王 瑞，張 婧，陳 瑜，甄 偉，于 磊，冷 嬋，葛紅衛(wèi)

(北京市紅十字血液中心檢驗(yàn)科 100088)

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·論 著·

HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)灰區(qū)設(shè)置研究*

王 瑞，張 婧，陳 瑜，甄 偉，于 磊，冷 嬋，葛紅衛(wèi)△

(北京市紅十字血液中心檢驗(yàn)科 100088)

目的 評價(jià)與驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)室乙型肝炎表面抗原(HBsAg)試驗(yàn)設(shè)置0.9倍臨界值(CO值)的合理性。方法 參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)發(fā)布的EP12-A2指南，通過試驗(yàn)確定HBsAg試驗(yàn)C5～C95區(qū)間即灰區(qū)。對HBsAg灰區(qū)標(biāo)本進(jìn)行抗體確認(rèn)試驗(yàn)。繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)確定HBsAg試驗(yàn)最佳CO值。通過實(shí)驗(yàn)室既往數(shù)據(jù)，分析乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)單陽性標(biāo)本酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)結(jié)果分布(S/CO值)與灰區(qū)的關(guān)系。結(jié)果 (C50±20%)水平檢測結(jié)果陰性數(shù)和陽性數(shù)均大于或等于95%，(C50-20%)～(C50+20%)水平范圍包含C5～C95區(qū)間，灰區(qū)范圍應(yīng)在0.712～1.103倍CO值區(qū)間內(nèi)。對44例HBsAg灰區(qū)標(biāo)本(S/CO值0.900～0.990)進(jìn)行中和試驗(yàn)，結(jié)果均為無反應(yīng)性。繪制HBsAg的ROC曲線，曲線下面積(AUC)為0.981，最適CO值為0.063(現(xiàn)用CO值在0.055～0.060)。2010年11月2日至2013年12月31日檢測標(biāo)本研究886 291例患者,HBsAg陽性標(biāo)本包括135例灰區(qū)標(biāo)本，其中7例核酸檢測法(NAT)檢測結(jié)果均為反應(yīng)性；共檢出HBV-DNA單陽性標(biāo)本421例，其HBsAg檢測結(jié)果(S/CO值)分布區(qū)間為0.200～0.400，與陰性標(biāo)本分布區(qū)間重疊、距0.9倍CO值較遠(yuǎn)。結(jié)論 該實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)階段HBsAg試驗(yàn)設(shè)置0.900的CO灰區(qū)過于嚴(yán)苛，試驗(yàn)結(jié)果支持取消灰區(qū)設(shè)置。報(bào)道所提供的4種灰區(qū)評價(jià)方法為其他實(shí)驗(yàn)室在設(shè)置ELISA試驗(yàn)灰區(qū)方面提供了1種思路。

乙型肝炎； 酶聯(lián)免疫吸附測定； 核酸試驗(yàn)； 灰區(qū)； 臨界值

乙型肝炎病毒(HBV)主要經(jīng)血液和血制品傳播，HBV檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、化學(xué)發(fā)光法、核酸檢測法(NAT)等。由于ELISA試驗(yàn)具有價(jià)格低廉、試驗(yàn)時(shí)間短、操作步驟相對簡單等優(yōu)點(diǎn)，是國內(nèi)血站篩查實(shí)驗(yàn)室檢測乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的主要方法[1-2]。ELISA檢測結(jié)果常以陰性和陽性判斷，但實(shí)際檢測工作中經(jīng)常會遇到某些獻(xiàn)血者血液標(biāo)本光密度值接近臨界值(CO值)的灰區(qū)標(biāo)本。為防止弱陽性標(biāo)本漏檢，最大限度確保血液安全，很多實(shí)驗(yàn)室設(shè)立了“灰區(qū)”，將檢測值大于或等于灰區(qū)界限值標(biāo)本判定為陽性，其血液做報(bào)廢處理。但大多試劑生產(chǎn)商并未提供灰區(qū)界限值，各血站實(shí)驗(yàn)室對灰區(qū)的理解及判定規(guī)則也未達(dá)成共識[3]。隨著核酸檢測的逐步推廣，ELISA設(shè)置灰區(qū)的效能應(yīng)重新進(jìn)行評估。本研究以CO值驗(yàn)證、灰區(qū)標(biāo)本確認(rèn)試驗(yàn)、繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)、ELISA結(jié)果與NAT結(jié)果比對分析，評價(jià)4種方法對HBsAg灰區(qū)設(shè)置的合理性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 來自本中心無償獻(xiàn)血者標(biāo)本，包括肝素抗凝標(biāo)本(ELISA檢測用)、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝標(biāo)本(NAT檢測用)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 試劑 HBsAg診斷試劑盒，購自生物梅里埃中國有限公司，批號20120402、20120605。核酸診斷試劑盒，購自諾華診斷公司，聯(lián)檢試劑批號598605，HBV-DNA鑒別試劑批號598605。HBsAg確認(rèn)試劑盒，購自生物梅里埃中國有限公司，批號B12EA。

1.2.2 質(zhì)控品 每次進(jìn)行HBsAg試驗(yàn)采用外部質(zhì)控品，質(zhì)控品購自北京康徹斯坦生物有限公司，0.2 U/mL，批號201108003；每次進(jìn)行NAT聯(lián)檢試驗(yàn)和HBV-DNA鑒別采用外部質(zhì)控品，質(zhì)控品購自北京康徹斯坦生物有限公司，30 U/mL，批號2013010019。

1.2.3 儀器 HBsAg檢測采用全自動標(biāo)本處理系統(tǒng)STAR 8CH、全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)FAME 24/30(哈美爾頓公司)；NAT聯(lián)檢試驗(yàn)和HBV-DNA檢測采用全自動核酸檢測分析系統(tǒng)Tigris(諾華診斷公司)。

1.3 方法

1.3.1 依據(jù)EP12-A2《定性試驗(yàn)評價(jià)方法用戶協(xié)議：提議指南》[4-6]，確定HBsAg試驗(yàn)C5～C95水平(灰區(qū))。(1)確定HBsAg試驗(yàn)CO值分析物水平(C50)：由于試劑盒說明書中未提及C50水平，試劑生產(chǎn)廠商未提供C50標(biāo)本，故采用EP12-A2文件方案中推薦的層級稀釋方法尋找C50水平標(biāo)本。收集HBsAg試驗(yàn)結(jié)果S/CO值大于1.000的陽性標(biāo)本進(jìn)行梯度稀釋，重復(fù)檢測各稀釋度標(biāo)本8次，得到陰性、陽性結(jié)果概率各占50%的稀釋度，以此作為試驗(yàn)本方法的C50水平，再對該稀釋度標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(n=40)，以驗(yàn)證選定C50的可靠性。(2)確定HBsAg試驗(yàn)C5～C95(灰區(qū))：為驗(yàn)證HBsAg的CO值水平血清的穩(wěn)定性，找出試驗(yàn)方法的灰區(qū)，配置(CO±20%)的水平標(biāo)本，確定C5和C95水平(灰區(qū))。

1.3.2 灰區(qū)標(biāo)本確證試驗(yàn) 收集HBsAg灰區(qū)標(biāo)本(S/CO為0.900～0.990)44例，進(jìn)行中和試驗(yàn)。以試劑盒診斷標(biāo)準(zhǔn)作為判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表達(dá)為反應(yīng)性、無反應(yīng)性2種。

1.3.3 繪制ROC曲線確定HBsAg試驗(yàn)最適檢測CO值 (1)陽性標(biāo)本來源：挑選本實(shí)驗(yàn)室2011年6月至2012年2月常規(guī)檢測中HBsAg檢測陽性標(biāo)本486例，其中含HBsAg弱陽性標(biāo)本50例(S/CO值0.900～1.500)，進(jìn)行中和試驗(yàn)。(2)陰性標(biāo)本來源：HBsAg及NAT檢測均為陰性標(biāo)本292例。(3)繪制ROC曲線，選擇最適CO值：以中和試驗(yàn)結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”結(jié)果，以檢測光密度值為統(tǒng)計(jì)變量，繪制ROC曲線分析。選擇Youdon指數(shù)最大的截?cái)帱c(diǎn)對應(yīng)的界值作為試驗(yàn)最適CO值，與現(xiàn)用CO值進(jìn)行比較，確定灰區(qū)范圍[7-8]。

1.3.4 HBsAg陽性、HBV-DNA陽性標(biāo)本結(jié)果分析 (1)統(tǒng)計(jì)2010年11月2日至2013年12月31日HBV-DNA鑒別試驗(yàn)單陽性即“窗口期”或隱匿性乙型肝炎標(biāo)本檢測情況?！按翱谄凇被螂[匿性乙型肝炎標(biāo)本的HBsAg檢測結(jié)果分布距離灰區(qū)設(shè)定值越近，說明灰區(qū)設(shè)置越合理；“窗口期”或隱匿性乙型肝炎標(biāo)本的HBsAg檢測結(jié)果分布距離陰性標(biāo)本分布區(qū)間越近，說明灰區(qū)設(shè)置功效越差。(2)統(tǒng)計(jì)2010年11月2日至2013年12月31日期間，HBsAg灰區(qū)標(biāo)本核酸檢測情況?；覅^(qū)標(biāo)本內(nèi)HBV-DNA陽性檢出率越高說明灰區(qū)設(shè)置越合理，反之則說明灰區(qū)設(shè)置功效越差。

1.4 質(zhì)量控制 每次試驗(yàn)外部質(zhì)控品或內(nèi)部質(zhì)控對照，檢測結(jié)果與預(yù)期一致，確認(rèn)檢測系統(tǒng)可靠。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié) 果

2.1 依據(jù)EP12-A2，確定HBsAg C5、C95水平(灰區(qū))

2.1.1 對初次試驗(yàn)制備C50水平標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn) 見表1。檢測結(jié)果合計(jì)陽性25例，陰性15例。符合EP12-A2中陽性數(shù)量應(yīng)為14～26例的要求，將此稀釋度標(biāo)本作為C50水平標(biāo)本進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 C50水平驗(yàn)證檢測結(jié)果(n=40)

2.1.2 采用C50稀釋度標(biāo)本 按體積比配制(C50+20%)水平、(C50-20%)水平標(biāo)本各40例，其檢測結(jié)果分別為(C50+20%)水平標(biāo)本陽性40例，陽性率100%，S/CO均值1.103；(C50-20%)水平標(biāo)本陰性40例，陰性率100%，S/CO均值0.712。由于檢測結(jié)果陰性數(shù)和陽性數(shù)大于或等于95%，(-20%)～(+20%)水平范圍包含了C5～C95區(qū)間，灰區(qū)范圍落在0.712～1.103倍CO值區(qū)間內(nèi)。見圖1。

圖1 (C50±20%)水平標(biāo)本檢測結(jié)果分布曲線

2.2 HBsAg灰區(qū)標(biāo)本確證試驗(yàn)檢測結(jié)果 對44例灰區(qū)標(biāo)本(S/CO值0.900～0.990)進(jìn)行中和試驗(yàn)，結(jié)果均為無反應(yīng)性。

2.3 繪制ROC曲線確定HBsAg試驗(yàn)最適檢測CO值 以中和試驗(yàn)結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”結(jié)果，以檢測光密度值為統(tǒng)計(jì)變量,繪制ROC曲線。ROC曲線下面積(AUC)為0.981，選擇Youdon指數(shù)最大的截?cái)帱c(diǎn)對應(yīng)的界值作為試驗(yàn)最適CO值為0.063，而試劑廠商建議CO值在0.055～0.060，最適CO值已大于廠商推薦CO值。見圖2。

圖2 ROC曲線

2.4 對HBsAg陽性、HBV-DNA陽性標(biāo)本結(jié)果分析

2.4.1 實(shí)驗(yàn)室在2010年11月2日至2013年12月31日檢測標(biāo)本886 291例，共檢出HBsAg“窗口期”或乙型肝炎隱匿性感染標(biāo)本共計(jì)421例，且421例標(biāo)本HBsAg檢測結(jié)果S/CO值均小于0.900，其中287例(占68.17%)HBsAg檢測結(jié)果S/CO值位于0.200～0.400?！按翱谄凇被蛞倚透窝纂[匿性感染標(biāo)本相應(yīng)HBsAg檢測結(jié)果距0.9倍灰區(qū)CO值較遠(yuǎn)，與陰性標(biāo)本分布區(qū)間重疊，說明灰區(qū)設(shè)置功效較差。見圖3。

圖3 HBsAg陽性組、HBV-DNA陽性組ELISA結(jié)果(S/CO值)分布圖

2.4.2 實(shí)驗(yàn)室在2010年11月2日至2013年12月31日檢測標(biāo)本886 291例，HBsAg陽性中包括135例灰區(qū)標(biāo)本，其中7例NAT檢測結(jié)果均為陽性。

3 討 論

我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)。乙型肝炎是目前流行最廣泛、危害最嚴(yán)重的病毒性肝炎之一。HBV可經(jīng)血液和血液制品傳播，《世界衛(wèi)生組織血液篩查建議書》將HBV作為血液篩查實(shí)驗(yàn)室必檢項(xiàng)目之一[9]。由于ELISA具有價(jià)格低廉、試驗(yàn)時(shí)間短、操作步驟相對簡單等優(yōu)點(diǎn)，是國內(nèi)血站篩查實(shí)驗(yàn)室檢測HBsAg的主要方法。不過，ELISA本身具有一定的局限性、試驗(yàn)過程變異較大。為了防止弱陽性標(biāo)本漏檢，確保輸血安全，防止HBV感染，很多實(shí)驗(yàn)室設(shè)立了“灰區(qū)”。血液篩查實(shí)驗(yàn)室是否應(yīng)該設(shè)置灰區(qū)、如何設(shè)置灰區(qū)還存在一定爭議[10-11]。依據(jù)ISO15189的要求，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對檢測系統(tǒng)的分析性能和(或)診斷性能的重要參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。ELISA的醫(yī)學(xué)決定水平(如改變CO值設(shè)置灰區(qū))，應(yīng)有科學(xué)依據(jù)并經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室檢測系統(tǒng)驗(yàn)證。

針對方法本身及實(shí)驗(yàn)室設(shè)備情況，參考其他實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)室將ELISA檢測HBsAg方法灰區(qū)設(shè)定為0.9倍CO值。隨著ELISA檢測試劑性能不斷提高、試驗(yàn)過程管理的精細(xì)化及NAT技術(shù)的引入，此背景下應(yīng)重新評估在灰區(qū)判定值存在的合理性及有效性。采用4種方法對本實(shí)驗(yàn)室HBsAg灰區(qū)判定值進(jìn)行評價(jià)。(1)依據(jù)EP12-A2評價(jià)方法的精密度：結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室ELISA檢測HBsAg試驗(yàn)具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，因此將灰區(qū)界定在0.712～1.103倍CO值區(qū)間可確保檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，現(xiàn)有灰區(qū)判定值0.9倍CO值符合其要求。(2)對44例灰區(qū)標(biāo)本進(jìn)行中和試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)有陽性結(jié)果，提示應(yīng)重新審視現(xiàn)用灰區(qū)判定值設(shè)置的必要性。(3)采用ROC曲線確定HBsAg試驗(yàn)最適診斷CO值：結(jié)果顯示，ROC曲線下面積為0.981，說明本方法準(zhǔn)確性較高；選擇Youdon指數(shù)最大的截?cái)帱c(diǎn)對應(yīng)的界值作為試驗(yàn)最適CO值為0.063，而試劑廠商建議CO值在0.055～0.060，最適CO值已大于廠商推薦CO值，無必要再增設(shè)灰區(qū)。(4)本實(shí)驗(yàn)室自2010年11月起對獻(xiàn)血者標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行ELISA檢測和NAT檢測，經(jīng)對既往數(shù)據(jù)分析獲知，421例乙型肝炎窗口期或隱匿性感染標(biāo)本相應(yīng)ELISA結(jié)果與陰性結(jié)果分布區(qū)間重疊，灰區(qū)判定值設(shè)定未起到防止漏檢的功效。由此可見，灰區(qū)不可能解決“窗口期”問題，引入更高級檢測技術(shù)才是解決問題的關(guān)鍵所在。綜上所述，本研究采用4種方法對現(xiàn)用HBsAg灰區(qū)設(shè)置進(jìn)行評價(jià)，結(jié)論為本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)階段HBsAg試驗(yàn)設(shè)置0.9倍CO值灰區(qū)過于嚴(yán)苛，試驗(yàn)結(jié)果支持取消灰區(qū)設(shè)置。

盡管灰區(qū)設(shè)定的初衷是加強(qiáng)血液安全，但由于各實(shí)驗(yàn)室的依據(jù)及尺度不同，部分實(shí)驗(yàn)室存在“過度檢驗(yàn)”現(xiàn)象。在血液短缺的背景下，造成血液資源不合理浪費(fèi)、損傷獻(xiàn)血者積極性、增加獻(xiàn)血者心理負(fù)擔(dān)等。隨著實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范化、檢測過程控制精細(xì)化及核酸檢測技術(shù)的引入，檢測方法和策略發(fā)生了重大變化，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)重新審視試驗(yàn)灰區(qū)，確保其必要性、科學(xué)性和合理性。

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The discussion of method for grey area of HBsAg enzyme linked immunosorbent assay*

WANGRui,ZHANGJing,CHENYu,ZHENWei,YULei,LENGChan,GEHongwei△

(DepartmentofClinicalLaboratory,BeijingRedCrossBloodCenter,Beijing100088,China)

Objective To evaluate and verify the rationality of grey area of HBsAg enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) in the laboratory.Methods According to CLIS EP12-A2 guide,HBsAg concentration of the range between C5 and C95 concentration were determined as grey area by ELISA test.Samples of HBsAg in grey area were identified by ELISA.Using ROC curve analysis,the optimal CO level of HBsAg test was determined.Combined with previous data,the relationship between disposition of HBV-DNA single positive simple of ELISA results(S/CO value) and grey area were explored.Results Positive and negative results of (C50±20%) concentration were all higher than 95%.(C50-20%) to (C50+20%) concentration range included C5 to C95,gray area of S/CO value was 0.712 to 1.103 times of CO.Forty four cases of HBsAg ELISA grey area samples(S/CO value was 0.900 to 0.990) were confirmed negatively by neutralization confirmatory test.According to ROC curve analysis,AUC was 0.981,the optimal CO level was 0.063(CO level in use was 0.055 to 0.060).And 886 291 samples were tested since November 2,2010 to December 31,2013 in our lab,including 135 grey area samples which were tested out in HBsAg positive samples.Seven samples were reactive by NAT test.A total of 421 cases were HBV-DNA single positive simples,and their distribution interval of ELISA results(S/CO value) were between 0.200 and 0.400,which overlapped the distribution interval of ELISA negative samples and far from 0.9 times of CO level.Conclusion The setting of grey area(0.9 times of CO level) is too strict for the lab,the grey area could be cancelled based on experimental data.In addition,the four evaluation methods of grey area we offered will give other labs idea for setting ELISA grey area.

hepatitis B virus; enzyme linked immunosorbent assay; nucleic acid test; grey area; cut off value

國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目(201002005)；北京市紅十字血液中心中心級課題(BRCBC2012-009)。

王瑞，女，主管技師，主要從事血液傳染病篩查、血站實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理方面的研究。

△通訊作者，E-mail:hwge88@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.003

A

1673-4130(2016)21-2956-03

2016-01-29

2016-04-19)