張小芳，栗瑞敏，張運(yùn)剛，李守霞

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 056001)

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·論 著·

急性雙表型白血病細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫表型的研究

張小芳，栗瑞敏，張運(yùn)剛，李守霞△

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 056001)

目的 探討骨髓細(xì)胞免疫表型在急性雙表型白血病中的診斷價(jià)值及其與骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)的比對(duì)研究。方法 對(duì)190例急性白血病患者采用流式細(xì)胞儀四色免疫熒光直接標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞免疫表型，通過骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)分型進(jìn)行分析。采用流式細(xì)胞術(shù)四色免疫熒光直接標(biāo)記技術(shù)與CD45/SSC設(shè)門分析技術(shù)檢測(cè)11例雙表型急性白血病患者，根據(jù)歐洲白血病免疫分類協(xié)作組(EGIL)積分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行免疫學(xué)分型。結(jié)果 190例急性白血病中被免疫分型診斷為急性髓系白血病88例(占46.3%),急性淋系白血病88例(占46.3%),未分化白血病3例(占1.6%)，與骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)診斷具有高符合率。190例急性白血病中被免疫分型診斷為急性雙表型白血病11例(占5.8%)，其中髓系與B系共表達(dá)的抗原7例(占3.7%)，均共同表達(dá)cCD79a和cMPO，胞膜抗原CD19和CD10表達(dá)量較高；髓系與T系共表達(dá)的抗原3例(占1.6%)，均共同表達(dá)cCD3和cMPO，胞膜抗原CD5和CD7表達(dá)量較高；髓系、B系與T系均表達(dá)的抗原1例(占0.5%)。此外，急性雙表型白血病患者高表達(dá)CD34胞膜抗原(占81.8%)，提示預(yù)后不良。結(jié)論 急性雙表型白血病發(fā)病率較低，骨髓細(xì)胞免疫表型對(duì)診斷及鑒別雙表型急性白血病有特異性,以髓系和B系抗原共表達(dá)為主。采用骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合檢測(cè)急性雙表型白血病可提高診斷準(zhǔn)確性，能有效地指導(dǎo)臨床制訂治療方案和進(jìn)行預(yù)后判斷。

急性雙表型白血?。?流式細(xì)胞術(shù)； 免疫表型； 抗原； 熒光標(biāo)記技術(shù)； 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

長(zhǎng)期以來，臨床上根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)染色進(jìn)行分型診斷，但其分型結(jié)果已無法滿足目前臨床對(duì)白血病的診斷要求，尤其對(duì)于某些發(fā)病率低、治療困難的急性白血病，如急性雙表型白血病(BAL)。BAL是1種少見類型的白血病，男性多于女性，目前國(guó)內(nèi)外BAL發(fā)病率較低并缺乏系統(tǒng)研究，要切實(shí)把握并作出正確診斷十分困難。本研究采用骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)聯(lián)合檢測(cè)190例急性白血病患者進(jìn)行免疫學(xué)分型特點(diǎn)，探討骨髓細(xì)胞免疫表型對(duì)BAL未分化型及伴系表達(dá)白血病的診斷及鑒別診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年1月至2015年5月在邯鄲市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科結(jié)合骨髓涂片和FCM檢測(cè)確診為急性白血病患者190例，年齡6～68歲；男90例，女77例，平均年齡(39.7±0.5)歲。

1.2 儀器與試劑 美國(guó)BD Biosciences公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)(FACS) Cabibur雙激光四色分選流式細(xì)胞儀、渦旋混勻器和離心機(jī)；熒光標(biāo)記的單克隆抗體、FACS溶血素、FACS破膜劑均購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。

1.3 方法

1.3.1 原理 采用FCM檢測(cè)急性白血病抗原的表達(dá)，將單克隆抗體與骨髓細(xì)胞共孵育，裂解紅細(xì)胞，洗滌固定后上機(jī)檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，人為因素的影響小，檢測(cè)敏感性高、準(zhǔn)確性好，能提高急性白血病的診斷率，降低誤診率。

1.3.2 標(biāo)本制備 無菌條件下行骨髓穿刺，抽取0.3 mL骨髓液，涂7張片備用；再抽取骨髓細(xì)胞液1～2 mL加到肝素鈉抗凝的真空采血管中顛倒混勻，置4 ℃冰箱保存，48 h內(nèi)做FCM檢測(cè)。

1.3.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查 細(xì)胞涂片經(jīng)瑞氏-姬姆薩混合染液染色，在油鏡(1 000倍)下分類計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，按法、美、英分型(FAB分型)。每例患者的骨髓涂片均加做糖原(PAS)和過氧化物酶(POX)染色，細(xì)胞化學(xué)染色方法按本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)染色進(jìn)行。骨髓涂片重點(diǎn)觀察骨髓細(xì)胞的增生程度、各系形態(tài)、分化程度及有無成簇分布現(xiàn)象[1-2]。

1.3.4 FCM檢測(cè) 采用美國(guó)BD公司FACS Cabibur雙激光四色分選流式細(xì)胞儀，Cell quest軟件熒光定量分析。每例標(biāo)本分析15 000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞在波長(zhǎng)488 nm處檢測(cè)PE的紅熒光和FITC的綠熒光，分別通過575 nm和513 nm濾光片收集，Percp的熒光通過635 nm濾光片收集。采集CD45/SSC設(shè)門，分析幼稚細(xì)胞群及成熟各系細(xì)胞群，經(jīng)FSC、SSC、McAb1-FITC、McAb2-PE、CD45- Percp、McAb3-APC共6個(gè)參數(shù)分析，確定免疫表型。單克隆抗體來源熒光標(biāo)記的單克隆抗體包括T、B、髓系細(xì)胞系列，用2個(gè)系列或階段特異性單抗加CD45進(jìn)行四色熒光染色。單克隆抗體有：B淋巴細(xì)胞白血病包括CD20、kappa、lambda、CD19、cCD79a、CD22、CD10、cIgM； T淋巴細(xì)胞白血病包括CD4、CD8、CD3、cCD3、CD2、CD5、CD7、CD1a、TCR；NK淋巴細(xì)胞白血病包括CD16、CD56，CD57；髓系白血病包括c MPO、CD117、CD14、CD13，CD33，CD15，CD11b，CD64，CD36，CD11c；紅白血病包括GlyA(血型糖蛋白A)；巨核細(xì)胞白血病包括CD41，CD42，CD61；白血病系列非特異性抗原包括CD34，CD38，HLA-DR。按FCM常規(guī)方法標(biāo)記表面抗原和胞內(nèi)抗原。

1.3.5 BAL診斷標(biāo)準(zhǔn) BAL的診斷標(biāo)準(zhǔn)：世界衛(wèi)生組織推薦采用修改后的歐洲白血病免疫分類協(xié)作組(EGIL)積分標(biāo)準(zhǔn)[3]。髓系細(xì)胞和淋巴系細(xì)胞(T、B系中任何1個(gè)系)標(biāo)記各積2分以上便可確診。表面抗原大于20%或胞內(nèi)抗原大于10%即為陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1 急性白血病的骨髓細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn) 所有患者骨髓增生極度活躍或活躍，其中被診斷為急性髓系白血病(AML)90例(占47.4%)、急性淋系白血病(ALL)95例(占50.0%)、未分化白血病3例(占1.6%)、急性混合性白血病2例(占1.0%)。

2.2 急性白血病細(xì)胞免疫表型結(jié)果分析 經(jīng)FCM檢測(cè)，根據(jù)骨髓細(xì)胞特異性抗原的表達(dá)情況，190例急性白血病中被免疫分型診斷為AML 88例(占46.3%)，ALL 88例(占46.3%)和未分化白血病3例(占1.6%)，其與骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)診斷具有高符合率。190例急性白血病中被免疫分型診斷為BAL的11例(占5.8%)，其中髓系與B系共表達(dá)的抗原7例(占3.7%)，均共同表達(dá)cCD79a和cMPO，胞膜抗原CD19和CD10表達(dá)量較高；髓系與T系共表達(dá)的抗原3例(占1.6%)，均共同表達(dá)cCD3和cMPO，胞膜抗原CD5和CD7表達(dá)量較高；髓系、B系與T系均表達(dá)的抗原1例(占0.5%)。見表1。此外，BAL患者高表達(dá)CD34胞膜抗原(81.8%)，提示預(yù)后不良。見表2。

表1 11例BAL免疫分型結(jié)果(n)

表2 CD34免疫分型結(jié)果

3 討 論

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)白血病的臨床診斷多采用細(xì)胞形態(tài)、免疫學(xué)等檢測(cè)方法，可區(qū)分為AML或ALL，但有3%～8%急性白血病在同一白血病細(xì)胞群同時(shí)表達(dá)髓系和淋系相關(guān)抗原，依據(jù)免疫表型被診斷為BAL[4-7]。例如早期前體T細(xì)胞ALL免疫特征為CD7和CD3的強(qiáng)表達(dá)，同時(shí)異常表達(dá)CD11b、CD13、CD33、CD117和CD34等某些髓系抗原，治療上應(yīng)予以考慮[8-10]。本院診治的190例急性白血病，其中BAL有11例，占5.8%。本研究11例BAL患者中，骨髓細(xì)胞學(xué)和化學(xué)染色考慮為急性混合性白血病的2例，AML的2例(M5b1例，M4b1例)，ALL的7例(L1型5例，L2型2例)，但被免疫表型檢測(cè)后均診斷為BAL。BAL原始細(xì)胞形態(tài)并不一致，可能表現(xiàn)出髓系分化特征或顯示淋系/未分化細(xì)胞形態(tài)特征；BAL原始細(xì)胞起源于早期造血干祖細(xì)胞，通過形態(tài)學(xué)檢測(cè)很難識(shí)別未分化或微分化的原始細(xì)胞類別。免疫表型可對(duì)BAL免疫分型進(jìn)行有效區(qū)分,能全面、特異、準(zhǔn)確地檢測(cè)出細(xì)胞抗原分布情況，依據(jù)細(xì)胞表達(dá)的抗原判定細(xì)胞的來源和良惡性，有利于指導(dǎo)臨床制訂治療方案和進(jìn)行預(yù)后判斷[11]。因此，急性白血病的分型診斷必須結(jié)合免疫表型、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和化學(xué)染色進(jìn)行綜合分析。BAL免疫表型具有異質(zhì)性，包括髓系/B系、髓系/T系、髓系/B系/T系和B系/T系4種表型，大多數(shù)研究報(bào)道表明，約70%的BAL患者為髓系/B系，23%～30%的患者為髓系/T系表型，髓系/B系/T系和B系/T系表型極少見[12]。本研究經(jīng)FCM檢測(cè)顯示，BAL的免疫分型中最常見為髓系/B系分化抗原的混合表達(dá)(占63.6%)；其次為髓系/T系分化抗原的混合表達(dá)(占27.2%)；少見髓系/B系/T系分化抗原的混合表達(dá)(僅1例，占9.1%)，與相關(guān)報(bào)道一致。髓系與B系共表達(dá)的抗原7例，均共同表達(dá)cCD79a和cMPO，胞膜抗原CD19和CD10表達(dá)量較高；髓系與T系共表達(dá)的抗原3例，均共同表達(dá)cCD3和cMPO，胞膜抗原CD5和CD7表達(dá)量較高。在本研究中，BAL細(xì)胞CD34陽(yáng)性率高達(dá)81.8%，與同時(shí)期診斷的AML(占33.0%)和ALL(占35.2%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其他學(xué)者研究表明，CD34和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的陽(yáng)性率超過80%[13-14]。由于CD34和TdT為干細(xì)胞特有抗原，提示BAL細(xì)胞來源于干、祖細(xì)胞。有研究報(bào)道，CD34陽(yáng)性BAL患者的緩解率顯著低于CD34陰性BAL患者的緩解率，表明CD34陽(yáng)性是BAL預(yù)后不良指標(biāo)[15]。BAL屬特殊類型白血病，有其獨(dú)特臨床生物學(xué)特征，還涉及預(yù)后和治療等復(fù)雜問題，不能僅對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)單診斷。因此，結(jié)合免疫表型、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和化學(xué)染色對(duì)急性白血病患者進(jìn)行綜合分析可最大程度減少結(jié)果判斷的主觀性，可提高結(jié)果判斷準(zhǔn)確性，是1種可確診BAL的簡(jiǎn)單方法。

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Analysis of cell morphology and immunophenotype in patients with biphenotypic acute leukemia

ZHANGXiaofang,LIRuimin,ZHANGYungang,LIShouxia△

(DepartmentofClinicalLaboratory,HandanCentralHospital,Handan,Hebei056001,China)

Objective To discuss the diagnostic value of myeloid immunophenotype in detection the biphenotypic acute leukemia(BAL) and to compare the value with morphology of bone marrow cells.Methods Immunophenotype of 190 patients with acute leukemia(AL) were detected by four-color direct immunofluorescence staining methods of flow cytometry(FCM).And by morphology of bone marrow cells,the immunophenotype were analyzed.Four-color direct immunofluorescence staining methods combined with CD45/SSC gating analysis was used to analyze immunophenotype of 11 cases with BAL according the standard score of EGIL.Results Among 190 cases with AL,88 cases were acute myeloid leukemia(AML),which accounted for 46.3%,and 88 cases(46.3%) were acute lymphocytic leukemia(ALL) and 3 cases(1.6%) were undifferentiated AL.These results had a high coincidence rate with morphology of bone marrow cell and tissue chemistry diagnosis.Among 190 cases with AL,11 cases(5.8%) were diagnosed of acute BAL.Amomg of them,7 cases(3.7%) expressed of B lymphoid and myeloid together which showed that both cCD79a and cMPO immunophenotyping were expressed,meanwhile the expression of membrane antigen CD19 and CD10 was higher.Three cases(1.6%) expressed T lymphoid and myeloid together which showed that both cCD3 and cMPO immunophenotyping were expressed,and the expression of membrane antigen CD7 and CD5 was higher.Only one case(0.5%) expressed B,T and myeloid.Patients with BAL showed high expression of membrane antigen CD34(81.8%) indicating poor prognosis.Conclusion The incidence of BAL is low and immunophenotype of morphology of bone marrow cells is a very specific diagnosis of BAL.The co-expression of B lymphoid and myeloid antigen is major feature of BAL.Combination detection of morphology of bone marrow cell and flow cytometry in patients with BAL could improve the diagnostic accuracy,which can effectively guide the clinical treatment and judge prognosis.

biphenotypic acute leukemia; flow cytometry;immunophenotype; antigen; fluorescent markers; cell morphology

張小芳，女，主管技師，主要從事免疫學(xué)方面的研究。

△通訊作者，E-mail：xiaofang1118@126.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.018

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1673-4130(2016)21-2999-03

2016-04-30

2016-06-20)