符青松 黃循斌

[摘要] 目的 探討腸道病毒71（EV71）型手足口?。℉FMD）患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性。 方法 選取2011年5月～2014年5月在深圳市龍崗中心醫(yī)院兒科住院的EV71型HFMD患兒150例，根據(jù)《手足口病診治指南（2013 年版）》分為普通組100例、重癥組50例，兩組患兒年齡均為2～5歲；選擇同年齡段的 90例健康兒童作為對(duì)照組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EV71型HFMD患兒病程第3天及對(duì)照組兒童外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+百分?jǐn)?shù)。重癥組患兒按手足口病診治指南規(guī)范治療5 d后再次檢測(cè)上述相關(guān)指標(biāo)，并與治療前進(jìn)行比較。 結(jié)果 重癥組外周血T細(xì)胞亞群 CD3+、CD4+、CD8+百分?jǐn)?shù)較對(duì)照組及普通組顯著降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），重癥組CD4+/CD8+比值低于普通組及對(duì)照組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；重癥組患兒經(jīng)過(guò)規(guī)范治療后外周血T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)上升，但與治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 EV71型HFMD患兒存在細(xì)胞免疫功能紊亂，外周血T細(xì)胞亞群水平變化可能與患兒病情嚴(yán)重程度存在一定程度的相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 腸道病毒71型；手足口病；T淋巴細(xì)胞亞群；細(xì)胞免疫

[中圖分類號(hào)] R725.622.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（a）-0113-04

Value of peripheral blood T lymphocyte subsets in condition judgment of HFMD

FU Qingsong1 HUANG Xunbin2

1.Department of Laboratory， Longgang Center Hospital of Shenzhen City， Guangdong Province， Shenzhen 518116， China； 2.Department of Pediatrics， Longgang Center Hospital of Shenzhen City， Guangdong Province， Shenzhen 518116， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the peripheral blood lymphocyte subsets and the severity of the disease in children with enterovirus 71-induced hand， foot and mouth disease （HFMD）. Methods one hundred and fifty cases of enterovirus 71-induced HFMD children from May 2011 to May 2014 in Longgang Center Hospital of Shenzhen City were selected， they were divided into common group （100 cases）， severe group （50 cases） according to Hand Foot Mouth Disease Diagnosis and Treatment Guidelines （2013 Edition）， age of children in two groups was 2-5 years old， 90 healthy children with the same age were selected as the control group. Flow cytometry was used to detect the T cell subsets CD8+， CD4+ and CD3+ in the peripheral blood of children with enterovirus 71-induced HFMD in the third days and control group. The related indexes were detected again after 5 days of treatment in the severe group， they were compared with before treatment. Results The CD8+， CD4+ and CD3+ of T cells in severe group were significantly lower than the common group and the control group， the differences were statistically significant （P < 0.01）； the ratio of CD4+/CD8+ in severe group was lower than the common group and control group， the difference was statistically significant （P < 0.01）； the peripheral blood T lymphocyte subsets of the severe group after standard treatment was significantly decreased， but there was no obvious difference compared with before treatment （P > 0.05）. Conclusion There are some cellular immune function disorders in children with enterovirus 71-induced HFMD. The changes of T cell subsets in peripheral blood are correlated with the severity of the disease.

[Key words] Enterovirus 71； Hand， foot and mouth disease； T lymphocyte subsets； Cellular immunity

手足口?。℉and，foot and mouth disease，HFMD）是由多種腸道病毒引起的急性傳染病，具有傳播迅速、傳染性強(qiáng)等特點(diǎn)，引起該病的腸道病毒約有20種，但是其中以柯薩奇病毒A組16型（CoxA16）、腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）為最常見病原體[1-2]，其中EV71具有嗜神經(jīng)性，感染后易并發(fā)無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫、循環(huán)衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，其病死率相對(duì)較高，幸存者常留有嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[3]。自1997年來(lái)，EV71感染的手足口病在全球范圍流行暴發(fā)，其中以亞太地區(qū)尤為嚴(yán)重，已造成數(shù)百萬(wàn)人致病，并已造成數(shù)百例患者死亡。2008年，我國(guó)已報(bào)道488 955例該病患者，其中126例病例為死亡病例，并且統(tǒng)計(jì)顯示，主要的致病原便是EV71，因此，EV71感染已成為一個(gè)公眾的健康問(wèn)題并引起人們關(guān)注[4-6]。但是到目前為止，EV71感染的發(fā)病機(jī)制并不清楚，并且本病目前無(wú)特效的治療方法，因此，深入研究其發(fā)病機(jī)制對(duì)于早期防治本病及評(píng)估預(yù)后具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T細(xì)胞亞群 CD3+、CD4+、CD8+百分?jǐn)?shù)，探討其與EV71型HFMD病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年5月～2014年5月深圳市龍崗中心醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）兒科住院的HFMD患兒150例為研究組，根據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部頒發(fā)的《手足口病診治指南（2013 年版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)分為兩組，其中100例患兒無(wú)合并癥，作為普通組，男55例、女45例，年齡2～5歲，平均（2.2±1.7）歲；50例患兒出現(xiàn)并發(fā)癥，作為重癥組，男29例、女21例，年齡2～5歲，平均（2.6±1.2）歲。對(duì)照組：為我院兒?？普ｓw檢兒90例，男56例、女34例，年齡2～5歲，平均（2.8±0.5）歲。各組性別、年齡、體重比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究取得了研究對(duì)象監(jiān)護(hù)人的知情同意，研究方案獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①診斷符合國(guó)家衛(wèi)計(jì)委頒發(fā)的《手足口病診治指南（2013 年版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)，2011年5月～2014年5月于我院兒科住院的HFMD患兒；②咽拭子標(biāo)本利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)確定病原為EV71或大便病毒檢查明確病原為EV71的患兒；③肝腎功能均正常的患兒；④乙肝和丙肝病毒血清指標(biāo)顯示陰性的患兒。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①合并其他病毒感染性疾病的患兒；②就診時(shí)病程≥3 d的患兒；③正在使用糖皮質(zhì)激素或細(xì)胞毒性藥物治療的患兒。④有免疫抑制劑和激素使用史的患兒；⑤有腫瘤、自身免疫疾病、免疫缺陷疾病的患兒；⑥有家族性疾病史及傳染病史的患兒。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

對(duì)各組研究對(duì)象T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，并分析其與HFMD發(fā)病的關(guān)系。

EV71型HFMD患兒病程第3天及對(duì)照組兒童清晨空腹抽取靜脈血2 mL，緩慢注入含有EDTA抗凝管中。管中依次加入3種抗體10 μL，室溫避光孵育25 min，每管加入200 μL溶血素，輕輕吹打，在室溫下避光靜置15 min，裂解紅細(xì)胞，觀察溶液澄清透明后，加入預(yù)冷PBS液1 mL，室溫下分離血清（3000 r/min離心10 min），去上清，加入1 mL PBS液搖勻，滴加1%多聚甲醛液100 μL固定，采用美國(guó)BD公司的FACS Calibur 四色流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并用SimulSet軟件自動(dòng)分析結(jié)果，分別得出CD3+、CD4+、CD8+在外周血中的百分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+細(xì)胞的比值。

重癥組患兒按手足口病診治指南規(guī)范治療5 d后再次檢測(cè)上述相關(guān)指標(biāo)，采血保存及測(cè)定方法同上。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)文中所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血T細(xì)胞亞群的變化

EV71型HFMD重癥組T細(xì)胞亞群 CD3+、CD4+、CD8+百分?jǐn)?shù)均低于普通組和正常對(duì)照組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；普通組T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+百分?jǐn)?shù)分別低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而普通組CD8+T 細(xì)胞與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；重癥組CD4+/CD8+比值低于普通組及對(duì)照組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），普通組及對(duì)照組CD4+/CD8+比值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

表1 各組外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較（x±s）

注：與普通組比較，*P < 0.01；與對(duì)照組比較，△P < 0.05，#P < 0.01

2.2 HFMD重癥組治療前后外周血T細(xì)胞亞群的變化

HFMD重癥組患兒治療后CD3+、CD4+、CD8+百分?jǐn)?shù)上升，但與治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），且組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；而CD4+/CD8+明顯升高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

表2 手足口病重癥組治療前后外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較（x±s）

3 討論

手足口病是嬰幼兒中常見的一種傳染性疾病，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、手、足和口腔等部位出現(xiàn)皮疹和潰瘍，個(gè)別嚴(yán)重的患者還可出現(xiàn)肺水腫、心肌炎和無(wú)菌性腦膜炎等危及生命的并發(fā)癥，引起該病的主要原因是腸道病毒，可引起手足口病的腸道病毒有20來(lái)種，但以CVA16和EV71為主要病原體。其中EV71感染已經(jīng)在包括中國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行[7-8]，比如2008年在中國(guó)報(bào)道的4 888 955例手足口病病例，其中還包括126例死亡患者病例中，EV71也是最主要的致病菌，因此，EV71感染已成為目前一個(gè)重要的公共健康問(wèn)題。并且，近年來(lái)相關(guān)研究還表明EV71感染的HFMD在嬰幼兒中發(fā)病率較高，尤以3歲以下發(fā)病率最高，且易快速進(jìn)展為重癥病例。輕癥患者表現(xiàn)為自限性手足口病或者皰疹性咽喉炎，而重癥患者可出現(xiàn)肺出血、神經(jīng)源性肺水腫和腦干腦炎，甚至出現(xiàn)心肺功能衰竭等嚴(yán)重后果[9]。這是因?yàn)閶胗變旱拿庖吖δ艹Ｌ幱谏硇悦庖叩拖碌臓顟B(tài)，因此，嬰幼兒發(fā)病率較高，且易進(jìn)展為重癥型手足口病[10]。EV71感染的發(fā)病機(jī)制至今尚無(wú)明確報(bào)道，但有相關(guān)研究表明，機(jī)體內(nèi)的某些炎癥因子會(huì)在EV71感染后表達(dá)水平升高，比如IFN-r、Th2、IL-6、IL-8等，并且這些炎癥因子表達(dá)水平的變化與疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后具有相關(guān)性[11]，通過(guò)對(duì)細(xì)胞免疫完整的小鼠進(jìn)行研究也發(fā)現(xiàn)，在感染了EV71后，缺乏CD4+和CD8+ T細(xì)胞的小鼠更容易發(fā)展成為重癥病例，同樣的，通過(guò)建立新生小鼠EV71感染模型也發(fā)現(xiàn)，感染后IL-6持續(xù)升高會(huì)引起組織損傷[1]。所有的這些研究均說(shuō)明了EV71感染致病和發(fā)病過(guò)程中，細(xì)胞免疫具有至關(guān)重要的作用，并且目前已有研究表明，在免疫應(yīng)答過(guò)程中，T淋巴細(xì)胞有著至關(guān)重要的作用[11]。T淋巴細(xì)胞根據(jù)表型可分為多個(gè)亞群，包括CD4+、CD8+ 細(xì)胞亞群[12-14]，正常機(jī)體下，這兩個(gè)亞群的數(shù)量和CD4+/CD8+ 比值是保持穩(wěn)定和相互協(xié)調(diào)的，以維持機(jī)體正常的免疫應(yīng)答，其中。CD4+細(xì)胞主要發(fā)揮免疫輔助性細(xì)胞的作用，即促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫，而CD8+發(fā)揮細(xì)胞毒性細(xì)胞或抑制性細(xì)胞的作用，即抑制免疫反應(yīng)，因此，正常情況下CD4+/CD8+ 比值維持動(dòng)態(tài)平衡，從而使機(jī)體免疫功能穩(wěn)定，這也是機(jī)體免疫功能得以發(fā)揮的重要前提[15-16]。而當(dāng)嬰幼兒感染病毒時(shí)，T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量、比例發(fā)生異常，機(jī)體免疫功能將紊亂[17]，因此，檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后對(duì)于臨床的治療和病情的判斷具有重要意義。同時(shí)，不同T淋巴細(xì)胞亞群在EV71感染手足口病中發(fā)揮的不同作用也一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，例如有臨床研究表明，Th17細(xì)胞參與了EV71感染的病理過(guò)程，而CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞則與手足口病患者的預(yù)后有著密切關(guān)系[13]，然而，至今為止，尚無(wú)EV71感染手足口病患者T細(xì)胞亞群變化的系統(tǒng)分析，而且臨床目前也無(wú)治療EV71感染的理想的藥物或者防止感染的疫苗，因此，通過(guò)本次進(jìn)一步的研究，將對(duì)EV71感染的預(yù)防和治療有著指導(dǎo)作用。

1979年，Reinherz等[18]應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了多種抗人T淋巴細(xì)胞單克隆抗體，這使鑒定T淋巴細(xì)胞亞群有了最可靠的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，其下降則提示該機(jī)體免疫功能出現(xiàn)了降低。因此，為探討外周血淋巴細(xì)胞亞群變化在EV71型HFMD患兒中的臨床價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EV71型HFMD患兒外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+百分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示EV71型HFMD重癥組患兒外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+ 百分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+ 比值均低于普通組和對(duì)照組，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。柯江雄等[19]研究亦表明隨著病情的加重，CD3+、CD4+、CD8+ 百分?jǐn)?shù)不斷降低。本實(shí)驗(yàn)上述研究結(jié)果提示EV71型HFMD患兒普遍存在細(xì)胞免疫功能紊亂，其中重癥組細(xì)胞免疫功能紊亂更顯著。其機(jī)制可能是EV71急性感染后，人類主要組織相容性復(fù)合體（MHC-Ⅰ）類分子與CD8+ 分子結(jié)合，參與T淋巴細(xì)胞受體（TCR）/CD3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，啟動(dòng)MHC-Ⅰ類限制型T細(xì)胞應(yīng)答，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞活性增強(qiáng)并識(shí)別和殺傷病毒感染細(xì)胞，在疾病早期即可出現(xiàn)數(shù)量減少，隨著病情的進(jìn)展，可引起CD8+殺傷T細(xì)胞的不斷減少，不能有效地清除病毒感染的細(xì)胞，導(dǎo)致病情加重[20-21]。同時(shí)，CD4+和CD8+亞群數(shù)量的減少，會(huì)促使B細(xì)胞的分化、抗體合成及抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性等功能減弱，體液免疫功能也相應(yīng)降低，因此，導(dǎo)致免疫反應(yīng)平衡嚴(yán)重失衡，從而造成患者組織損傷。本研究還顯示HFMD重癥組患兒按指南規(guī)范治療后活化T細(xì)胞比例雖有上升，但與治療前比較無(wú)明顯差異；CD4+/CD8+ 比值較治療前顯著升高。表明重癥手足口病患兒細(xì)胞免疫功能在短期治療后不能很快恢復(fù)，病情好轉(zhuǎn)后仍需避免合并其他病原體感染。

綜上所述，EV71型HFMD患兒存在細(xì)胞免疫功能紊亂，尤其是重癥病例。監(jiān)測(cè)HFMD 患兒CD3+、CD4+、CD8+ 的百分比和CD4+/CD8+ 比值的動(dòng)態(tài)變化，可作為判斷疾病嚴(yán)重程度的臨床參考指標(biāo)。

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（收稿日期：2015-10-19 本文編輯：任 念）