李靜文 李國文 秦瑜 李春霞

鐵皮石斛多糖對糖尿病大鼠視網膜炎癥因子表達干預的研究

李靜文1李國文2秦瑜2李春霞2

目的觀察鐵皮石斛多糖（PDC）對糖尿病大鼠視網膜及血清中炎癥因子表達水平的影響，探討PDC在早期糖尿病視網膜病變中的抗炎作用及機制。方法采用鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法誘導SD大鼠糖尿病模型。模型建立成功6周后，分別用低劑量PDC[100 mg/（kg·d）]、中劑量PDC[200 mg/（kg·d）]及高劑量PDC[300 mg/（kg·d）]灌胃治療。8周后，2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，取所需標本。采用蛋白印跡法（Westen Blot）檢測大鼠視網膜內白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血管內皮生長因子（VEGF）的表達水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測大鼠血清IL-6、TNF-α的含量，免疫組化觀察大鼠視網膜內核轉錄因子κB（NF-κB）的表達水平。結果與正常組比較，糖尿病組大鼠視網膜內IL-6、TNF-α、VEGF的蛋白表達增加；血清IL-6、TNF-α表達增加，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與糖尿病組比較，PDC低、中、高各劑量組大鼠視網膜內IL-6、TNF-α的蛋白表達明顯降低，血清IL-6、TNF-α的表達降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PDC各劑量組之間各指標兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。免疫組化切片觀察，正常大鼠視網膜未見明顯NF-κB陽性染色，糖尿病組大鼠視網膜內NF-κB表達高于正常組，與糖尿病組比較，PDC各劑量組NF-κB表達降低。結論PDC可以降低糖尿病視網膜病變大鼠體內炎癥因子（IL-6、TNF-α）的表達，進而抑制VEGF表達上調。其作用機制可能與NF-κB通路有關。

糖尿病視網膜病變；PDC；炎癥因子；NF-κB

多項研究證實，糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy DR）是一種慢性亞臨床低度炎癥性疾病〔1〕。早期改變以白細胞黏附、聚集及移行、血管通透性增加、血-視網膜屏障（blood-retina barrier，BRB）破壞為病理特征，最終誘導VEGF表達上調，促使視網膜內新生血管的形成〔2〕，進一步加速DR的惡化，影響患者視力。因此，對DR患者早期進行抗炎治療有可能為預防DR進一步發(fā)展及治療提供一個新的思路。石斛作為傳統(tǒng)名貴中草藥具有低毒性的特性，其化學成分和藥理活性逐漸引起人們的關注，多糖是石斛屬植物中主要的藥用活性成分之一，研究表明鐵皮石斛多糖（polysaccharides of dendrobium candidum，PDC）提取物具有抗炎作用〔3〕。為此，我們觀察PDC對糖尿病大鼠視網膜及血清中炎癥因子表達水平的影響，探討PDC應用于DR的抗炎作用及機制，為DR的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠50只，雄性，體質量120～160 g，購自上海市斯萊克動物實驗公司。

1.2 藥品與試劑

PDC購自長沙中仁生物有限公司，褐色粉狀，經上海中醫(yī)藥大學藥理實驗室鑒定多糖含量50%。使用前用生理鹽水分別溶解為25 mg/ml、50 mg/ml、75 mg/ml。鏈脲佐菌素（STZ）（美國sigma公司）、血糖儀及試紙（美國強生公司）、單克隆兔抗腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體，單克隆兔抗白細胞介素-6（IL-6）抗體（英國Abcam公司），單克隆兔抗血管內皮生長因子（VEGF）抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗大鼠核轉錄因子κB（NF-κB）p65抗體（美國Sigma公司），大鼠IL-6、TNF-α ELLSA試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）。

1.3 實驗分組

將實驗動物隨機分為正常組、糖尿病組、PDC低劑量組、PDC中劑量組、PDC高劑量組，每組10只。

1.4 造模及標本提取方法

50只雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，禁食不禁水12 h，新配制的鏈脲佐菌素溶液按照55 mg/kg的劑量，對糖尿病組、PDC低劑量組、PDC中劑量組、PDC高劑量組行腹腔注射，正常組大鼠行等量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。72 h后尾靜脈取血測血糖，如血糖≥16.7 mmol/L則認為糖尿病大鼠模型成功。造模成功后，不用胰島素及其它任何藥物干預，不控制飲食飲水。喂養(yǎng)6周后，PDC低、中、高各劑量組予PDC灌胃，劑量分別為100、200、300 mg/（kg·d）；正常組和糖尿病組等量灌胃生理鹽水。標本提取和各項試驗在藥物干預8周后進行。

1.5 實驗方法及檢測指標

取所需試驗鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，開腹，腹主動脈取血。3 000～4 000 r/min，離心10 min，取上清，放4℃冰箱，待測。取雙側眼球，其一固定于福爾馬林溶液，石蠟包埋，用于視網膜組織病理切片；另一去除前節(jié)，顯微鏡下鈍性分離視網膜組織，置于液氮下冷凍儲存，用于Westen blot實驗及酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。

采用Western blot檢測各組大鼠視網膜內IL-6、TNF-α及VEGF的表達差異。使用強細胞裂解液提取各組視網膜總蛋白，以3∶1的比例加入上樣緩沖液并充分混勻，100℃水浴10 min蛋白變性。應用雙辛丁酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定各組視網膜組織總蛋白，按每孔40 μg蛋白量調整上樣，電泳、轉膜，牛血清白蛋白（BSA）封閉1 h，添加相應一抗4℃孵育過夜。TBST洗后用相應二抗常溫孵育1 h，最后顯影定影。采用Image J圖像處理軟件進行灰度分析，以各目的蛋白與其總蛋白的比值表示蛋白的活性水平，即蛋白相對表達量。

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測大鼠血清IL-6、TNF-α的含量。收集各組大鼠血清，每孔100 μl，設復孔，按照大鼠IL-6、TNF-α的ELISA試劑盒說明書進行操作。用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長450 nm下測量光密度D（450 nm），獲取大鼠血清中IL-6及TNF-α的含量。

免疫組化法測定NF-κB的表達。取大鼠眼球做冠狀切片，石蠟脫蠟至水、修復、3%BSA封閉，添加相應一抗4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗后用相應二抗常溫孵育1 h，DAB顯色、復染細胞核、脫水封片。

1.6 統(tǒng)計學方法

SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資

料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示。兩組間比較采用t檢驗，3組或3組以上組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

Western blot法檢測結果顯示，與正常組比較，糖尿病組大鼠視網膜IL-6、TNF-α及VEGF蛋白表達明顯增高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與糖尿病組比較，PDC低劑量組、PDC中劑量組及PDC高劑量組大鼠視網膜IL-6、TNF-α及VEGF蛋白表達均有降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PDC不同劑量組之間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表1，圖1）

表1 Western blot法檢測各組大鼠視網膜IL-6、TNF-α、VEGF蛋白相對表達量比較±s）

表1 Western blot法檢測各組大鼠視網膜IL-6、TNF-α、VEGF蛋白相對表達量比較±s）

注：多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。①與正常組比較，P＜0.05；②與糖尿病組比較，P＜0.05IL-6：白細胞介素-6TNF-α：腫瘤壞死因子αVEGF：血管內皮生長因子PDC：鐵皮石斛多糖

組別樣本量IL-6TNF-αVEGF正常組100.44±0.170.28±0.030.10±0.03糖尿病組101.10±0.20①1.12±0.10①1.33±0.12①PDC低劑量組100.48±0.07②0.47±0.07②0.51±0.08②PDC中劑量組100.64±0.02②0.34±0.08②0.48±0.11②PDC高劑量組100.61±0.12②0.66±0.07②0.60±0.11②F值5.64920.6422.72 P值＜0.05＜0.05＜0.05

圖1 各組大鼠視網膜IL-6、TNF-α及VEGF蛋白的活性水平。A.各組大鼠視網膜IL-6、TNF-α及VEGF蛋白表達的Western blot法檢測電泳圖1.正常組2.糖尿病組3.PDC低劑量組4.PDC中劑量組5.PDC高劑量組。B.各組小鼠視網膜中IL-6、TNF-α及VEGF蛋白的相對表達量比較IL-6：白細胞介素-6 TNF-α：腫瘤壞死因子α VEGF：血管內皮生長因子PDC：鐵皮石斛多糖

ELLSA檢測結果顯示，糖尿病大鼠血清中促炎性細胞因子IL-6、TNF-α含量較正常組有所增加，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PDC低、中、高各劑量組大鼠血清中促炎性細胞因子IL-6、TNF-α含量較糖尿病組均有所降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PDC高劑量組之間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

免疫組化切片結果顯示，正常大鼠視網膜未見明顯NF-κB陽性染色，糖尿病組大鼠視網膜可見神經節(jié)細胞層（GCL）及內核層（INL）均可見陽性染色，PDC各處理組陽性染色明顯減少（圖2）。

3 討論

表2 ELLSA法檢測各組大鼠血清IL-6、TNF-α的含量（±s）

表2 ELLSA法檢測各組大鼠血清IL-6、TNF-α的含量（±s）

注：多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。①與正常組比較，P＜0.05；②與糖尿病組比較，P＜0.05IL-6：白細胞介素-6TNF-α：腫瘤壞死因子αPDC：鐵皮石斛多糖

組別樣本量IL-6TNF-α正常組1023.65±0.833.44±0.06糖尿病組1051.09±2.52①4.33±0.08①PDC低劑量組1027.38±1.23②3.74±0.09②PDC中劑量組1022.17±1.24②3.68±0.08②PDC高劑量組1027.89±1.17②3.70±0.07②F值53.9420.16 P值＜0.05＜0.05

石斛的主要化學成分有多糖類、生物堿類、氨基酸、聯(lián)芐類、菲類、倍半萜類等，其中多糖含量較高〔4〕。有動物研究表明PDC可以抑制促炎性細胞因子（如IL-1β，IL-10，IL-6，IFN-γ等）、粒細胞-巨噬細胞刺激因子（GM-CSF）和粒細胞-集落刺激因子（GCSF）的活性及表達〔5〕，發(fā)揮其抗炎作用。關于PDC

在DR早期的抗炎作用尚無研究。

本研究選取SD大鼠為研究對象，采用STZ腹腔注射誘導糖尿病模型，采用不同方法（Westernblot、ELISA）檢測正常組、糖尿病組及各不同劑量處理組大鼠視網膜及血清中促炎性細胞因子表達水平，進而探索PDC在DR中的抗炎機制及作用。結果表明，與正常組比較，糖尿病組大鼠體內促炎性細胞因子水平表達增加；與糖尿病組比較，PDC各劑量處理組大鼠體內促炎性細胞因子表達水平有所下降。說明PDC可以抑制早期DR促炎性細胞因子的表達，進而抑制VEGF的表達上調。此外，采用Western blot檢測各組大鼠視網膜內NF-κB蛋白表達水平表明，PDC各處理組可以降低NF-κB蛋白表達，其抗炎作用機制可能與其抑制NF-κB途徑的激活有關。本實驗結果顯示，PDC可以降低糖尿病視網膜病變大鼠體內炎癥因子（IL-6、TNF-α）的表達，進而抑制VEGF表達上調。PDC各劑量組間比較，PDC藥效并未呈現(xiàn)明顯量效關系，提高用量可能并不會增加藥物療效。

NF-κB信號通路在DR的發(fā)展過程中起重要作用。在高糖環(huán)境下，晚期糖基化終末產物（AGEs）激活，多種因素導致視網膜氧化應激反應，激活NF-κB并啟動其下游基因轉錄，誘導細胞因子（IL-6、TNF-α等）及黏附分子〔6-7〕相互作用、聚集，引發(fā)視網膜毛細血管阻塞無灌注、內皮損傷、血管滲漏、新生血管形成等病理過程〔2〕。Shakhov等研究證明，若阻斷TNF-α啟動子區(qū)域的NF-κB結合位點，則不能產生TNF-α，提示NF-κB通路在TNF-α產生中起重要作用〔8〕。高糖環(huán)境下，視網膜內高水平的TNF-α、IL-6作用于視網膜微血管，誘導細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表達增加，促進白細胞與血管內皮細胞的黏附，阻塞血管、毛細血管無灌注，破壞血-視網膜屏障〔9-10〕，最終導致視網膜的損害。此外，IL-6還可通過VEGF基因啟動子上特異性DNA序列及5’2非翻譯區(qū)的特異性元件介導并促進VEGF的表達，進一步促進視網膜新生血管的發(fā)生〔11〕。

綜上所述，炎癥機制在DR早期發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，嚴格控制血糖及使用針對炎癥的藥物有益于DR的治療〔12〕。根據(jù)我國學者近年來對石斛的研究發(fā)現(xiàn)，石斛具有抗炎的藥理作用，且藥物毒副作用較小，可能為糖尿病視網膜病變早期的抗炎治療提供新的途徑。

圖2 各組大鼠視網膜核轉錄因子κB（NF-κB）免疫組織染色像。A.正常組，未見明顯陽性染色；B.糖尿病組，顯示神經節(jié)細胞層（GCL）及內核層（INL）均可見陽性染色（紅箭，下同）；C.PDC低劑量組；D.PDC中劑量組、E.PDC高劑量組，GCL層可見少許陽性染色PDC：鐵皮石斛多糖

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Effects of polysaccharides of dendrobium candidum on overexpression of inflammatory factors in dia- betic rats with retinopathy

LI Jingwen,LI Guowen,QIN Yu,et al.Bengbu Medical College，Bengbu 233030，China

OBJECTIVE To investigate the influence of polysaccharides of dendrobium candidum（PDC）on overexpression of inflammatory factors in diabetic retinopathy model of rats and its anti-inflammatory effects in early-stage diabetic retinopathy and further to explore the possible mechanism.METHODS The diabetic rat model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin.After 6 weeks,they were administrated with DPC in low dosage[100 mg/（kg·d）],middle dosage[200 mg/（kg·d）]and high dosage[300 mg/（kg·d）].After 8 weeks,these animals were anesthetized for specimen collection.Then the protein expression of Interleuldn-6（IL-6）,tumor necrosis factor-α（TNF-α）and vascular endothelial growth factor（VEGF）were detected by Western blot;the expression of IL-6,TNF-α in the serum of rats were determined by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）; the expression of NF-κB p65 in retina was determined by immunohistochemistry.RESULTS Compared with normal group,the protein level of IL-6,TNF-α and VEGF as well as serum IL-6 and TNF-α in diabetic group were increased（P＜0.05）while these indexes all decreased when compared with diabetic group（P＜0.05）.But each marker showed no differences between three PDC groups（P＞0.05）.There was no positive staining of NF-κB in normal group,and the expression of NF-κB in three DPC groups was significantly lower than counterpart in diabetic group whose digit was higher than normal group. CONCLUSIONS PDC could reduce the expression of inflammatory cytokines（IL-6,TNF-α）in diabetic

diabetic retinopathy;polysaccharides of Dendrobium Candidum（PDC）;inflammatory factors; NF-κB

R285.5

A

1002-4379（2016）01-0007-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.01.003

上海中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合一流學科創(chuàng)新項目基金（2014XK003）

1蚌埠醫(yī)學院（現(xiàn)在上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院眼科），安徽省

蚌埠市233030

2上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院，200082

李春霞，E-mail：cxli_66@163.com

retinopathy rats,and inhibit the VEGF expression.The mechanism might be associated with NF-κB pathway．