普燕，馬曉林，張富春，李軼杰

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊，830046)

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駱駝凝乳酶的分子結(jié)構(gòu)與制備干酪的研究現(xiàn)狀

普燕，馬曉林，張富春*，李軼杰

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊，830046)

駱駝凝乳酶與牛凝乳酶有著相似的一級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，但二者對牛乳的親和力、催化速率卻有著較大的差異，研究其分子水平上的不同，對今后凝乳酶的蛋白質(zhì)工程改造有著重要意義。同時駱駝凝乳酶制備干酪苦味少，聯(lián)合駱駝凝乳酶與改良發(fā)酵劑制備新型低質(zhì)、低鹽干酪也成為干酪研發(fā)的方向之一。該文綜述了駱駝凝乳酶的結(jié)構(gòu)、酶學(xué)特性、與底物結(jié)合的分子研究以及制備干酪等方面的內(nèi)容。

凝乳酶；駱駝；底物親和力；晶體結(jié)構(gòu)；干酪

凝乳酶(EC3.4.23.4)是一種酸性蛋白酶[1]，廣泛存在于新生哺乳動物的胃中。凝乳酶能凝固乳液，延長母乳在新生動物消化道中的存留時間，從而使母乳的營養(yǎng)能充分被小動物吸收[2]。利用凝乳酶凝固乳液這一特性，人們從未斷奶小動物(小牛、羔羊等)胃中提取凝乳酶并廣泛用于干酪制作。不同動物來源的凝乳酶特性不同，即使干酪制備工藝完全相同，制備的干酪質(zhì)地與風(fēng)味也不盡相同。其中小牛凝乳酶凝乳活力高，對乳中κ-酪蛋白水解快速而專一，同時對乳中其它蛋白的水解活性低，即c/p值高，這一特性能使凝乳過程中使更多乳蛋白存留在凝塊中，在干酪成熟過程中，其對凝乳中蛋白水解少，從而干酪的出品率高，產(chǎn)生的苦味肽少，口味好，故小牛凝乳酶一直被認(rèn)為是最佳的制備干酪的凝乳酶。

2006年，KAPPELER等人[3]首次從單峰駝(Camelus dromedarius)體內(nèi)克隆了凝乳酶基因，在黑曲霉(Aspergillusniger)中成功表達(dá)，并檢測了其酶學(xué)特性。與小牛凝乳酶比較，發(fā)現(xiàn)駱駝凝乳酶對牛乳的凝乳活力比小牛凝乳酶高70%，但非特異蛋白水解活力才相當(dāng)小牛凝乳酶的20%，這使得駱駝凝乳酶的c/p值是小牛凝乳酶的7倍。在理論上，c/p值是評判凝乳酶制備干酪性能優(yōu)劣的一個重要標(biāo)志。高c/p凝乳酶制備干酪可能會得到更高的出品率和更好的風(fēng)味。

2009年，BANSAL等人[4]用駱駝凝乳酶制備cheddar干酪，并以小牛凝乳酶制備的干酪作為對照。2種干酪均在相同的條件下制備，但是由于駱駝凝乳酶的凝乳活力比小牛凝乳酶高，故為保證添加的凝乳酶量使乳液在相同的時間和條件下，達(dá)到相同的切割硬度，則駱駝凝乳酶的用量比小牛凝乳酶用量少。制備出的兩種干酪在組分和pH沒有任何差異；但是初級水解程度(以pH4.6可溶性氮表示)，駱駝凝乳酶要比小牛凝乳酶低。SDS-PAGE分析乳蛋白被水解的情況，兩種干酪中的β-酪蛋白都被乳液中固有存在的血纖維蛋白溶酶(plasmin)水解成β-CN(f29-209)，β-CN(f106-209)和β-CN(f108-209)，但小牛凝乳酶在干酪成熟過程中產(chǎn)生了β-CN(f1-189/192)肽，此肽在駱駝凝乳酶制備的干酪中沒有檢測到，這或許是駱駝凝乳酶的用量少，或許是駱駝凝乳酶的非特異水解活性更低，也或許是二者的綜合作用結(jié)果。而β酪蛋白水解產(chǎn)生的β-CN(f1-189/192)，β-CN(f193-209)和β-CN(f190-209)小肽會造成干酪的苦味。以上結(jié)果也暗示駱駝凝乳酶制備的干酪苦味更低。2種酶對αs1-酪蛋白的水解產(chǎn)物基本相同，但駱駝凝乳酶制備的干酪在成熟180 d時對其水解量才相當(dāng)于牛凝乳酶制備干酪30 d水解量，這與駱駝凝乳酶的用量低和非特異水解活力較低均有關(guān)。2種干酪中游離氨基酸的含量沒有顯著差異，這也許是因為游離氨基酸主要是乳酸菌(發(fā)酵劑和非發(fā)酵劑)的肽酶產(chǎn)生之故。比較干酪成熟的質(zhì)地，成熟30 d時2種干酪的硬度和咀嚼性沒有顯著差別，成熟150 d時駱駝制備干酪硬度和咀嚼性測定值均高于小牛凝乳酶制備干酪，180 d時2種干酪的總體感官相似，但是駱駝凝乳酶制備干酪硫強(qiáng)度、肉湯味和苦味均較低。

駱駝凝乳酶比小牛凝乳酶有更高的c/p以及更優(yōu)越的制備干酪的性能。丹麥科漢森公司就通過黑曲霉大量發(fā)酵駱駝凝乳酶并上市，與此同時，駱駝凝乳酶的基因和蛋白序列[5]、用駱駝凝乳酶制備干酪[6]已被申請國際專利。如今駱駝凝乳酶已經(jīng)成功地成為了小牛凝乳酶的替代品，人們不但沒有因此止步，反而對駱駝凝乳酶的研究變得更為積極和深入，為了更好地了解駱駝凝乳酶對牛乳的高凝乳活力、高催化效率的機(jī)制，從酶的晶體結(jié)構(gòu)、酶對牛乳中α-、β-、κ-酪蛋白的水解肽譜、酶與κ-酪蛋白結(jié)合的分子水平等方面進(jìn)行深入研究。由于牛凝乳酶的相關(guān)研究非常多，故在研究駱駝凝乳酶的過程中，也總是伴隨著與牛凝乳酶研究結(jié)果的比較。同時，為了便于描述，我們將駱駝凝乳酶camel chymosin縮寫為CC，牛凝乳酶bovine chymosin縮寫為BC，酪蛋白casein縮寫為CN。

圖1 預(yù)測駱駝凝乳酶的二級結(jié)構(gòu)Fig.1 The secondary structure prediction of the camel chymosin預(yù)測網(wǎng)址(the structure prediction URL)http://linux1.softberry.com/berry.phtml？ topic=pps & group=programs & subgroup=propt

1 駱駝凝乳酶的基因與結(jié)構(gòu)

1.1 駱駝凝乳酶的基因

駱駝凝乳酶原前體(pre-prochymosin)基因含有9個外顯子[3]，開放閱讀框含有1146個核苷酸，編碼381個AA，N-端前16個AA為信號肽(pre-peptide)，中間42個AA為激活片段(activation segment或propeptide)，C-端323個AA為成熟凝乳酶(chymosin)。酶信號肽剪切位點、酶原激活位點以及成熟酶的氨基酸數(shù)等信息完全與牛凝乳酶相同，同時駱駝凝乳酶氨基酸序列與牛凝乳酶氨基酸序列相似度(sequence identity)和序列相似性(sequence similarity)分別為85%和94%，但48個不同AA散布于整個酶，而不是集中在某個區(qū)域[2]。

1.2 駱駝凝乳酶的結(jié)構(gòu)

1.2.1 預(yù)測駱駝凝乳酶原的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)

通過預(yù)測網(wǎng)站對CC酶原與BC酶原的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)CC與BC在一級結(jié)構(gòu)上的高相似度，使得其也具有相似的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)(見圖1和圖2)，包括α-螺旋、β-折疊形成的位置、個數(shù)等。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測中，N端都有一個α-螺旋，這是兩個酶原前體的信號肽，隨后propeptide的N端是β-折疊，后面接著3個α-螺旋，這個預(yù)測結(jié)構(gòu)與已經(jīng)報道的豬胃蛋白酶原和網(wǎng)站預(yù)測的駱駝凝乳酶原和牛凝乳酶原的三維結(jié)構(gòu)中propeptide結(jié)構(gòu)吻合。同時在豬胃蛋白酶原中，N端的β-片層位于酶的活性中心，防止底物進(jìn)入，在pH中性環(huán)境中，酶原不具催化活性[7-8]，而預(yù)測的駱駝和牛凝乳酶原的propeptide結(jié)構(gòu)環(huán)繞在凝乳酶2個結(jié)構(gòu)域中間裂隙的周圍，2個催化Asp位于裂隙中間，故酶活性中心同樣被propeptide結(jié)構(gòu)封閉而不表現(xiàn)出活性。

A豬胃蛋白酶原A晶體結(jié)構(gòu) [7]；B和C分別表示預(yù)測的駱駝凝乳酶原和牛凝乳酶原三級結(jié)構(gòu)圖2 豬胃蛋白酶原A晶體結(jié)構(gòu)[7]和預(yù)測駱駝與牛凝乳酶原三級結(jié)構(gòu)Fig.2 The crystal structure of swine pepsin A and the tertiary structure prediction of the bovine and camel chymosin(預(yù)測結(jié)構(gòu)網(wǎng)址：http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)

成熟凝乳酶的序列從第59位開始，在預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)圖中，連接propeptide和成熟凝乳酶之間是無規(guī)則卷曲，這也方便酶活化時的構(gòu)象改變。目前認(rèn)為天冬氨酸蛋白酶原的活化過程為：propeptide與酶的活性位點以靜電作用結(jié)合，propeptide的存在阻止了底物進(jìn)入酶活性中心，故酶原在中性環(huán)境里不具有催化作用；當(dāng)pH降低，propeptide與酶活性中心的靜電作用被破壞，此時propeptide的構(gòu)象發(fā)生改變，酶原的自剪切位點暴露并與酶活性中心結(jié)合，酶對該位點進(jìn)行切割，propeptide從酶活性中心解離，酶的N端發(fā)生構(gòu)象改變，形成一個反式β折疊位于底物與酶結(jié)合的裂隙處[8](見圖3箭頭所指)。

圖3 牛凝乳酶和駱駝凝乳酶的晶體結(jié)構(gòu)[11]Fig.3 The crystal structure of the bovine and camel chymosin [11]

1.2.2 駱駝凝乳酶的晶體結(jié)構(gòu)

牛凝乳酶的晶體結(jié)構(gòu)模型已見多次報道[9-10]，但是駱駝凝乳酶的晶體結(jié)構(gòu)直到2013年才由JENSEN等人[11]首次報道(見圖3)。為了便于將BC和CC結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，其也同時獲得了BC晶體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與以前研究報道的牛凝乳酶晶體結(jié)構(gòu)完全相同。CC與BC晶體結(jié)構(gòu)上最大的不同之處在于其N端，BC晶體顯示其N端形成了一個反平行式β-折疊(見圖3箭頭所指)。而CC的晶體結(jié)構(gòu)其N端少了10個AA。將CC晶體復(fù)水溶解，對其進(jìn)行N-末端分析、質(zhì)譜分析和檢測凝乳活力，發(fā)現(xiàn)其活力下降，且其活力與N端缺失了3個AA的凝乳酶變體[11]相似(見表1)。

2 駱駝凝乳酶的理化特性與酶學(xué)特性

2.1 駱駝凝乳酶的理化特性

在黑曲霉中表達(dá)獲得的駱駝凝乳酶分子質(zhì)量為35.6 k～40.3 kDa(糖基化不同)[3,11]；等電點理論值為4.85，但實測值為5.5。

JENSEN等[11]人對黑曲霉表達(dá)的駱駝凝乳酶進(jìn)行層析分離，根據(jù)洗脫的先后順序分離出6個凝乳酶變體(variant)，其疏水性和等電點均不同，研究者又通過N-末端分析、質(zhì)譜和差示掃描量熱法對每個凝乳酶變體進(jìn)行分析，得出表1數(shù)據(jù)。

表1 黑曲霉表達(dá)的重組駱駝凝乳酶分離出的不同變體[11]

黑曲霉中的蛋白，若存在Asn-X-Thr/Ser(X為谷氨酸或脯氨酸)序列時，黑曲霉將會對該序列中Asn的Nδ2原子進(jìn)行糖基化，駱駝凝乳酶存在2個糖基化位點：Asn100和Asn290，其中Asn100更易被糖基化[11]。由表1看出， 1和2中雙位點被雙糖基化，3和4是單位點被糖基化，同時其差異性可能是糖基化差異產(chǎn)生的，而5和6沒有被糖基化，其差異產(chǎn)生原因還需研究。值得注意的是， N端缺失3個AA的變體1，凝乳活力很低。JENSEN等人[11]選取凝乳酶變體2進(jìn)行了晶體結(jié)構(gòu)研究(見圖3)。

2.2 駱駝凝乳酶的酶學(xué)特性

早在1993年，WANGO[12]就用駱駝rennet 和牛rennet對駝乳和牛乳進(jìn)行凝乳研究，發(fā)現(xiàn)牛rennet對駝乳凝固主要是牛胃蛋白酶組分的作用，而牛凝乳酶幾乎不凝駝乳。2006年，KAPPELER等也發(fā)現(xiàn)重組駱駝凝乳酶不能凝固牛乳[3]。

SALIHA等[13]用來自不同年齡(1、3、9年)的駱駝胃粘膜粗提物GEC1、3、9對駝乳和牛乳進(jìn)行凝乳實驗，同時用商品化的牛rennet(80%凝乳酶、20%胃蛋白酶)和商品化牛胃蛋白酶作對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GEC9駱駝胃蛋白酶的粗提物對駝乳和牛乳的凝乳效果最好，GEC9凝乳活力為牛rennet的2倍，但對牛乳的蛋白水解活力才是其58.3%。對重組駱駝凝乳酶的蛋白水解活力檢測也證實了其蛋白水解活力低于牛凝乳酶[2,14]。

關(guān)于黑曲霉表達(dá)的重組駱駝凝乳酶的最適作用溫度和pH、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、c/p值等情況見表2。

表2 幾種重組凝乳酶的酶學(xué)特性

注：重組駱駝凝乳酶和牛凝乳酶由黑曲霉表達(dá)，重組水牛凝乳酶和山羊凝乳酶由畢赤酵母表達(dá)。

從表2看出，駱駝凝乳酶的熱穩(wěn)定性和c/p值高于牛凝乳酶。但關(guān)于駱駝凝乳酶的催化效率，有不同的報道。VALLEJO等人[14]比較了4種重組凝乳酶催化效率，底物為牛κ酪蛋白，結(jié)果山羊凝乳酶最高，而駱駝凝乳酶最低。KAPPELER等人[3]以合成的牛和駱駝κ酪蛋白P8-P3′的11個氨基酸多肽為底物，檢測駱駝凝乳酶和牛凝乳酶的催化效率為152 mM-1s-1和268 mM-1s-1。M?LLER等人[15]以牛κ酪蛋白為底物，通過計算凝乳酶切割牛乳κ-酪蛋白產(chǎn)生的副-κ-酪蛋白和糖巨肽的產(chǎn)生量，得出駱駝凝乳酶催化效率比牛凝乳酶高15%。

3 駱駝凝乳酶對牛乳中主要乳蛋白水解的肽譜分析

3.1 κ-CN水解肽譜

M?LLER等人[15]用毛細(xì)管電泳和反相液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析了CC和BC作用于牛乳κ-CN的最初水解位點(pH6.5，32 ℃)。結(jié)果顯示2種酶均對κ-CN進(jìn)行特異性剪切，即切割κ-CN的Phe105-Met106之間的肽鍵，產(chǎn)生副-κ-CN和糖巨肽。

3.2 αs1-CN水解肽譜

M?LLER等人[16]采用CC和BC水解αs1-CN 24 h(pH6.5，30 ℃)，將pH4.6-可溶性氮進(jìn)行毛細(xì)管電泳和反相高效液相色譜分析，結(jié)果見表3。

表3 CC和BC水解αs1-CN 24 h的水解肽數(shù)[16]

分析水解肽段序列得出，CC和BC都優(yōu)先水解αs1-CN的Phe23-Phe24肽鍵，繼而水解Leu101-Lys102肽鍵，產(chǎn)生的f102-199，經(jīng)BC繼續(xù)水解最終檢測到14條肽，而CC只檢測到4條，二者共有肽3條。即 CC和BC對αs1-CN的水解位點開始保持一致，只在水解后期出現(xiàn)各自水解特異性。

3.3β-CN水解肽譜

CC和BC優(yōu)先水解β-CN中的Leu192-Tyr193，從而導(dǎo)致疏水性f193-209肽的大量積累。BC在水解進(jìn)行的12 h內(nèi)即可完全水解β-CN，但CC對該肽的水解速率只有BC的7%。接下來，CC水解的肽鍵是Leu165-Ser166和Phe190-Leu191，對BC來說，其后續(xù)水解的肽鍵是Leu165-Ser166、Gln167-Ser168和Ala189-Phe190。最后，f1-192會被CC和BC在Ser57-Leu58、Leu163-Ser164和Trp143-Met144處切割，而BC還會在Ser142-Typ143位點切割，得到最終的水解肽譜。

3.4 駱駝凝乳酶制備干酪苦味較低的原因分析

干酪制備時，極少量存留于凝塊中的凝乳酶會在干酪成熟過程中水解凝乳里αs1-CN和β-CN。已知這些蛋白水解肽中有些肽會造成干酪的苦味，影響干酪的口感。已報道用CC制備的干酪比BC制備的干酪，苦味少、硬度高，結(jié)合上述CC和BC對乳蛋白的水解肽譜分析，解釋如下：

(1)在相同的酶濃度下(IMCU)，比較CC和BC水解αs1-CN和β-CN最初位點的水解速率，CC水解速率只相當(dāng)于BC的36%和7%，這樣，經(jīng)歷相同的干酪成熟時間，CC可能水解產(chǎn)生的苦味肽數(shù)量少；

(2)BC水解β-CN的肽譜中存在f168-189和f190-192，而CC的水解肽譜中沒有這兩個肽，M?LLER等人認(rèn)為這2種疏水肽增加了干酪的苦味；

(3)在pH5.2的條件下，BC對β-CN深度廣泛水解，切割β-CN中的93-94和127-128之間的肽鍵，這可能是干酪苦味增加的重要因素，若使用CC則可能不會切割這2個位點[16]。

4 駱駝凝乳酶與κ-CN底物特異結(jié)合的分子研究

4.1 結(jié)合位點的命名

為方便而清楚描述酶的活性位點與κ-CN結(jié)合情況，SCHECHTER和BERGER對酶與底物結(jié)合的AA進(jìn)行了命名。從κ-CN剪切位點算起，往κ-CN N-端方向，依次AA命名為P1、P2、P3……Pn，往κ-CN C-端方向，依次AA命名為P1′、P2′、P3′……Pn′。舉例：駱駝κ-CN的剪切位點為Phe97-Ile98，那么Ser96、Phe97、Ile98和Ala99 就命名為SerP2、PheP1、IleP1′和Ala P2′。同理與κ-CN P1、P2、P3……Pn相互作用的酶活性裂隙中的亞位點結(jié)構(gòu)(subsite)依次命名為S1、S2、S3……Sn和S1′、S2′、S3′……Sn′。由于酶對底物的特異性結(jié)合與酶的亞位點結(jié)構(gòu)有關(guān)，故這些亞位點結(jié)構(gòu)又被稱為“特異性口袋”(specificity pocket)[2,11]。

4.2 駱駝凝乳酶與κ-CN的親和力

M?LLER等人[15]根據(jù)凝乳酶切割牛乳κ-CN產(chǎn)生的副-κ-CN和糖巨肽的產(chǎn)生量，計算出CC和BC的Km和Kcat。結(jié)果顯示CC與牛κ-CN結(jié)合的親和力比BC與牛κ-CN結(jié)合的親和力(Km)低約30%，但結(jié)合的轉(zhuǎn)換數(shù)(Kcat)卻高出60%，這樣，計算酶的催化效率(Kcat/Km)，CC高出約15%。在局部，CC表面負(fù)電荷叢(cluster)的電子密度低，可能減弱了與牛κ-酪蛋白C端的His-Pro正電荷叢的靜電作用，這樣降低了CC對底物的親和力，加速了酶與底物的解離。

4.3 駱駝凝乳酶的表面靜電荷

JENSEN等人[11]在pH6.65(牛乳的生理pH)條件下計算CC和BC的表面靜電荷總值和pI值，CC為-9ec和4.8，BC為-15ec和5.4。CC的表面正電荷區(qū)域比BC更大，其原因可能是：在凝乳酶的C端，CC的56位為His，而BC是Gln，即此處CC多了1個帶正電荷的AA；在凝乳酶的N端，CC的249和251位分別為不帶電的Asn和Gly，而BC此處為兩個Asp，帶負(fù)電荷；同時，BC中242、254、278 的這3個位點都不帶電荷，而CC中為3個帶正電的AA(Arg、Arg和Lys)，由此形成了1個新的正電荷區(qū)域；在凝乳酶的底部，BC中的150和316位分別是2個不帶電荷的AA，而CC為2個Arg，又形成了1個正電荷區(qū)域[11]。

凝乳酶在κ-CN的Phe105-Met106位點進(jìn)行切割，研究顯示κ-CN酶切位點附近有幾個帶正電荷的AA，而pH6.65環(huán)境下凝乳酶表面總體靜電荷為負(fù)，這樣有利于二者相互作用。但κ-CN的C端由于存在幾個Asp和Glu而表現(xiàn)出帶負(fù)電荷特性，可能因此會出現(xiàn)與凝乳酶的相互排斥。因CC表面負(fù)電荷較少，該排斥會明顯小些。然而，從CC和BC表面帶正電荷區(qū)域來看，正電荷區(qū)域可能正好位于底物結(jié)合裂隙外部，這也許能幫助酶調(diào)整方向使得酶表面的正電荷與κ-CN的C端負(fù)電荷作用。一般認(rèn)為凝乳酶C端區(qū)域的負(fù)電荷叢與κ-酪蛋白His98-His102正電荷叢之間的靜電吸引，對酶與底物的特異結(jié)合有重大作用。SAFRO等[17]提出，κ-CN His98-His102正電荷叢接近凝乳酶的Gln240-Cys250，從而定置在酶表面活性位點裂隙的附近，因為Gln240-Cys250酸性殘基電子密度的明顯改變，造成酶伸展，似乎更適合底物在活性位點靠靜電作用定位。JENSEN等人[11]還強(qiáng)調(diào)了Glu245、Asp247、Asp249和Asp251對吸引κ-CN His-Pro正電荷叢的作用。綜上，κ-CN帶負(fù)電荷的C端，其既被凝乳酶表面的正電荷吸引，又被負(fù)電荷排斥，這樣有利于κ-CN結(jié)合到酶的活性位點的C端。CC底部的帶正電荷區(qū)域?qū)ξ?CN負(fù)電荷的C端可能也很重要。故CC表面存在更多的正電荷區(qū)域，這似乎對CC較BC高的凝乳活力做了一些解釋[11]。還有，CC表面的負(fù)電荷叢比較BC不是很適合與κ-CN His98-His102正電荷叢相互作用，這樣可能使酶與底物親和力(Km)弱，同時可能造成水解完成后酶與底物的更快解離(Kcat)，這也給我們改進(jìn)酶的凝乳活力提供了一條新思路。

B?RSTING等人[18]研究不同乳液pH對存留在凝乳中駱駝凝乳酶酶量影響，以BC為對照。乳液設(shè)定不同pH，用相同凝乳酶活力的CC和BC凝乳后離心，檢測乳清中的凝乳酶活力(以合成肽Pro-Thr-Glu-Phe-(NO2-Phe)-Arg-Leu為底物，HPLC檢測催化產(chǎn)物的量)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳液pH為6.00～6.65時，CC存留在凝乳中的量非常恒定，約20%，而牛凝乳酶的殘留量卻幾乎呈線性上升，從2%增至21%。作者分析，CC對pH的低依賴性可能是由于CC分子帶負(fù)電荷的量少于BC之故。

4.4 凝乳酶/κ-CN片段復(fù)合物模型

PALMER等人[19]先前建立了牛凝乳酶和牛κ-CN片段復(fù)合物的模型，該模型符合已有的牛凝乳酶實驗數(shù)據(jù)。S?RENSEN等[2]人采用同源模型和分子動力模擬技術(shù)，對CC、BC分別與牛、駱駝κ-CN片段形成的復(fù)合物進(jìn)行分析。κ-CN片段選取切割位點附近的16AA肽，序列見圖4。復(fù)合物表示形式為：凝乳酶/κ-CN，則4種復(fù)合物分別是BOV/BOV、BOV/CAM、CAM/CAM和CAM/BOV(BOV代表牛凝乳酶和牛酪蛋白片段，CAM代表駱駝凝乳酶和駱駝酪蛋白片段)。建立的同源模型將BOV/BOV當(dāng)作比對模板。

圖4 κ-CN片段的序列Fig.4 The AA sequence of the κ-CN圖中箭頭處為酶的切割位點

分析復(fù)合物中酶的波動性，發(fā)現(xiàn)波動大的區(qū)域為loop和轉(zhuǎn)角?？傮w上，酶的動力學(xué)非常相似，只有在酶的C端波動存在較明顯差異。同時復(fù)合物中的P3-P2′殘基都很穩(wěn)定，但結(jié)合裂隙靠外部的殘基波動大，這也說明底物與酶的結(jié)合并不是非常堅固，BOV/CAM和CAM/BOV都是在酶的C端、κ-CN片段N端顯現(xiàn)出較大波動。通過模型分析，4種酶與底物復(fù)合物結(jié)構(gòu)相似，BOV/BOV、CAM/CAM和CAM/BOV復(fù)合物結(jié)合穩(wěn)定，BOV/CAM在結(jié)合亞位點比較其它模型較不穩(wěn)定，原因可能是由于牛凝乳酶221位的Lys殘基與駱駝κ-CN P4位上的Arg殘基之間存在電荷排斥而導(dǎo)致[2]。

4.5 凝乳酶/κ-CN復(fù)合物的結(jié)合自由能研究

S?RENSEN等人[20]使用分子力學(xué)Poisson-Boltzmann表面積法(molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area ，MM-PBSA)計算BOV/BOV和CAM/BOV復(fù)合物中酶與底物結(jié)合的自由能(ΔG)。BOV/BOV的ΔG為-42.8 kcal/mol，CAM/BOV的ΔG為-33.4 kcal/mol，表明BOV/BOV結(jié)合力更強(qiáng)。其又用丙氨酸掃描計算(alanine scanning calculations)方法來分析BOV/BOV和CAM/BOV復(fù)合物中各個殘基對結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)。丙氨酸掃描計算結(jié)果用ΔΔG表示，描述將復(fù)合物中的殘基突變?yōu)锳la后結(jié)合自由能的改變。ΔΔG為負(fù)數(shù)時，表示突變結(jié)果能增強(qiáng)酶與底物的結(jié)合，ΔΔG為正數(shù)時，表示突變結(jié)果減弱酶與底物的結(jié)合。復(fù)合物中的牛κ-CN片段為97-112肽，序列為R-H-P-H-P-H-L-S-F-M-A-I-P-P-K-K，將其中的7個AA殘基突變?yōu)锳la來計算自由能的變化(突變殘基見圖5)，這相當(dāng)于把CC和BC的一級結(jié)構(gòu)的差異通過能量學(xué)進(jìn)行近似的量化。

圖5 突變κ-CN殘基Fig.5 The mutated residues in the κ-CN(框內(nèi)的殘基為突變殘基，箭頭處表示酶的切割位點)

在所有替換中，只有BOV/BOV中HisP4Ala突變的ΔΔG為負(fù)，其它均為正。將極性和非極性能分開比較，單看極性能(ΔEpolar)發(fā)現(xiàn)HisP4、LeuP3、PheP1和MetP1′突變?yōu)锳la時能量變化對結(jié)合有利。這暗示運(yùn)用突變?nèi)コ焕臉O性作用，而保留非極性作用，將有望提高結(jié)合自由能。比如說，將一個極性AA用一個大小相同的非極性AA替換，對凝乳酶分子進(jìn)行蛋白質(zhì)改造。

5 駱駝凝乳制備干酪的研究

隨著人們對健康和安全要求的提高，CC運(yùn)用到低脂、低鹽干酪制備工藝中，并與改進(jìn)發(fā)酵劑共同促進(jìn)干酪優(yōu)良質(zhì)地與風(fēng)味的形成。

B?RSTING等[21]用CC加工的低脂切達(dá)干酪，蛋白酶解程度較低，苦味少，但斷裂應(yīng)力較高，表現(xiàn)為較硬的干酪質(zhì)構(gòu)。然而用BC加工的低脂切達(dá)干酪，由凝乳酶催化作用釋放的苦味肽β-CN(f193-209)，或者由發(fā)酵劑蛋白酶產(chǎn)生的αS1-CN (f1-23) 肽含量都較高，干酪的質(zhì)構(gòu)較軟。

GOVINDASAMY-LUCEY等[22]用CC制備低脂cheddar干酪(牛乳中脂肪含量0.5%，酪蛋白和脂肪比例為5∶1)，用BC作為對照，結(jié)果顯示干酪的成分與pH值二者無差異，質(zhì)構(gòu)分析數(shù)據(jù)顯示，兩種干酪的硬度和咀嚼性隨著干酪成熟不斷下降，但CC制備干酪的這兩個參數(shù)均高于BC制備干酪。感官分析，CC制備干酪苦味少，并且更耐嚼，BC制備干酪質(zhì)地軟些。CC制備干酪中苦味雖然降低了，但沒有完全消除。

MOYNIHAN等[23]用CC制作低水分-部分脫脂(LMPS)Mozzarella干酪，成熟期間的總鈣和可溶性鈣、pH、水分均無差別。成熟84 d，二者的熔化特性相似，制作披薩時，CC制備干酪起泡少，堅固并耐嚼。同時CC制備干酪在焙烤披薩表現(xiàn)出的特性，包括起泡性、干酪絲的厚度、硬度和咀嚼性均可以在更長的成熟期得以維持，故延長了干酪的貨架期。

為了抵消低鹽(0.85%w/w，正常為1.8%w/w)契達(dá)干酪的負(fù)面感官，MB?LLER等[24]使用不含谷氨酸鹽脫羧酶的發(fā)酵劑與駱駝凝乳酶，并聯(lián)合使用瑞士乳桿菌LactobacillushelveticusCHCC 4481 和戊糖乳桿菌LactobacilluspentosusCHCC 13992制備干酪。結(jié)果駱駝凝乳酶能大大降低苦味肽β-CN(f193-209)和αS1-CN(f1-9)的形成，同時瑞士乳桿菌提高了對這些苦味肽的降解，增加了風(fēng)味氨基酸的釋放量，因為使用的發(fā)酵劑不含谷氨酸鹽脫羧酶，從而積累了更多的游離谷氨酸。戊糖乳桿菌在成熟的150 d內(nèi)成功地將檸檬酸全部轉(zhuǎn)化為風(fēng)味增強(qiáng)物質(zhì)——琥珀酸鹽。作者認(rèn)為運(yùn)用上述的發(fā)酵劑、輔助發(fā)酵劑和凝乳酶，其相互補(bǔ)充、聯(lián)合作用具備改進(jìn)低鹽干酪質(zhì)地的潛力。

6 展望

重組駱駝凝乳酶的克隆與純化開辟了凝乳酶研究的新方向，它目前成功地成為了小牛凝乳酶的替代品并已用來工業(yè)化制備干酪。對其高凝乳活力和高催化效率的探索可以讓人們對現(xiàn)有的凝乳酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，創(chuàng)造出具更高凝乳活力、更低非特異蛋白水解活力、加工特性穩(wěn)定以及能作用不同底物(如駝乳κ-酪蛋白等)的新型酶。

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Research progress on molecular structure and Cheese-making of the camel chymosin

PU Yan，MA Xiao-lin, ZHANG Fu-chun*，LI Yi-jie

(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology， Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

The preliminary structure and three dimensional structure of camel chymosin are similar to that of bovine chymosin, but their affinity and catalytic rate acting on bovine casein are different significantly. Studying the difference between the both chymosins on molecular level has great significance for chymosin protein engineering in future. The cheese made with camel chymosin has less bitter taste. Now combination of camel chymosin and the improved cheese starter to produce new type of low-fat, low salt cheese will be a new way for development of cheese in future. The progress of the structure and enzymatic properties of camel chymosin, the molecular basis of interaction between the substrates and enzyme，as well as the cheese made with the camel chymosin were reviewed in this paper.

chymosin; camel; affinity; crystal structure; cheese

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610038

博士，講師(張富春為通訊作者，E-mail：zfcxju@gmail.com)。

新疆大學(xué)博士啟動基金(BS150237)；國家自然科學(xué)基金(31560440)

2016-03-19，改回日期：2016-04-27