周躍輝，周成林，李翠翠

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運(yùn)動對尼古丁戒斷大鼠抑制能力的影響及機(jī)制

周躍輝，周成林，李翠翠

目的：研究尼古丁戒斷期運(yùn)動干預(yù)對大鼠抑制能力和大腦α7煙堿乙酰膽堿受體(nAChRs)蛋白表達(dá)的影響，以探討抑制能力與尼古丁CPP依賴性和nAChRs蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。方法：30只4周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為安靜組和中等強(qiáng)度運(yùn)動組。采用條件位置偏愛(CPP)建立大鼠尼古丁依賴模型，Go/NoGo范式評價(jià)戒斷大鼠的抑制能力，Western blotting蛋白免疫印跡法檢測前額葉皮層和海馬組織α7 nAChRs蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：1)構(gòu)建了大鼠Go/NoGo范式和尼古丁CPP依賴性模型。2)與安靜組相比，運(yùn)動組大鼠CPP得分(s)顯著降低(156.27±12.07 vs 83.6±14.85，P<0.01)，Go任務(wù)正確率(%)沒有變化，但NoGo任務(wù)正確率(%)明顯提高(42.67±3.53 vs 63.43±3.92，P<0.01)。3)安靜組和運(yùn)動組大鼠海馬組織a7 nAChRs表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化，而運(yùn)動組大鼠前額葉皮層α7 nAChRs蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(0.7±0.06 vs 1.23±0.1，P<0.01)。4)尼古丁戒斷大鼠的抑制能力與CPP偏好值負(fù)相關(guān)(R2=0.64，P<0.01)，與前額葉皮層α7 nAChRs蛋白表達(dá)水平正相關(guān)(R2=0.44，P<0.05)。結(jié)論：連續(xù)10天的中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動可能通過特異性上調(diào)前額葉皮層a7 nAChRs蛋白表達(dá)，增強(qiáng)尼古丁戒斷大鼠的行為抑制能力，進(jìn)而降低尼古丁依賴性。

運(yùn)動；大鼠；尼古?。粭l件位置偏愛；抑制能力；煙堿乙酰膽堿受體

尼古丁是煙草成癮的主要成分，煙草成癮的實(shí)質(zhì)就是尼古丁成癮。盡管近幾十年預(yù)防醫(yī)療體系在迅速發(fā)展，但尼古丁成癮依舊是全球工業(yè)發(fā)展國家發(fā)病率和死亡率較高的首要原因[4]。尼古丁長期使用可以產(chǎn)生與海洛因或可卡因等毒品一樣強(qiáng)有力的成癮性，嚴(yán)重危害個(gè)人和社會健康。治療尼古丁成癮最大的障礙是戒斷后居高不下的復(fù)吸率，其中，誘發(fā)高復(fù)吸的重要原因之一是戒斷綜合征的存在。在第一個(gè)月戒煙過程出現(xiàn)的各種復(fù)雜的戒斷癥狀中，65%的吸煙者認(rèn)為認(rèn)知改變是最嚴(yán)重的戒斷癥狀[51]。其中，學(xué)習(xí)記憶和抑制能力等認(rèn)知功能障礙是尼古丁戒斷的核心癥狀，它導(dǎo)致機(jī)體對尼古丁的渴求無法控制(尤其因生理和心理依賴產(chǎn)生的渴求)，是誘發(fā)復(fù)吸的重要原因[31,38,42]。復(fù)吸的存在，導(dǎo)致70%尼古丁成癮戒斷者中僅有不到5%的人可以成功戒除[47]。尼古丁成癮神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說認(rèn)為，從最初自主性使用尼古丁到強(qiáng)迫性濫用尼古丁，代表著前額葉皮層對其下行海馬等腦區(qū)的執(zhí)行功能紊亂[14]。執(zhí)行功能包括轉(zhuǎn)換、抑制和刷新3個(gè)子成分，抑制控制是執(zhí)行功能的核心成分[34]。因此，抑制能力受損是尼古丁復(fù)吸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，提高抑制能力可能有助于預(yù)防復(fù)吸。

隨著運(yùn)動鍛煉健身效益的日益凸顯，運(yùn)動作為一種非藥物療法，在神經(jīng)認(rèn)知功能障礙疾病(如腦中風(fēng)、老年癡呆癥、帕金森病和抑郁癥等)中已體現(xiàn)出重要的防治作用[3]。自主轉(zhuǎn)輪運(yùn)動可以明顯改善大鼠前額葉和海馬等腦區(qū)相關(guān)的認(rèn)知損傷，減少成癮性物質(zhì)如酒精和毒品成癮等誘發(fā)的渴求[11,19,33]。中等強(qiáng)度的跑臺運(yùn)動可以顯著降低長期吸煙者的渴求、戒斷癥狀、復(fù)吸和負(fù)面情緒，延緩兩次吸煙的間隔時(shí)間，增加其他戒斷方法的成功率(提升約2～3倍)[2,29]。自主轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(2 h/d，10 d)也可以有效降低大鼠尼古丁成癮的依賴性[43,44]。Janse等人[25,26]一系列的功能核磁共振成像結(jié)果顯示，中等強(qiáng)度運(yùn)動能夠降低尼古丁誘導(dǎo)的前額葉和眶額葉等腦區(qū)的激活程度，而這些腦區(qū)是執(zhí)行功能的神經(jīng)解剖學(xué)基礎(chǔ)[27]，說明運(yùn)動可能參與了尼古丁成癮過程中認(rèn)知控制的改變。大量研究也發(fā)現(xiàn)，中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動可以顯著提高正常成年人的行為抑制能力[1,5]，以及促進(jìn)吸毒者的抑制能力，降低藥物渴求度[49]。Yanagisawa等[52]神經(jīng)影像學(xué)研究明確指出，運(yùn)動強(qiáng)度是影響大腦認(rèn)知和行為反應(yīng)的重要因素。相比起自主轉(zhuǎn)輪運(yùn)動，被動跑臺運(yùn)動能夠精確控制運(yùn)動強(qiáng)度，更好地模擬藥物依賴者不愿運(yùn)動的心態(tài)[30,56]?；谇叭说难芯砍晒狙芯窟x擇中等強(qiáng)度的跑臺運(yùn)動作為干預(yù)方式。

煙堿膽堿能信號廣泛存在于皮層和海馬環(huán)路，nAChRs功能下調(diào)或表達(dá)減少是認(rèn)知障礙的病理性機(jī)制[36]。越來越多的證據(jù)表明，nAChRs是治療阿爾茨海默病、精神分裂癥、抑郁癥、注意力缺陷多動癥和尼古丁成癮等神經(jīng)認(rèn)知障礙的有效靶點(diǎn)[17,46]，激活α7 nAChRs可以顯著改善突觸可塑性，減少前額葉皮層和海馬有關(guān)的認(rèn)知缺陷[36,45]。α7受體基因缺失的小鼠表現(xiàn)出前額葉依賴的注意力缺陷和工作記憶下降[14]，前扣帶回皮層注射α7 nAChRs拮抗劑增加大鼠尼古丁攝取的沖動性[12]。這些研究表明，α7 nAChRs可能對尼古丁戒斷大鼠的抑制能力具有重要作用。

綜上所述，課題組推測中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動能夠通過改善行為抑制能力，降低尼古丁依賴性，運(yùn)動的這種效果可能與前額葉和海馬腦區(qū)α7 nAChRs蛋白表達(dá)水平改變有關(guān)。本研究擬通過建立大鼠尼古丁CPP依賴模型以及大鼠Go/Nogo行為抑制評價(jià)模型，探討中等強(qiáng)度運(yùn)動對尼古丁戒斷大鼠抑制能力的影響和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

4周齡雄性SPF級SD大鼠(n=30)，購買于第二軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK(滬)2008-0016]。大鼠采用馮氏IVC-II型獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具(蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司)飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲食(除Go/NoGo范式訓(xùn)練外)，飼養(yǎng)籠內(nèi)溫度為22.0℃±2℃，相對濕度為50%～60%，12 h明暗交替光照，遵循大鼠日夜生物節(jié)律。

1.2 藥物

尼古丁酒石酸鹽購買于美國Sigma公司(N5260)，用0.9%生理鹽水將其稀釋為0.5 mg/ml，采用頸背部皮下注射，每千克體重注射1 ml體積液體。根據(jù)文獻(xiàn)[20]，尼古丁注射劑量為0.5 mg/kg。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 利用條件位置偏愛(conditioned place preference，CPP)建立大鼠尼古丁依賴動物模型

CPP是評價(jià)成癮性藥物精神依賴性的經(jīng)典范式，實(shí)驗(yàn)裝置及軟件(TWWP-2)購自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。該裝置由3個(gè)箱體構(gòu)成，其中，兩側(cè)的箱體為條件化訓(xùn)練箱(A箱和B箱)，大小相同但底面紋理和側(cè)面燈光圖案不同，作為動物注射尼古丁或鹽水后區(qū)分箱體的依據(jù)；中間的小箱體為過渡箱，抽去其兩側(cè)擋板，大鼠可以在3個(gè)箱子內(nèi)自由穿梭活動。CPP程序分為前測期、條件化訓(xùn)練期和測試期。其中，大鼠在注射尼古丁訓(xùn)練箱(伴藥側(cè))的停留時(shí)間減去注射生理鹽水訓(xùn)練箱(非伴藥側(cè))的停留時(shí)間，即為CPP得分值(s)，作為判斷大鼠是否形成條件化偏好的統(tǒng)計(jì)依據(jù)[20,22]。

前測期：抽去箱體中間擋板，記錄大鼠15 min內(nèi)在各箱體內(nèi)的停留時(shí)間，作為CPP得分的基礎(chǔ)值。剔除明顯偏好任何一箱大于540 s的大鼠[20]。

條件化訓(xùn)練期：大鼠進(jìn)行連續(xù)8個(gè)周期的生理鹽水和尼古丁給藥交替訓(xùn)練(表1)[53]。為了排除給藥順序和箱體環(huán)境差異的影響，尼古丁和生理鹽水注射采用平衡對抗設(shè)計(jì)，即一半大鼠放置A箱注射尼古丁(B箱注射生理鹽水)，一半大鼠放置B箱給藥(A箱注射生理鹽水)。

表1 大鼠尼古丁CPP訓(xùn)練方案一覽表

測試期：抽去箱體擋板，大鼠自由穿梭箱體，觀察并記錄大鼠15 min內(nèi)在兩個(gè)條件化箱的停留時(shí)間。大鼠條件化訓(xùn)練后CPP得分減去前測CPP得分，作為CPP模型是否建立成功的判斷依據(jù)。大鼠運(yùn)動后CPP得分(后測)減去運(yùn)動前(測試期)CPP得分，作為運(yùn)動影響CPP的判斷依據(jù)。1.3.2 Go/NoGo任務(wù)評價(jià)大鼠抑制能力

Go/NoGo任務(wù)是測評中樞神經(jīng)系統(tǒng)執(zhí)行與抑制功能的重要手段，該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購自于寧波安來軟件科技有限公司。配套的LabState軟件可以自動控制燈光和食物投放，記錄整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程和數(shù)據(jù)[54]。為了保持大鼠對食物的渴求，大鼠在完成Go/NoGo條件化訓(xùn)練后攝食，限定每100 g體重每天攝取食物約5 g、飲水約8 ml，以使大鼠達(dá)到85%正常飲食的體重[9]。根據(jù)已有文獻(xiàn)[41]，Go/NoGo任務(wù)流程如圖1所示。

圖1 大鼠Go/NoGo任務(wù)操作程序示意圖

為了讓大鼠熟悉糖水獲取方法和位置，首先進(jìn)行鼻觸-食物孔關(guān)聯(lián)性訓(xùn)練。連續(xù)2天老鼠在30 min內(nèi)鼻觸食物槽獲取100次糖水獎(jiǎng)勵(lì)，該部分訓(xùn)練結(jié)束。其次，箱頂燈亮起，間隔5 s(Intertrial interval，ITI)后，大鼠鼻觸中間孔，若該孔燈“亮”起(Go視覺刺激信號，出現(xiàn)時(shí)間為T1=4 s)，并伴隨食物槽燈亮及0.2 s的“啪”響聲。大鼠轉(zhuǎn)身到對面食物槽獲取一次糖水獎(jiǎng)勵(lì)，該過程為正確反應(yīng)。若大鼠在執(zhí)行時(shí)間T1內(nèi)沒有做出反應(yīng)，則箱頂燈熄滅，伴隨40 s黑暗懲罰；若該孔燈“閃爍”(NoGo視覺刺激信號，出現(xiàn)時(shí)間為T2=4.5 s)，此時(shí)食物槽燈及糖水提供系統(tǒng)不出現(xiàn)反應(yīng)，大鼠轉(zhuǎn)身鼻觸食物槽，則為錯(cuò)誤反應(yīng)。若大鼠在T2時(shí)間內(nèi)沒有轉(zhuǎn)身鼻觸食物槽，則為正確反應(yīng)。100個(gè)試次，其中Go出現(xiàn)75%，NoGo出現(xiàn)25%。建模評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：Go任務(wù)>80%準(zhǔn)確率，NoGo任務(wù)>50%準(zhǔn)確率[36]。

1.3.3 動物分組和運(yùn)動干預(yù)方案

CPP建立大鼠尼古丁依賴模型后，按體重隨機(jī)分為安靜組和運(yùn)動組。針對中等運(yùn)動強(qiáng)度的界定采用乳酸閾測評法[13]，即在遞增負(fù)荷運(yùn)動中，血乳酸濃度急劇上升的起始點(diǎn)，其所對應(yīng)的跑臺速度約為40%～60%最大攝氧量[35]。使用全自動乳酸分析儀(德國EKF公司，BIOSEN C-line)檢測大鼠尾靜脈乳酸濃度。具體方案如圖2所示，尼古丁CPP依賴大鼠乳酸閾強(qiáng)度時(shí)的跑速約為18 m/min。

圖2 大鼠乳酸閾值的測定[37]

按照運(yùn)動降低尼古丁戒斷大鼠渴求度的有效運(yùn)動時(shí)間[43]，選擇運(yùn)動干預(yù)持續(xù)總時(shí)間為10天，每天單次運(yùn)動時(shí)間為30 min(不包括熱身和整理活動)，具體實(shí)驗(yàn)流程如圖3所示。

圖3 實(shí)驗(yàn)流程圖

1.3.4 動物取材及樣本處理

所有動物在行為學(xué)測試結(jié)束24 h后，麻醉處死，0.9%生理鹽水心尖灌注(去除腦組織血液)，剝離大腦，冰上操作，迅速取出前額葉皮層和海馬組織，-80℃保存。

1.3.5 Western blotting檢測腦組織a7 nAChRs表達(dá)水平

BCA 試劑盒(碧云天)檢測腦組織總蛋白濃度，調(diào)整濃度為4 μg/ul。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳(5%濃縮膠，10%分離膠)、PVDF轉(zhuǎn)膜(恒流300 mA，100 min)、5%BD脫脂牛奶封閉(室溫，1 h)、a7 nAChRs一抗(兔多克隆抗體，1∶400，Abcam)4℃過夜、二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，1∶3 000，Cell Signaling)室溫孵育1 h后，加ECL發(fā)光液(Millipore)，天能Tanon 5200 Multi全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)檢測目的蛋白和內(nèi)參GAPDH的灰度值。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動對大鼠尼古丁CPP的影響

尼古丁誘導(dǎo)的條件化位置偏好結(jié)果如圖4A所示，配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)8個(gè)連續(xù)的鹽水/尼古丁交替訓(xùn)練，生理鹽水訓(xùn)練組大鼠沒有產(chǎn)生顯著性的位置偏好，而尼古丁訓(xùn)練組大鼠產(chǎn)生了明顯的位置偏好(P<0.01)，說明重復(fù)的尼古丁條件化訓(xùn)練產(chǎn)生了明顯的位置偏好，建立了大鼠尼古丁CPP依賴模型。

尼古丁CPP依賴大鼠經(jīng)過連續(xù)10天的中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動干預(yù)后，2(組別：安靜組、運(yùn)動組)× 3(測試時(shí)間：前測期、測試期和后測期)重復(fù)測量方差分析發(fā)現(xiàn)(圖4B)，測試時(shí)間對CPP偏好得分的影響十分顯著，F(xiàn)(2，10)=109，P<0.01，Partialη2=0.956。組別主效應(yīng)不顯著。測試時(shí)間與組別的交互效應(yīng)顯著，F(xiàn)(2，22)=8.265，P<0.01，Partialη2=0.429。進(jìn)一步簡單主效應(yīng)分析結(jié)果顯示，安靜組測試期與前測期CPP得分之間存在顯著差異性(P<0.01)，后測CPP得分與測試期CPP得分無顯著性差異。運(yùn)動組前測期、測試期、后測期之間的CPP得分存在顯著差異性(P<0.01，圖4)。

提示，運(yùn)動干預(yù)后，CPP得分減少，大鼠對尼古丁的依賴性降低。

圖4 尼古丁誘導(dǎo)的CPP及運(yùn)動干預(yù)的影響

注：A.尼古丁CPP建模情況，其中*表示與前測相比，P<0.01； B.中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動干預(yù)后CPP形成情況，其中*表示與測試期和后測相比，P<0.01；#表示與測試期相比，P<0.01。

2.2 運(yùn)動對尼古丁戒斷大鼠抑制能力的影響

如圖5A所示，大鼠Go/NoGo任務(wù)中Go任務(wù)正確率高達(dá)87.84%，NoGo正確率為71.52%，均高于該任務(wù)建模標(biāo)準(zhǔn)(Go任務(wù)>80%準(zhǔn)確率，NoGo任務(wù)>50%準(zhǔn)確率)[41]，提示，本研究構(gòu)建的模型可以測評大鼠的抑制能力。

在大鼠經(jīng)過CPP訓(xùn)練和運(yùn)動干預(yù)后，再次測試Go/NoGo任務(wù)，經(jīng)2(組別：安靜組、運(yùn)動組)× 2(任務(wù)類型：Go、NoGo任務(wù))的重復(fù)測量方差分析發(fā)現(xiàn)，Go/NoGo任務(wù)類別主效應(yīng)顯著，F(xiàn)(1，11)=89.002，P<0.01，Partialη2=0.890。組別主效應(yīng)顯著，F(xiàn)(1，11)=16.236，P<0.01，Partialη2=0.596。兩者的交互作用顯著，F(xiàn)(1，11)=9.711，P<0.01，Partialη2=0.469。進(jìn)一步簡單主效應(yīng)分析結(jié)果顯示，安靜組和運(yùn)動組之間的Go任務(wù)正確率沒有顯著性差異(P>0.05)，而兩組之間的NoGo任務(wù)正確率存在顯著差異性，具體表現(xiàn)為運(yùn)動組顯著高于安靜組(P<0.01)。此外，兩組的Go任務(wù)正確率均顯著高于NoGo任務(wù)(P<0.01)。

圖5 運(yùn)動對尼古丁戒斷大鼠Go/NoGo任務(wù)的影響

注：A.Go/NoGo任務(wù)建模情況；B.中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動對尼古丁戒斷大鼠Go/NoGo任務(wù)正確率的影響，其中*表示與安靜組NoGo任務(wù)相比，P<0.01。

2.3 運(yùn)動對尼古丁戒斷大鼠腦組織a7 nAChRs表達(dá)水平的影響

為了探索運(yùn)動提高尼古丁戒斷大鼠抑制能力、抑制CPP形成的可能神經(jīng)機(jī)制，在大鼠尼古丁成癮后戒斷期，讓其進(jìn)行為期10天、每天30min的中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動，然后比較了運(yùn)動組和安靜組大鼠腦組織中尼古丁a7亞型受體蛋白表達(dá)水平的差異，Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動干預(yù)后，海馬組織a7 nAChRs蛋白表達(dá)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P>0.05)，但前額葉皮層a7 nAChRs蛋白表達(dá)具有顯著差異性(P<0.01)，具體表現(xiàn)在運(yùn)動組大鼠前額葉皮層a7 nAChRs蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(圖6)。

2.4 大鼠抑制能力與CPP得分、a7 nAChRs表達(dá)水平的相關(guān)性分析

為了探究尼古丁戒斷大鼠在運(yùn)動干預(yù)后，其抑制能力的提高與CPP得分、蛋白表達(dá)的相關(guān)關(guān)系，把每只大鼠的行為學(xué)和蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行了皮爾森相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NoGo任務(wù)正確率與CPP得分負(fù)相關(guān)(R2=0.64，P<0.01)，與前額葉皮層a7受體相對表達(dá)水平正相關(guān)(R2=0.44，P<0.05)，說明運(yùn)動可能通過提高前額葉皮層a7受體相對表達(dá)水平，增強(qiáng)大鼠對其行為抑制的控制能力，進(jìn)而降低尼古丁的依賴性。

圖6 運(yùn)動對尼古丁戒斷大鼠海馬和前額葉a7 nAChRs表達(dá)水平的影響

圖7 大鼠抑制能力與CPP得分和蛋白表達(dá)之間的相關(guān)關(guān)系

3 討論

3.1 大鼠Go/NoGo任務(wù)和尼古丁CPP模型

Go/NoGo任務(wù)是評價(jià)行為反應(yīng)抑制能力的經(jīng)典范式。在動物研究中，雖然該任務(wù)操作具有一定難度，訓(xùn)練時(shí)間也較長，但近些年已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種動物，如大鼠[41]、小鼠[40]和猴子[37]等。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過3周的訓(xùn)練后，Go任務(wù)正確率高達(dá)87.84%，NoGo任務(wù)正確率為71.52%，說明建立了可以評價(jià)大鼠抑制能力狀態(tài)的Go/NoGo任務(wù)模型[41]，其中，Go任務(wù)正確率高于NoGo任務(wù)正確率的可能原因，是Go任務(wù)比例較大(75% Go和25% NoGo)，容易使機(jī)體形成一種慣性反應(yīng)。而作為一種“新穎刺激”，NoGo任務(wù)出現(xiàn)比例較小，需要受試個(gè)體抑制少量不斷出現(xiàn)的優(yōu)勢反應(yīng)，相對難度較大。

CPP是基于經(jīng)典的巴普洛夫條件反射，被廣泛應(yīng)用于評定各類成癮藥物的濫用傾向和依賴程度，以及研究藥物獎(jiǎng)賞效應(yīng)的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制[8]。給動物注射藥物后，再將其反復(fù)暴露于與藥物相關(guān)聯(lián)的環(huán)境中，經(jīng)過一段時(shí)間的條件化訓(xùn)練，在不給藥的情況下動物也會對該特定環(huán)境表現(xiàn)出偏愛。動物在給藥箱內(nèi)停留時(shí)間的長短，代表著其對該藥物的渴求程度。CPP代表著動物的覓藥行為，象征著人的心理渴求[24]。根據(jù)已有文獻(xiàn)的訓(xùn)練方案和給藥劑量[20,53]，建立了評價(jià)大鼠尼古丁依賴性的CPP模型。本實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練的大鼠尼古丁CPP得分差值在160 s左右，明顯低于可卡因[55]和嗎啡[23]等毒品誘導(dǎo)的CPP得分差值(>200 s)，可能由以下原因引起[39]：雖然煙草的成癮性不亞于這些毒品，但煙草中有4 000多種化學(xué)成分，尼古丁只是其中之一；尼古丁除了參與大腦的獎(jiǎng)賞環(huán)路，還可能具有其他的藥理學(xué)作用；尼古丁同時(shí)刺激興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)；尼古丁受體易脫敏，導(dǎo)致機(jī)體耐受。

3.2 運(yùn)動促進(jìn)尼古丁戒斷大鼠的抑制能力，降低尼古丁依賴性

在本研究中，利用CPP范式建立大鼠對尼古丁依賴性模型，通過Go/NoGo任務(wù)評價(jià)戒斷期大鼠在運(yùn)動干預(yù)后的抑制能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10天中等強(qiáng)度被動跑臺運(yùn)動顯著提高了NoGo任務(wù)正確率，而對Go任務(wù)正確率沒有影響，這一方面說明，該類型運(yùn)動對難度較小的認(rèn)知加工過程作用不明顯，而僅僅促進(jìn)了難度較大的行為抑制功能；另一方面也間接說明，設(shè)定的Go/NoGo任務(wù)比例(4/1)符合該實(shí)驗(yàn)條件下大鼠的操作能力，達(dá)到了區(qū)分任務(wù)難度的效果。同時(shí)，運(yùn)動也降低了大鼠對尼古丁CPP的依賴，提示，運(yùn)動可能通過提高抑制能力，降低尼古丁渴求。藥物成癮理論觀點(diǎn)認(rèn)為，長期的藥物濫用會導(dǎo)致海馬和杏仁核等有關(guān)學(xué)習(xí)記憶的病理性損傷，進(jìn)一步強(qiáng)化獎(jiǎng)賞中心，削弱抑制控制能力，尤其在藥物戒斷期或過量攝藥期，藥物相關(guān)的自主反應(yīng)、情感和行為等支配高級認(rèn)知控制系統(tǒng)，使注意力偏向藥物或與其相關(guān)線索，誘發(fā)沖動性、強(qiáng)迫性和不顧后果的用藥動機(jī)[7,21]。尼古丁成癮神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說認(rèn)為[14]，前額葉皮層通過谷氨酸能神經(jīng)纖維投射于紋狀體、杏仁核、海馬和伏隔核等腦區(qū)，調(diào)控多巴胺能神經(jīng)傳入，這些與伏隔核相聯(lián)系的神經(jīng)纖維傳入和傳出被視作自上而下“門控”神經(jīng)環(huán)路的基礎(chǔ)，前額葉相關(guān)的認(rèn)知控制系統(tǒng)功能受損，是維持尼古丁濫用的重要原因。因此，尼古丁依賴和戒斷所致的行為反應(yīng)抑制能力障礙，可能是個(gè)體強(qiáng)迫性、沖動性覓藥和復(fù)吸的關(guān)鍵因素。相反，運(yùn)動干預(yù)可能通過提高反應(yīng)抑制能力，降低尼古丁依賴性。

目前，國家還沒有任何有效產(chǎn)品可以使尼古丁依賴者一年后的戒斷率超過20%，更沒有藥物以復(fù)吸為靶點(diǎn)[32]。隨著全民健身運(yùn)動的普及，大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動作為一種積極有效的慢病干預(yù)手段，不僅對毒品成癮有顯著的預(yù)防和治療效果，對尼古丁濫用也具有積極的干預(yù)效果[49,56]。然而，運(yùn)動與尼古丁依賴的動物研究并不多見。Sanchez課題組[43,44]研究指出，尼古丁自身給藥模型成癮大鼠戒斷期進(jìn)行10天的自主轉(zhuǎn)輪運(yùn)動，可以有效降低大鼠對尼古丁的渴求和依賴性。但該研究沒有監(jiān)控運(yùn)動強(qiáng)度，只闡述了大鼠在轉(zhuǎn)輪中每天跑2 h。神經(jīng)影像學(xué)研究指出，運(yùn)動強(qiáng)度是影響大腦認(rèn)知和行為學(xué)反應(yīng)的重要因素[52]。本研究采用被動跑臺運(yùn)動方式，通過乳酸閾間接測量了中等運(yùn)動強(qiáng)度區(qū)間，并以此作為大鼠在戒斷期運(yùn)動的強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10天的中等強(qiáng)度運(yùn)動干預(yù)可以有效減少大鼠對尼古丁的渴求和依賴。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，與安靜組相比，運(yùn)動組大鼠行為抑制能力顯著提高，且與CPP依賴性負(fù)相關(guān)，提示，運(yùn)動改善了尼古丁依賴大鼠的抑制能力受損現(xiàn)象，進(jìn)而可能減少了尼古丁依賴。關(guān)于運(yùn)動與認(rèn)知控制的研究表明，運(yùn)動可以降低尼古丁誘導(dǎo)的前額葉皮層和眶額葉等負(fù)責(zé)認(rèn)知控制腦區(qū)的激活程度，可能參與尼古丁成癮過程中認(rèn)知控制、沖動性和視覺空間注意力偏向的調(diào)控[25,26]。研究表明，急性中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動能夠有效促進(jìn)正常成年人的抑制能力[1]，改善甲基苯丙胺戒斷者的抑制能力，降低藥物渴求度[50]。本研究發(fā)現(xiàn)，10天中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動可以有效提高尼古丁戒斷大鼠Go/NoGo任務(wù)的行為抑制能力，降低尼古丁依賴性，進(jìn)一步豐富了尼古丁成癮神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說，同時(shí)，運(yùn)動作為一種新的尼古丁干預(yù)或輔助治療手段，有望在煙草依賴的其他治療方法上提供新的作用靶點(diǎn)。然而，評價(jià)動物行為抑制的范式還包括有Stop-signal任務(wù)(測評正在進(jìn)行的行為抑制能力)、五項(xiàng)選擇連續(xù)反應(yīng)時(shí)任務(wù)(測評注意力和運(yùn)動沖動性)和延遲獎(jiǎng)賞任務(wù)(測評認(rèn)知抑制，如選擇沖動性)等[18]，本研究選用的Go/NoGo任務(wù)主要評價(jià)對占有優(yōu)勢地位的行為的抑制能力。因此，對尼古丁戒斷大鼠行為抑制能力的測評存在單一性，研究結(jié)果不能夠體現(xiàn)抑制能力的所有方面。

3.3 運(yùn)動對尼古丁戒斷大鼠nAChRs的影響

本研究中，以青年雄性大鼠為研究對象(青年、雄性大鼠更易建立尼古丁CPP)[53]，選擇在大鼠尼古丁CPP戒斷期進(jìn)行10天的運(yùn)動干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與安靜組相比，運(yùn)動組大鼠海馬組織a7受體表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生改變，而前額葉皮層a7受體水平明顯上調(diào)，說明尼古丁戒斷期運(yùn)動干預(yù)在一定程度上選擇性地提高了大鼠前額葉皮層a7 nAChRs的表達(dá)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，前額葉皮層a7 nAChRs上調(diào)與抑制能力正相關(guān)，提示，前額葉a7 nAChRs可能參與了尼古丁戒斷大鼠抑制能力受損過程，同時(shí)也表明，戒斷期的運(yùn)動干預(yù)可能通過增加前額葉a7 nAChRs表達(dá)，促進(jìn)大鼠抑制能力的恢復(fù)或改善過程。尼古丁作為一種外源性nAChRs激動劑，可以作用于谷氨酸能、GABA能和乙酰膽堿能神經(jīng)纖維的傳入和傳出，調(diào)控著多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布較多的尼古丁受體主要為α7和α4β2 nAChRs。研究發(fā)現(xiàn)，a7受體基因缺失的小鼠表現(xiàn)出前額葉依賴的注意力缺陷和工作記憶下降[14]，前扣帶回皮層注射α7 nAChRs拮抗劑增加大鼠尼古丁攝取的沖動性[12]。α7 nAChRs激動劑能減少新物體識別和社交行為等認(rèn)知過程中的正常健忘[48]。α7和α4β2 nAChRs可以拮抗性調(diào)控邊緣腦區(qū)(如腹側(cè)被蓋區(qū)和前額葉等)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的突觸傳遞，維持動作電位依賴性的多巴胺遞質(zhì)水平的穩(wěn)態(tài)[6]。由此可見，α7 nAChRs對大腦認(rèn)知控制能力和尼古丁依賴性，以及對中樞神經(jīng)興奮性和抑制性過程的穩(wěn)態(tài)，均具有重要的調(diào)控作用。

早在1990年，Collins等[15]動物實(shí)驗(yàn)就指出，雌性大鼠連續(xù)7天的頸背部皮下注射尼古丁(0.8 mg/kg)，增加了皮層、中腦、后腦、海馬、紋狀體和丘腦尼古丁-nAChRs綁定，但是戒斷第8天各個(gè)腦區(qū)的尼古丁受體水平開始下降(除了皮層和海馬)，當(dāng)戒斷21天時(shí)，皮層nAChRs含量恢復(fù)至正?；€水平，而海馬nAChRs含量仍舊高于基線水平。接著Koylu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠連續(xù)15天的皮下注射尼古丁(0.6 mg/kg)，會上調(diào)雄性大鼠全腦(除去小腦)尼古丁受體水平(雌性大鼠無變化)，但戒斷20天后，nAChRs水平不再顯著增加。以上研究結(jié)果提示，大鼠尼古丁戒斷后，nAChRs的變化隨著戒斷時(shí)間和腦區(qū)而有所不同，這也可能與性別有關(guān)。然而，關(guān)于尼古丁戒斷與nAChRs改變的動物實(shí)驗(yàn)，大多采用直接尼古丁注射，沒有使用自身給藥或CPP等藥物依賴模型去鑒定大鼠尼古丁注射后是否形成了依賴或成癮。因此，這些研究中nAChRs水平的變化可能并不能代表尼古丁依賴或成癮個(gè)體nAChRs的變化趨勢。本研究中選擇尼古丁依賴大鼠戒斷10天期間，進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動增加了前額葉α7 nAChRs的表達(dá)。關(guān)于運(yùn)動與尼古丁受體表達(dá)關(guān)系的研究，目前鮮有報(bào)道。早期文獻(xiàn)指出，長期大強(qiáng)度被動跑臺運(yùn)動(30 m/min,坡度為5%，2 h/天,5天/周,12～16周)能夠增加大鼠骨骼肌神經(jīng)肌肉接頭的乙酰膽堿受體數(shù)量，促進(jìn)神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的功能重塑[16]。最近研究也發(fā)現(xiàn)，α7 nAChRs屬于骨骼肌傳入神經(jīng)元功能性表達(dá)受體，增強(qiáng)肌肉收縮功能，促進(jìn)血液循環(huán)[10]。這些結(jié)果提示，α7 nAChRs可能在運(yùn)動發(fā)揮積極效應(yīng)過程中扮演著重要作用。另一方面，由于本實(shí)驗(yàn)沒有設(shè)立鹽水對照組(非尼古丁依賴)，缺乏正常大鼠中樞α7 nAChRs含量的基線值，無法確認(rèn)尼古丁戒斷后安靜組大鼠中樞α7 nAChRs含量的改變情況(相比非尼古丁依賴大鼠，其α7 nAChRs水平是升高還是降低)，而僅能說明運(yùn)動干預(yù)后，尼古丁戒斷大鼠前額葉α7 nAChRs表達(dá)上調(diào)，至于是否基于正常水平的上調(diào)，還有待進(jìn)一步的研究。同時(shí)，關(guān)于a7受體是否真正參與運(yùn)動改善尼古丁戒斷大鼠抑制能力的損傷，它是不是運(yùn)動促進(jìn)抑制能力的必需因素，也需要進(jìn)一步加入受體阻斷劑的在體或離體研究，或者基因敲除的動物研究。

4 結(jié)論

連續(xù)10天中等強(qiáng)度被動跑臺運(yùn)動(30 min/d)能夠顯著提高尼古丁戒斷大鼠的行為抑制能力，雖然沒能消除尼古丁CPP的形成，但降低了尼古丁依賴性；運(yùn)動可能通過上調(diào)特定腦區(qū)(前額葉皮層，而非海馬組織)a7 nAChRs蛋白表達(dá)，增強(qiáng)抑制控制能力，進(jìn)而降低尼古丁依賴性。

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Effect of Exercise on Inhibition Ability during Nicotine Abstinence Period in Rat and Its Mechanism

ZHOU Yue-hui，ZHOU Cheng-lin，LI Cui-cui

Objective:To explore the effect of exercise on inhibition ability and the expression of a7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) during nicotine abstinence in rats,and discuss the relevant relationships between them.Methods:30 four-week-old male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sedentary group and moderate intensity exercise group.It was performed with conditioned place preference (CPP) to establish nicotine dependence model in rats.The study applied Go/NoGo task to evaluate inhibition ability during nicotine abstinence periods,and the expression of a7 nAChRs in prefrontal cortex and hippocampus were detected by Western blotting.Results:1) Go/NoGo paradigm and nicotine-induced CPP were established successfully.2) Compared to the sedentary group,the preferred values of rat nicotine-CPP (secs) from exercise group was significantly reduced (156.27±12.07 vs 83.6±14.85,P<0.01);The accuracy ratio of Go task (%) did not change,while the accuracy ratio of NoGo task (%) increased observably (42.67±3.53 vs 63.43±3.92,P<0.01).3) The expression of a7 nAChRs in both groups did not change in the hippocampus,but it was significantly up-regulated in the prefrontal cortex in exercise group (0.7±0.06 vs 1.23±0.1,P<0.01).4) The inhibition ability of rats during nicotine abstinence periods was negatively correlated with the preferred values of CPP (R2=0.64,P<0.01),and positively correlated with the prefrontal cortex a7 nAChRs expression (R2=0.44,P<0.05).Conclusion:10-day moderate intensity treadmill running can promote rats inhibition ability during nicotine abstinence period,and reduce dependence of nicotine.These effects of exercise may be due to the up-regulation of a7 nAChRs.

exercise;rat;nicotine;conditionedplacepreference;inhabitionability;nicotinicacetylcholinereceptor

1000-677X(2016)02-0058-08

10.16469/j.css.201602007

2015-09-16；

2016-01-19

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31571151)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計(jì)劃項(xiàng)目課題(13490503600)；上海體育學(xué)院研究生教育創(chuàng)新基金(yjscx2015011)。

周躍輝(1985-)，男，安徽亳州人，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動與神經(jīng)認(rèn)知，E-mail：msyzyh2006@126.com；周成林(1960-)，男，遼寧沈陽人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動認(rèn)知理論與應(yīng)用，Tel：(021)51253160，E-mail：chenglin_600@126.com；李翠翠(1988-)，山東德州人，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動與神經(jīng)認(rèn)知，E-mail：lcc0726@126.com。

上海體育學(xué)院 運(yùn)動科學(xué)學(xué)院，上海 200438 Shanghai University of Sport,Shanghai 200438,China.

G804.5

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