蘇姍姍，姚春麗，李福秋，季永智

· 論著 ·

復(fù)方消銀膏對(duì)小鼠銀屑病樣模型組織病理改變的研究

蘇姍姍，姚春麗，李福秋，季永智

目的研究復(fù)方消銀膏外用對(duì)BALB/c小鼠背部銀屑病樣模型組織病理的改變。方法①分組：48只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、復(fù)方消銀膏A組、復(fù)方消銀膏B組、丙酸氯倍他索組及消銀膏組。②造模：除空白組外其余各組鼠背部皮膚外用5%咪喹莫特，使其產(chǎn)生銀屑病樣模型。③治療及評(píng)分：模型組作為對(duì)照，復(fù)方消銀膏A組、復(fù)方消銀膏B組、丙酸氯倍他索組及消銀膏組分別給予相應(yīng)藥物治療，根據(jù)8 d后光鏡下各組局部皮膚組織病理變化進(jìn)行BAKER評(píng)分，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果空白組與模型組之間BAKER評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），造模成功；與模型組相比，復(fù)方消銀膏A組、復(fù)方消銀膏B組、丙酸氯倍他索組的BAKER評(píng)分均降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；復(fù)方消銀膏A組、復(fù)方消銀膏B組與丙酸氯倍他索組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而復(fù)方消銀膏A組與復(fù)方消銀膏B組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；消銀膏組的BAKER評(píng)分低于模型組，而高于另外3個(gè)治療組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論各治療組均可以改善小鼠銀屑病組織病理變化，丙酸氯倍他索組最明顯，復(fù)方消銀膏組次之，消銀膏組最差，且復(fù)方消銀膏A組與復(fù)方消銀膏B組療效無(wú)明顯差異。

銀屑病；復(fù)方消銀膏；動(dòng)物模型；組織病理

蘇姍姍

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，主要表現(xiàn)為紅斑、鱗屑，部分患者伴有干燥、瘙癢等不適感。由于其病程長(zhǎng)、病因復(fù)雜、易于反復(fù)、難于根治，銀屑病患者身心均承受著巨大的壓力。當(dāng)治療不當(dāng)時(shí)甚至?xí)葑優(yōu)榧t皮病性或關(guān)節(jié)病性銀屑病。外用藥直接作用于皮膚表面，不良反應(yīng)小，可以持久發(fā)揮作用。既往外用藥以糖皮質(zhì)激素類藥膏為主，但有一定不良反應(yīng)，而鈣調(diào)磷酸酶抑制劑價(jià)格昂貴，因此我們研制了一種治療銀屑病的新型藥膏——復(fù)方消銀膏。本實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)方消銀膏治療咪喹莫特刺激產(chǎn)生的銀屑病樣模型的組織病理學(xué)改變進(jìn)行了研究，為以后臨床用藥提供初步的數(shù)據(jù)和資料，結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物消銀膏由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供（吉藥制字：Z20130112）。丙酸氯倍他索乳膏（遂成藥業(yè)股份有限公司研制，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20053852）。咪喹莫特軟膏購(gòu)自四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司（國(guó)藥準(zhǔn)字：H20030128）。

1.1.2動(dòng)物BALB/c雌性小鼠，6～8 w，體重（20 ±2）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）20140004。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)用藥配制復(fù)方消銀膏A、復(fù)方消銀膏B由丙酸氯倍他索乳膏和消銀膏按1:1、2:1均勻攪拌而成。

1.2.2動(dòng)物準(zhǔn)備所有小鼠適應(yīng)環(huán)境3 d，給藥前24 h將小鼠背部脊柱兩側(cè)被毛脫毛，面積2 cm×3 cm，注意不可損傷表皮。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及給藥48只小鼠，隨機(jī)分為6組，即空白組，模型組，丙酸氯倍他索組，復(fù)方消銀膏A組，復(fù)方消銀膏B組，消銀膏組。空白組：每日定時(shí)在小鼠裸露背部涂抹適量凡士林。模型組：每日定時(shí)在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特62.5 mg。丙酸氯倍他索組、復(fù)方消銀膏A組、復(fù)方消銀膏B組、消銀膏組均定時(shí)在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特62.5 mg，同時(shí)分別給予等量丙酸氯倍他索、復(fù)方消銀膏A、復(fù)方消銀膏B、消銀膏外用。8 d后處死小鼠并剪取小鼠背部皮損組織，置于10%甲醛中固定。

1.2.4實(shí)驗(yàn)療效評(píng)估依次經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、包埋后制成蠟塊，切厚度3 μm切片進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察組織病理改變，進(jìn)行BAKER評(píng)分[1]。

BAKER評(píng)分具體標(biāo)準(zhǔn)如下：表皮層中發(fā)現(xiàn)Munro小膿腫2.0分；角化過(guò)度0.5分；角化不全1.0分；顆粒層變薄或消失1.0分；棘層增厚1.0分；皮突延長(zhǎng)、起伏根據(jù)輕中重度分別計(jì)0.5分、1.0分、1.5分。真皮層中單一核或多核細(xì)胞浸潤(rùn)根據(jù)輕中重度分別計(jì)0.5分、1.0分、1.5分；乳突上頂0.5分；毛細(xì)血管擴(kuò)張0.5分。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ xˉ ±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1模型構(gòu)建及各組組織病理改變

空白組鏡下可見(jiàn)皮膚結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)正常，未見(jiàn)明顯異常改變（圖1）。

模型組銀屑病樣皮損見(jiàn)圖2a。皮損組織病理可見(jiàn)Munro小膿腫，表皮明顯的角化過(guò)度及角化不全，棘層重度肥厚，伴有明顯的毛細(xì)血管擴(kuò)張，重度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2b，2c）。

圖1　空白組小鼠組正常皮膚組織病理

圖2　模型組小鼠造模后臨床皮損及組織病理（HE染色×100）

圖3　丙酸氯倍他索組小鼠皮損組織病理（HE染色×100）

圖4　復(fù)方消銀膏A組與復(fù)方消銀膏B組小鼠皮損組織病理（HE染色×100）

圖5　消銀膏組小鼠皮損組織病理（HE染色×100）

丙酸氯倍他索組（圖3a，3b）、復(fù)方消銀膏A組（圖4a）、復(fù)方消銀膏B組（圖4b）鏡下均未見(jiàn)Munro小膿腫，表皮角化過(guò)度及角化不全現(xiàn)象減輕，棘層變薄，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯減少。其中丙酸氯倍他索組部分皮損可見(jiàn)新生毛囊。

消銀膏組未見(jiàn)Munro小膿腫，但可見(jiàn)明顯的角化過(guò)度及角化不全，棘層中重度肥厚，毛細(xì)血管擴(kuò)張，重度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5）。

2.2各組小鼠BAKER評(píng)分

通過(guò)F檢驗(yàn)（F=72.972，P＜0.05）判斷各組小鼠之間的BAKER評(píng)分有顯著差異，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD探索性分析。方差分析表明空白組與模型組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示小鼠背部產(chǎn)生銀屑病樣組織病理改變，造模成功。各治療組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示各組均有治療作用。復(fù)方消銀膏A組、復(fù)方消銀膏B組與丙酸氯倍他索組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。復(fù)方消銀膏A組、復(fù)方消銀膏B組與消銀膏組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而復(fù)方消銀膏A與復(fù)方消銀膏B組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1　各組小鼠BAKER評(píng)分（分）

3　討論

銀屑病是一種常見(jiàn)的免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，其典型的組織病理變化為表皮角化不全、角化過(guò)度、上皮突向下延長(zhǎng)、顆粒層變薄或消失、棘層增生肥厚，真皮可見(jiàn)新生血管的擴(kuò)張迂曲，并伴有大量單一核或多核細(xì)胞的浸潤(rùn)。

一個(gè)理想的銀屑病樣動(dòng)物模型必需能模擬銀屑病的組織病理學(xué)特征且有一個(gè)與銀屑病相似的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)能夠?qū)︺y屑病藥物有治療反應(yīng)[2]。但是銀屑病病因復(fù)雜，目前還沒(méi)有能夠模擬出全部的銀屑病樣表現(xiàn)及其相關(guān)的炎癥情況的動(dòng)物模型。

咪喹莫特作為新型的局部免疫調(diào)節(jié)劑，屬于Toll樣受體激動(dòng)劑，用于人類乳頭瘤病毒引起的生殖器和肛周疣[3]、光化性角化病等的治療。臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)患者在外用咪喹莫特乳膏時(shí)銀屑病會(huì)加重或復(fù)發(fā)[4]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損主要依賴于白細(xì)胞介素（IL）-23/IL-17炎性反應(yīng)軸[5]，此外還有IL-27激活輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）1細(xì)胞應(yīng)答途徑及氧化應(yīng)激途徑。咪喹莫特誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠皮損具有典型的銀屑病表型和組織學(xué)特點(diǎn)，與人類銀屑病有很多相似之處，且操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性高，是研究銀屑病的理想動(dòng)物模型。因此本實(shí)驗(yàn)選用咪喹莫特刺激BALB/c小鼠產(chǎn)生銀屑病樣模型。

鑒于銀屑病的高復(fù)發(fā)率和口服藥物的系統(tǒng)性不良反應(yīng)，對(duì)于病情極輕、發(fā)展極慢的靜止期患者可單純采用外用藥治療。外用藥的恰當(dāng)使用可以有效地控制病情、迅速改善癥狀，而外用藥與系統(tǒng)用藥、物理療法的聯(lián)合應(yīng)用，則可以提高療效，減輕不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，正確選擇外用藥顯得尤為重要。銀屑病理想的外用藥應(yīng)在針對(duì)病因機(jī)制治療的同時(shí)不良反應(yīng)小，能大面積涂擦。

復(fù)方消銀膏是消銀膏和丙酸氯倍他索按一定比例混合而成，它使中西醫(yī)有機(jī)的結(jié)合在一起，既解決了中藥起效慢、療程長(zhǎng)的問(wèn)題，又減少了糖皮質(zhì)激素制劑的用量，短期內(nèi)達(dá)到較好療效，使患者能堅(jiān)持和配合較長(zhǎng)療程的治療。消銀膏是長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院研發(fā)的外用中藥膏，組方為黃連、黃芩、當(dāng)歸、生地、姜黃，主要用于治療炎癥性皮膚病及銀屑病。丙酸氯倍他索是治療銀屑病常用的糖皮質(zhì)激素類藥物，具有抗炎和抑制細(xì)胞增生的作用。

黃青等[6]研究報(bào)道黃連可以通過(guò)抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞的增生發(fā)揮治療銀屑病的作用，并且具有明顯的量效關(guān)系。同時(shí)黃連還具有免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)作用。

向延衛(wèi)等[7]研究表明芩珠涼血方（黃芩為君藥）可以調(diào)節(jié)患者血清中IL-17、IL-23的水平，以及調(diào)控患者皮損信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及活化因子3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）和轉(zhuǎn)錄因子孤核受體（RORγt）的表達(dá)，起到對(duì)血熱證銀屑病患者的治療作用。吳珺等[8]的研究表明，黃芩的主要成分均可抑制T淋巴細(xì)胞活化的作用，從而抑制銀屑病的發(fā)生及發(fā)展。

楊欽紅[9]研究表明，當(dāng)歸多糖通過(guò)活化巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞并通過(guò)IL-2 和 干擾素（IFN）-γ的誘生發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。景海霞等[10]研究表明，當(dāng)歸多糖的免疫調(diào)節(jié)作用可能存在雙向性，使紊亂的免疫狀態(tài)趨于平衡，從而治療銀屑病等免疫異常性疾病。

生地能擴(kuò)張血管，減低毛細(xì)血管的通透性，抑制血管內(nèi)皮炎癥，與改善銀屑病組織病理中大量毛細(xì)血管的炎性增生有關(guān)[11]。韓振翔等[12]用大鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大劑量生地預(yù)處理可明顯降低治療后血清中腫瘤壞死因子（TNF）-α 的水平，而TNF-α是目前被認(rèn)可的與銀屑病發(fā)生及預(yù)后有密切關(guān)系的細(xì)胞因子。

姜黃素能抑制被誘導(dǎo)高表達(dá)的環(huán)氧酶2，脂氧合酶，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，抑制細(xì)胞因子（如IFN-γ和TNF-α）的產(chǎn)生、抑制轉(zhuǎn)錄因子（如核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，抗磷脂抗體APl）的激活。姜黃素同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)的作用，能調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹(shù)狀突細(xì)胞的活性，還能調(diào)節(jié)多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)及其介導(dǎo)的作用（如IL-1、IL-2、IL-6等），這些與銀屑病的發(fā)病密切相關(guān)[13]。

5%咪喹莫特外用后模型組的BAKER評(píng)分為（7.38 ±1.06）分，經(jīng)復(fù)方消銀膏A、復(fù)方消銀膏B、丙酸氯倍他索及消銀膏治療后的BAKER評(píng)分分別下降為（3.31±0.53）分、（4.88±1.03）分、（4.31±0.88）分及（5.93 ±0.90）分，結(jié)合各組的組織病理表現(xiàn)及BAKER評(píng)分可以明顯看出，各治療組都可以改善咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣組織病理變化（P＜0.05），但丙酸氯倍他索組最明顯，復(fù)方消銀膏組次之，消銀膏組最差。消銀膏組療效差，考慮可能與消銀膏完全由中藥成分組成，起效緩慢且治療時(shí)間較短有關(guān)。銀屑病一般治療時(shí)間長(zhǎng)，部分患者皮損面積大，考慮糖皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)，因此可以選用復(fù)方消銀膏治療銀屑病。復(fù)方消銀膏A、復(fù)方消銀膏B在治療銀屑病方面療效確切且二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組復(fù)方消銀膏治療銀屑病時(shí)療效相當(dāng)，復(fù)方消銀膏B中消銀膏與糖皮質(zhì)激素比例為1:2，而復(fù)方消銀膏A中消銀膏與糖皮質(zhì)激素比例為1:1，因此建議選用糖皮質(zhì)激素濃度低的復(fù)方消銀膏A在臨床上進(jìn)一步推廣，以減少不良反應(yīng)的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)對(duì)咪喹莫特刺激產(chǎn)生的銀屑病樣模型做了組織病理方面的研究，為今后臨床用藥提供良好了的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯耿建麗）

Pathologic observation about the influence of compound xiaoyin-ointment on psoriasis-like mice model

SU Shan-shan，YAO Chun-li，LI Fu-qiu，et al
Department of Dermatology, the Second Hospital of Jilin University, Changchun 130000, China

Objective To observe the pathological changes of the psoriasis-like BALB/c mice model treated by compound xiaoyinointment. Methods Forty-eight mice were randomly divided into six groups: blank group, model group, compound xiaoyin-ointment treatment group A, compound xiaoyin-ointment treatment group B, clobetasol propionate treatment group, xiaoyin-ointment treatment group. 5% imiquimod was applied on the back of all mice except blank group to produce psoriasis-like mice model. All the groups except blank group and model group were treated with corresponding ointment for 8 days. Then pathological manifestations (BAKER score) were investigated under light microscope and statistical analysis were performed. Results The difference of BAKER score between blank group and model group showed statistical significance(P＜0.05), which indicated successful psoriasis-like mice model. Compared with model group, the BAKER scores of compound xiaoyin-ointment treatment group A, compound xiaoyin-ointment treatment group B and clobetasol propionate treatment group were lower with statistical significance(P＞0.05). The difference of BAKER scores between clobetasol propionate treatment group and compound xiaoyin-ointment treatment group showed statistical significance(P＜0.05), but the differences between compound xiaoyin-ointment treatment group A and compound xiaoyin-ointment treatment group B showed no statistical significance(P＞0.05). The BAKER score of xiaoyin-ointment treatment group was lower than model group and higher than other three treatment groups with statistical significance(P＜0.05). Conclusion Psoriasis pathologic changes caused by imiquimod were remarkably improved after being treated with these four kind of ointments. For the efficacy, the clobetasol propionate treatment group was the most obvious, the second was the compound xiaoyin-ointment treatment group, and the xiaoyin-ointment treatment group was the worst. However there were no significant differences between compound xiaoyin-ointment treatment group A and compound xiaoyin-ointment treatment group B.

Psoriasis；Compound xiaoyin-pintment；Animal models；Pathologic[J Pract Dermatol, 2016, 6(5):289-292]

R758.63

A

1674-1293(2016)05-0289-04

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160501

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20130727016YY）

130000 長(zhǎng)春，吉林大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科（蘇姍姍，姚春麗，李福秋，季永智）

蘇姍姍，碩士研究生，E-mail：sushan1007@163.com

李福秋，E-mail: lifuqiu@medmail.com.cn

（2016-04-17

2016-05-09）