu Chi2.1Biotherapy Center，2Department of HepaticSurgery， the Third Affiliated Hospital， Sun Yat-Sen University， Guangzhou 510630， China

Chen Wenjie， Email:chenwenjie168@126.com

Objective To investigate the effect of HA-poly（ethyleneimine）/HA-poly（ethylene glycol）（HA-PEI / HA-PEG）as a gene transfer vector effect NAF1-siRNA in human hepatocytes were LM3 proliferation inhibition. Methods The nano-composite HA-PEI / HA-PEG and NAF1-siRNA complexes， cells transfected LM3 establish HNS group， the same amount of NAF1-siRNA transfected establish NSI group， with another Ctrl untransfected control group and the same amount of HA-PEI/HA-PEG transfected establish HAH group. Expression using quantitative realtime PCR to detect cell NAF1 mRNA level， using Western blotting assay NAF1， cyclin D1 protein expression. Using MTT assay and colony formation assay to detect inhibition of cell proliferation effect. 4 groups were compared using ANOVA， pairwise comparisons using t test. Results In the relative expression of Ctrl group NAF1 mRNA were detected as 100﹪. Relatively HNS group NAF1 mRNA expression was（2.12±0.17）﹪， compared with the Ctrl group， a statisticallysignificant difference（t = 14.17， P = 0.04）. NAF1 protein and the relative expression of CyclinD1 protein HNS group LM3 cells were 0.07±0.01， 0.06±0.00， and the relative expression of the corresponding protein in the Ctrl group LM3 cells were 0.37±0.08， 0.16±0.03， the difference was statistics significance（t = 37.72， 20.96， P = 0.01， 0.03）. HNS cells measured by cell proliferation inhibition rate（73.20±0.43）﹪， with the Ctrl group（0.49±0.02）﹪ compared to a statistically significant difference（t = 11.92， P = 0.01）. HNS Group LM3 cell colony formation rate（8.35± 0.33）﹪was significantly lower than that（23.61±0.10）﹪ Ctrl group（t = 17.75， P = 0.00， 0.02）. Conclusion Nanocomposite HA-PEI / HA-PEG can efficiently deliver NAF1-siRNA， hepatoma cells were transfected LM3， inhibition NAF1 expression， thereby reducing the expression of Cyclin D1 levels through inhibition LM3 proliferation of liver cancer cells.

Nanotechnology； Genes； RNA，Small Interfering； Carcinoma，Hepatocellular

2015-12-16）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.03.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（81301331，81302550）；教育部高等學(xué)校博士點(diǎn)專項(xiàng)科研基金新教師類資助課題（20110171120091）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B080701063）

510630 廣州中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生物治療中心1，肝臟外科2

陳文捷，Email：chenwenjie168@126.com

陳文捷， 許赤. 抑制營(yíng)養(yǎng)缺乏自噬因子1表達(dá)對(duì)肝癌LM3細(xì)胞增殖的影響［J/CD］.中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志：電子版， 2016，6（3）：141-145.