易寰王萱鐘秀風彭福華

·綜述·

誘導多能干細胞向運動神經(jīng)元分化的研究進展

易寰1王萱1鐘秀風2彭福華1

誘導多能干細胞（iPSC）是通過向已分化成熟的成體細胞轉染外源特定的基因重編程而得到的一種類似于胚胎干細胞（ESC）的多潛能干細胞。iPSC克服了ESC臨床應用中帶來的免疫排斥及倫理問題而具有重要的臨床應用價值。iPSC在適當條件下可以實現(xiàn)神經(jīng)分化，其體外定向分化為運動神經(jīng)元的研究取得了一定進展。本文就運動神經(jīng)元的發(fā)育、iPSC向運動神經(jīng)元誘導分化條件、運動神經(jīng)元鑒定，臨床應用及還存在的問題予以綜述。

多能干細胞； 運動神經(jīng)元； 細胞分化

誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是通過基因轉染技術將某些轉錄因子導入動物或人的體細胞，使已分化的體細胞重編程為類似于胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）的多潛能細胞。2006年，Yamanaka和Takahashi的研究團隊［1］在逆轉錄病毒的介導下將轉化因子octamer3/4（oct3/4）、SRY box-containing gene2（Sox2）、c-Myc、Kruppel-like（Klf4）的基因組合導入小鼠胚胎纖維母細胞（mouse embryo fibroblast，MEF）中，并成功獲得小鼠iPSC。2007年，他們又將完全相同的人類轉化因子組合導入人類真皮成纖維細胞，實現(xiàn)了人類細胞的重編程［2］。iPSC不僅具備多種分化潛能，并且繞開了人類ESC研究中備受爭議的倫理問題。同時，從患者特異的自體細胞轉化而來的iPSC又可以有效解決移植過程中的免疫排斥問題。種種優(yōu)點使iPSC在疾病建模、機制研究、藥物篩選和替代醫(yī)學等方面展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢［3］。

近年來研究表明，在適當?shù)臈l件下iPSC可以實現(xiàn)神經(jīng)分化［4］，其定向分化為運動神經(jīng)元（motor neuron，MN）為治療和研究MN損傷疾病例如肌萎縮側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、脊髓肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）等提供了可能性。ALS是運動神經(jīng)元病（motor neuron disease，MND）最常見的一種，是一組病因未明的選擇性侵犯脊髓前腳、腦干、皮質MN的進行性神經(jīng)變性疾病，以上、下MN損害為最主要的臨床特征，目前尚無有效治療方式。SMA是一種因SMN1基因突變導致的常染色體隱性遺傳病，主要表現(xiàn)為MN退化、肌萎縮，肌無力，最終多死于呼吸衰竭。本文就iPSC向MN分化的研究進展及其對于MN相關疾病的治療前景綜述如下。

一、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生及MN發(fā)育過程

在胚胎發(fā)育過程中，胚盤逐漸形成內、中、外三胚層結構，神經(jīng)分化開始于神經(jīng)外胚層形成時，神經(jīng)外胚層首先形成盤狀結構稱為神經(jīng)盤，神經(jīng)干細胞位于其中。后神經(jīng)盤兩側向上卷起于中線融合，形成管樣結構稱為神經(jīng)管。神經(jīng)管內細胞即為神經(jīng)前體細胞（neural precursor cells，NPC），它們先后經(jīng)歷了前后軸（rostrocaudal axis）、內外軸（mediolateral axis）、背腹軸（dorsoventral axis）神經(jīng)誘導（見圖1），最后分化為區(qū)域化的神經(jīng)元［5］。其中，MN位于脊髓前角，其發(fā)生發(fā)育先涉及神經(jīng)化（neuralization）、隨后為形成脊髓神經(jīng)元而非大腦神經(jīng)元需實現(xiàn)尾端化（caudalization）、最后為背腹軸的腹側化（ventralization）［6］（圖2）。體外誘導MN也是通過上述三步，神經(jīng)化主要通過抑制骨形成發(fā)生蛋白（bone morphogen protein，BMP）和生長轉化因子（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路來實現(xiàn)［7］，既往多用Noggin抑制BMP和TGF-β通路，現(xiàn)也有人用LDN193189、SB431542實現(xiàn)［8］。尾端化主要由RA（retinoic acid）調控，另外Wnt和FGF通路也促進神經(jīng)元尾端化［9-10］。而同時Wnt和FGF通路也促進神經(jīng)元背側化，在脊髓發(fā)育中表現(xiàn)為中間神經(jīng)元（interneurons）的形成，而非MN，故主要介導腹側化的音猥因子（sonic hedgehog homolog，Shh）信號通路在MN的形成中顯得尤為重要［11］。

圖1 神經(jīng)軸向發(fā)育示意

二、iPSC體外分化為MN

（一）iPSC的建立及其向NPC分化

人類和鼠類iPSC的建立及神經(jīng)分化大致經(jīng)歷以下幾個階段：用攜帶oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4的慢病毒感染成體細胞（如人皮膚成纖維細胞、MEF）；病毒感染后出現(xiàn)ESC細胞樣克隆，表明成體細胞已經(jīng)被重編程；挑選具有典型ESC細胞樣克隆傳代培養(yǎng)并進行AP染色和多潛能性分析，發(fā)現(xiàn)其可維持ESC細胞的生物學特性。以上標志成功建立了iPSC細胞系［2］。有報道證明iPSC的生物特性與ESC細胞極為相似［3］。

圖2 胚胎發(fā)育流程

在諸多誘導方案中（表1），多能干細胞（pluripotent stem cell）向神經(jīng)干細胞分化主要通過形成擬胚體（embryoidbody，EB）和神經(jīng)玫瑰花樣結構（neural rosette）兩種方式實現(xiàn)。擬胚體即細胞在體外模擬胚胎而形成的結構，為iPSC在低吸附培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)形成的細胞球結構，EB培養(yǎng)基多為不添加bFGF的干細胞培養(yǎng)基，為促進其向神經(jīng)分化，后期換為神經(jīng)分化培養(yǎng)基，輔助以BMP、TGF-β抑制因子，同時也有實驗方案加入一些其他小分子，如Y27632促進細胞成團［12］，F(xiàn)GF促進細胞生長。EB形成后接種至Laminin/poly-L-lysine或matrigel包被的培養(yǎng)板繼續(xù)分化。neural rosette是由iPSC消化后直接接種至包被的培養(yǎng)板上形成的具有分化為多種神經(jīng)細胞潛能的結構，因形似玫瑰花而命此名。培養(yǎng)基多為神經(jīng)分化培養(yǎng)基輔以B27、N2等。同樣，培養(yǎng)基中可加入BMP、TGF-β通路抑制劑促進細胞向神經(jīng)分化。由此得到的EB或neural rosette內的細胞即為NPC，表達SOX1、Nestin等泛神經(jīng)化的標志物［8，13-14］。

表1 多能干細胞向神經(jīng)前體細胞分化概況

圖 3 干細胞逐步誘導為運動神經(jīng)元的模式

（二）NPC定向分化為MN

上述NPC形成后，向培養(yǎng)基中添加不同誘導因子可以促其進一步分化得到特定神經(jīng)功能細胞。如前所述，促進已神經(jīng)化的干細胞向MN分化主要依賴RA的尾端化和SHH的腹側化。NPC在RA作用下傾向于分化為脊髓祖細胞，接著SHH使脊髓祖細胞進一步分化為表達Olig2的腹側MN前體。2002年Wichterie等［6］聯(lián)合應用RA和SHH已成功地將ESC誘導為MN。Karumbayaram等［15］報道應用RA和SHH，同樣將hiPSC分化為MN，其分化效率與ESC相似。但是，有研究指出，僅應用RA和SHH卻很難促進iPSC向MN轉化［16］，應用SHH的同時需要抑制acticin/ nodal信號通路才可以有效促進MN形成［19］。雖然各實驗方案所加細胞因子各異，但普遍都應用SHH/purmorphamine和RA，再輔以其他BDNF、GDNF、IGF、cAMP等營養(yǎng)因子實現(xiàn)體外MN誘導［6，8，13-14］（圖3）。國內也已有人通過這種方法成功在體外將iPSC誘導形成MN［20］。各實驗方案所用劑量各異，RA從1 nmonl/L ～ 1 μmonl/L不等，Shh從50 ～ 500 ng/ml不等［21］。但近期Calder等［22］報道，早期神經(jīng)化過程中應用模式分子（patterning molecules）處理的干細胞，在向MN分化過程中不加入Shh/purmorphamine也可成功誘導分化成MN，且分化效率同RA+Shh方案。

除了應用動物和正常人來源的iPSC，也有學者將從ALS患者身上獲得的成纖維細胞重編程為iPSC，并將其誘導分化為EB，在特定神經(jīng)誘導培養(yǎng)基作用下進一步分化為MN［23-25］。這為建立體外ALS模型、研究ALS致病機制、干細胞移植治療提供了基礎和依據(jù)。

三、MN的鑒定標志

在MN發(fā)育過程中會表達多種標志物，體外分化過程中也利用這些標志物顯示分化效率。當干細胞向神經(jīng)分化即形成神經(jīng)干細胞，會表達諸多神經(jīng)標志物，常用于檢測的有：SOX1、SOX2、Nestin等。當加入RA及Shh調控神經(jīng)干細胞向MN前體細胞（motor neuron progenitors，MNP）分化時，會表達PAX6、Nkx6、olig2、Islt1，其中PAX6和Nkx6在脊髓中間神經(jīng)元前體細胞也會表達，而Olig2和Islt1則只在MNP中表達［26］，同時該階段的神經(jīng)細胞也會開始表達β-Tublin、MAP2等泛神經(jīng)標志物［27］。隨著MNP向MN分化，細胞會表達HB9、SMI-32，表達HB9意味著細胞進入有絲分裂后（post-mitotic）階段，此階段細胞不再增殖，只能向著成熟MN分化［6］。成熟的MN會表達ChAT、VACHT、CHT1等膽堿能標志物［6，8］，其中膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）是催化乙酰膽堿合成的酶，ChAT的活性變化可以直接影響乙酰膽堿的合成，故認為是較重要的MN標志物，大多數(shù)體外分化方案都以其作為成熟MN的標志物［13，16］。MN如果與肌肉細胞共培養(yǎng)，形成突觸，則會表達SV2、Synaptophysin等突觸標志物，并誘導肌肉表達乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AchR），該受體可用α-bungarotoxin標記［28］。利用這些標志物，在體外分化MN時，可在各階段行免疫熒光染色以證明。

四、MN的功能檢測

定向分化而來的MN鑒定除了上述檢測特異性分子標志以外，仍需要進行運動功能的檢測。功能檢測包括體外功能檢測及移植入體內后的功能檢測。

1.分化MN體外功能檢測：干細胞在體外誘導成MN，除了通過標志物證實，還需要利用膜片鉗證明其如正常神經(jīng)細胞有電生理活動。2004年，Miles等［29］將ESC源的MN和C2C12肌小管共培養(yǎng)形成神經(jīng)肌肉接頭后用膜片鉗測試到MN能產生動作電位，且分別加入谷氨酸、河豚毒素后檢測到興奮后的或抑制后的電位。2015年，Jeremy等［30］用iPSC源的MN和雞的肌纖維共培養(yǎng)形成神經(jīng)肌肉接頭，通過膜片鉗檢測到類似結果。對MN進行電生理檢測已經(jīng)成為體外誘導分化MN常用的功能學檢測手段。

2.分化MN移植到動物體后功能檢測：2002年，Wichterie等［6］首次將ESC分化至MN的同時即將HB9陽性的MN植入到MN發(fā)育期的雞胚細胞中，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)植入的MN可以長出突起，并與肌肉聯(lián)系。Harper等［31］將ESC分化而來的MN植入MN損傷的成年大鼠的脊髓中，觀察到植入的MN可以向白質中長出突起。依據(jù)ESC早期的研究基礎，2013年Amoroso等［8］將iPSC來源的MN移植入雞胚中，并觀察到移植的細胞存活。以上研究證明將MN植入處于發(fā)育期或者成體脊髓中，MN可以與肌肉建立聯(lián)系，也說明體外分化MN在很大程度上同動物體內MN類似。這些嘗試為干細胞移植治療MN疾病提供了實驗依據(jù)。

五、患者體細胞來源iPSC基因修飾及相關疾病治療前景

有學者證實iPSC來源的MN移植入體內不僅可以存活，也能用于治療MN相關疾病，改善預后［32］。ALS的患者中10﹪的屬家族性，而SMA則為常染色體隱性遺傳病。故理論上，將針對某種遺傳病進行基因修飾的iPSC分化為MN，再移植入有該遺傳缺陷的患者體內，能夠治療疾病。2012年就有學者將SMA患者的皮膚細胞重編程為iPSC，并向對該iPSC進行基因修飾，使得SMN1表達量上調。分別將正常體細胞來源的iPSC（WT-iPSC）、SMA患者來源的iPSC（SMA-iPSC）、基因修飾的iPSC（TR-iPSC）在體外分化為MN，并移植入SMA疾病模型小鼠體內，證明移植TR-iPSC來源的MN的小鼠中位生存期與移植WT-iPSC來源的MN類似（21 d），但移植SMA-iPSC來源MN的小鼠中位生存期則更短（19 d），未移植的SMA小鼠生存期最短（13 d）［18］。同樣，也有學者將ALS患者體細胞重編程為iPSC，經(jīng)過SOD基因修飾后SOD的表達量上調，結果證實，ALS來源且未經(jīng)基因修飾的MN易神經(jīng)絲纏結、軸突退行性變、神經(jīng)興奮性高，而經(jīng)過SOD基因修飾的MN則不易有上述表現(xiàn)，這與ALS患者的病理及神經(jīng)電生理表現(xiàn)一致［33］。這些都說明，應用iPSC來源的MN移植入體內不僅可以存活，也能用于治療MN相關疾病，而針對不同疾病的突變基因進行基因修飾的iPSC則是治療遺傳類MN疾病的更好選擇。

六、存在的問題與展望

從2002年Wichterie首次利用ESC分化為MN，體外利用干細胞向MN誘導分化已經(jīng)有十多年歷史，各國學者在分化時間、效率、干細胞來源等方面尋求突破，分化時間從早期＞40 d縮短至最快14 d可成功誘導成MN［34］，且早期分化方案最終得到的MN純度大多在20﹪～ 40﹪［6，14］，但到2015年有學者使誘導效率達到90﹪［13］。這些進步為體外獲得的MN進行進一步研究和應用提供了便利。干細胞來源也從最初備受道德爭議的ESC拓展到iPSC，且諸多誘導方案應用ALS等患者的iPSC誘導成功［24-25］。這不僅為MND研究提供了體外模型，也為該病藥物篩選提供更可靠依據(jù)。

盡管多能干細胞向MN定向分化的研究取得了巨大進展，但仍有一些問題待解決。第一、MN的發(fā)生過程已有相當多的研究，但針對各種MN亞型的研究還非常有限。就脊髓前角處的MN而言，既有正中運動柱（median motor column，MMC）神經(jīng)元，也有外側運動柱（lateral motor column，LMC）神經(jīng)元，雖均為MN，但MMC處MN支配軀干肌，LMC處MN支配四肢肌。而MND患者肌肉萎縮常從某一類肌肉開始，故體外分化得到MN各亞型顯得頗為重要?，F(xiàn)階段雖然體外分化方案繁多，但多是通過神經(jīng)化、尾端化、腹側化實現(xiàn)，更為細化的MN亞型分化方案及分化機制仍需探索。近年，有學者發(fā)現(xiàn)FoxP1作為Hox輔助因子，能對各個MN種類進行調節(jié)進而決定MN多樣性［35］，后有學者利用FoxP1作為檢驗MN亞型的標志物并將干細胞高效分化為LMC處的MN［8］。這些為更加精準的分化提供理論基礎和實踐方案。第二、雖然現(xiàn)階段體外分化的MN可以與肌肉細胞產生突觸聯(lián)系，并檢測到電生理變化，但兩者形成的神經(jīng)肌肉接頭仍相當不成熟，無論是ESC來源還是iPSC來源的MN，其形成的神經(jīng)肌肉接頭不僅非常少而且形態(tài)各異［29-30，36］。如何讓干細胞來源的MN達到正常人體中MN功能水平，是制約干細胞移植治療MND的一大瓶頸。

自2006年iPSC技術建立后，近幾年iPSC的研究得到極大的發(fā)展，將iPSC誘導分化成功能性的MN將會對MND等疾病的治療、機制研究提供極大的臨床價值。但MN各亞型的形成與作用仍需要進一步研究，如何提高iPSC定向分化為MN的效率、純化MN并使其具有正常的生理功能是當前仍需研究的問題。

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Actuality of motor neurons differentiation from induced pluripotent stem cells

Yi Huan1， Wang Xuan1， Zhong Xiufeng2， Peng Fuhua1.1Multiple Sclerosis Center， Department of Neurology， The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University， Guangzhou， Guangdong 510630， China.2State Key Laboratory of Ophthalmology， Zhongshan Ophthalmic Center， Sun Yat-sen Univeristy， Guangzhou 510600， China

Peng Fuhua， Email: pfh93@163.com； Zhong Xiufeng， Email: zhongxf7@mail. sysu.edu.cn

Induced pluripoent stem cells （iPSCs）， derived from somatic cells by reprogramming with delivery of certain genes， can resemble the characteristics of embryonic stem cells （ESCs） to give rise to all the fully differentiated cells， even tissues. iPSCs avoid the immunological rejection and ethical issues when using ESCs in clinic. Under appropriate conditions，iPSCs can differentiate into nerve cells. At present， scientists have made much progress on the research of motor neurons differentiation from iPSCs. This paper is to summarize the motor neuron development in vivo， the research progress on the differentiation of iPSCs into motor neurons， the identification and function testing of hiPSC-derived motor neurons and the problems to be solved further.

Multipotent stem cells； Motor neurons； Cell differentiation

2016-04-26）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.03.008

國家自然科學基金（81570874）；廣州市科技計劃項目（1563000227）；廣東省自然科學基金（2015A03013167）；廣東省科技計劃項目（2014A020211008；2015A020212011）；中山大學 “百人計劃”（PT1001010）

510630 廣州，中山大學附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內科1；510600 廣州，中山大學中山眼科中心2

彭福華，Email：pfh93@163.com；鐘秀風，Email：zhongxf7@mail.sysu.edu.cn

易寰，王萱，鐘秀風，等.誘導多能干細胞向運動神經(jīng)元分化的研究進展［J/CD］.中華細胞與干細胞雜志：電子版， 2016，6（3）：179-183.