馬曉雯，常 蕓，王世強(qiáng)

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長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練對(duì)大鼠心肌細(xì)胞自噬相關(guān)因子Beclin1和LC3的影響

馬曉雯1,2，常 蕓1，王世強(qiáng)2

目的：通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究自噬相關(guān)因子Beclin1和LC3的表達(dá)變化，探討長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練對(duì)大鼠心肌細(xì)胞自噬發(fā)生程度的影響，為長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練誘導(dǎo)自噬的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：選取24只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組、中等強(qiáng)度訓(xùn)練組和大強(qiáng)度訓(xùn)練組，每組8只。分別以15.2 m/min速度5°坡度和28 m/min速度10°坡度進(jìn)行16周跑臺(tái)訓(xùn)練，每周訓(xùn)練5天，每次訓(xùn)練1 h。訓(xùn)練16周后，進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。取左心室壁用于HE染色，觀察心肌組織形態(tài)，制備超薄切片進(jìn)行透射電鏡觀察，檢測(cè)自噬發(fā)生程度。RT-PCR、Western Blot技術(shù)檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3的mRNA及蛋白表達(dá)。數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，以P<0.05具有顯著性差異。結(jié)果：1)超聲心動(dòng)圖顯示，大鼠經(jīng)過(guò)16周跑臺(tái)訓(xùn)練后，大強(qiáng)度組EF值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。2)HE染色結(jié)果顯示，大強(qiáng)度組心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重。3)透射電鏡檢測(cè)提示，長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練使自噬小體增多，自噬程度增加。4)16周跑臺(tái)訓(xùn)練后RT-PCR結(jié)果提示，自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)。5)Western Blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，中等強(qiáng)度訓(xùn)練組和大強(qiáng)度訓(xùn)練組Beclin1表達(dá)水平及LC3-II/LC3-I比值均顯著升高(P<0.05)，且大強(qiáng)度訓(xùn)練組顯著高于中等強(qiáng)度訓(xùn)練組(P<0.05)。結(jié)論：1)中等強(qiáng)度耐力訓(xùn)練可引起心肌組織細(xì)胞良好的適應(yīng)性重塑，促進(jìn)心肌細(xì)胞適當(dāng)自噬水平及活性，從而有效上調(diào)Beclin1和LC3的表達(dá)，提高LC3-II/LC3-I比值，增強(qiáng)心肌細(xì)胞代謝能力，有利于心肌能量代謝和收縮功能。2)大強(qiáng)度長(zhǎng)時(shí)間耐力訓(xùn)練會(huì)導(dǎo)致心肌纖維受損，自噬體異常增多，Beclin1和LC3出現(xiàn)過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象，構(gòu)成心肌細(xì)胞損傷的結(jié)構(gòu)與分子病理基礎(chǔ)。

心肌細(xì)胞；運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度；Beclin1；LC3

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞中普遍存在的生命現(xiàn)象，是將細(xì)胞內(nèi)變形、衰老或損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中消化降解的一種代謝過(guò)程[5]。在未接受到外界刺激時(shí)，細(xì)胞自噬處于較低水平，但營(yíng)養(yǎng)缺乏、細(xì)胞受損或運(yùn)動(dòng)等因素會(huì)引發(fā)細(xì)胞自噬發(fā)生不同程度的改變。一般來(lái)說(shuō)，適宜強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可通過(guò)提高骨骼肌、心肌等細(xì)胞的自噬水平，降解由于運(yùn)動(dòng)刺激所積累的破損和衰老的細(xì)胞器、合成或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)，為肌纖維再生提供一定的能量與合成底物，并抑制骨骼肌和心肌細(xì)胞凋亡和死亡。但過(guò)度訓(xùn)練則會(huì)因?yàn)榧?xì)胞自噬的過(guò)度激活從而過(guò)多降解胞漿中的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，導(dǎo)致骨骼肌和心肌細(xì)胞損傷和疲勞，免疫功能下降，甚至誘發(fā)自噬性細(xì)胞死亡[11，12]。

Beclin1是酵母中Atg6的同源基因,是最早發(fā)現(xiàn)的一個(gè)自定位到自噬前體的結(jié)構(gòu)中，進(jìn)而調(diào)節(jié)自噬活性的調(diào)控基因，主要通過(guò)與磷酸肌醇三磷酸激酶Ⅲ型PIK形成復(fù)合體來(lái)調(diào)控其他自噬蛋白。Beclin1是參與自噬調(diào)控的重要基因，其表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性密切相關(guān)[13，15]。LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母Atg8基因的同源物，包括I型與II型[20]。LC3參與兩種泛素樣蛋白系統(tǒng)的加工修飾過(guò)程：新合成的LC3經(jīng)剪切修飾變成胞漿蛋白LC3-I，之后LC3-I轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-II，在Atg5協(xié)助下定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的伸展擴(kuò)張。因此，LC3-II被認(rèn)為自噬活動(dòng)的特異性標(biāo)志物。通常用LC3-II/LC3-I的比值來(lái)衡量自噬活性，其比值下降提示自噬活性減弱，反之則說(shuō)明自噬活性增強(qiáng)[19]。

目前關(guān)于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)于心肌細(xì)胞自噬的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注，但是，長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練對(duì)心肌細(xì)胞自噬及相關(guān)自噬因子表達(dá)影響的研究還鮮有報(bào)道。本研究在建立長(zhǎng)時(shí)間耐力訓(xùn)練的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)和自噬現(xiàn)象，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究自噬相關(guān)因子Beclin1和LC3的表達(dá)變化，探討長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練對(duì)大鼠心肌細(xì)胞自噬發(fā)生程度的影響，為長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練誘導(dǎo)自噬的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠24只，體重為220±8 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為[SCXX(京)2012-0001]。所有大鼠均在國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所ABSL-3級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，大鼠常規(guī)分籠生活(4只/籠)，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物飼料(由北京維通利華生物公司提供)飼養(yǎng)，自由飲食，室溫為22℃±2℃，空氣濕度為45%～55%，每天光照12 h。

1.2 分組和訓(xùn)練方案

1.3 超聲心動(dòng)圖測(cè)定

在16周大鼠取材前，將其麻醉后仰臥位固定，胸部備皮，小動(dòng)物超聲探頭置于大鼠左前胸，連接超聲檢查儀(SXTCH2.0-1005.0592)進(jìn)行超聲檢查。測(cè)量左心室后壁舒張期厚度(LVPWD)、左心室后壁收縮期厚度(LVPWS)以及射血分?jǐn)?shù)(EF)。

1.4 取材與樣本制備

訓(xùn)練16周后，將全部24只大鼠(安靜對(duì)照組8只，中等強(qiáng)度訓(xùn)練組8只，大強(qiáng)度訓(xùn)練組8只)進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)和取材。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(40 mg/100 g體重)麻醉后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。開(kāi)胸后迅速摘取心臟，取心尖處1 mm3小塊放入固定液，用于電鏡檢測(cè)。切取左心室壁，經(jīng)多聚甲醛固定后用于制作石蠟切片。組織經(jīng)石蠟包埋后，于石蠟切片機(jī)切取6 μm厚的石蠟切片待用。

1.4.1 心肌組織學(xué)樣本制備

將大鼠心室肌組織石蠟切片依次經(jīng)脫蠟、水化、蘇木素染色、分化、反藍(lán)、伊紅染色、脫水、透明、封片，制成HE染色切片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察、采圖。

1.4.2 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)樣本制備

取大鼠左心室心尖部組織體積約1 mm3大小，4℃戊二醛磷酸緩沖液固定液固定24 h。常規(guī)脫水、浸透、包埋、染色后制成50～70 nm的超薄切片，透射電鏡(HITACHIH-7650)下觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化及自噬體的形成。

1.5 RT-PCR檢測(cè)Beclin1和LC3 mRNA表達(dá)

所有基因引物均參照GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，并由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)并合成。引物序列如下：Beclin1-F：CGTGGAGAAAGGCAAGATT，Beclin1-R：AGAACTGTGAGGACACCCAAG,產(chǎn)物長(zhǎng)度152 bp；LC3-F:GACCCTCTACGATGCTGGTG，LC3-R:TGCTGTCCTCAATGTCCTTCT,產(chǎn)物長(zhǎng)143 bp；β-actin-F:CATTGCTGACAGGATGCAGAAG-3，β-actin-R:GAGCCACCAATCCACACAGAGT-3,產(chǎn)物長(zhǎng)度150 bp。

RT-PCR檢測(cè)過(guò)程：采用Trizol法提取總RNA，每個(gè)樣本按照2 μg RNA作為初始模板，配置20 μl的總反應(yīng)體系，應(yīng)用cDNA合成試劑盒(High Capacity RNA-to-cDNA Kit，美國(guó)ABI)在核酸擴(kuò)增儀(Gene Amp PCR System 9700，美國(guó)ABI公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以合成的cDNA作為模板，以β-actin作為內(nèi)參，配置20 μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，使用熒光定量試劑盒(TaKaRa，RR820A)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(7 300，美國(guó)ABI)進(jìn)行熒光定量，反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。將熒光定量RT-PCR所得數(shù)據(jù)用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量，其中，△△Ct=(Ct實(shí)驗(yàn)組目的基因-Ct實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因)-(Ct對(duì)照組目的基因-Ct對(duì)照組內(nèi)參基因)。

1.6 Western Blot檢測(cè)

提取總蛋白后用BCA法測(cè)定并調(diào)整蛋白濃度一致，加入蛋白上樣緩沖液，沸水中煮10 min使蛋白變性，5%脫脂奶粉(購(gòu)于美國(guó)BD公司)封閉1 h，一抗(Anti-Beclin1和Anti-LC3稀釋比例分別為1∶2 000和1∶400，一抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司)置于搖床4℃過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次5 min，加HRP標(biāo)記的二抗(1∶4 000，購(gòu)于北京欣博盛公司)，室溫?fù)u床孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，將條帶置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(BIO-RAD，ChemiDoc Touch)滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑(購(gòu)于美國(guó)Millipore)進(jìn)行曝光，條帶運(yùn)用quantity one軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值。內(nèi)參為β-actin(購(gòu)于北京欣博盛公司)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠超聲心動(dòng)圖結(jié)果

大鼠進(jìn)行16周跑臺(tái)訓(xùn)練后，安靜對(duì)照組、中等強(qiáng)度訓(xùn)練組和大強(qiáng)度訓(xùn)練組間LVPWD、LVPWS無(wú)顯著性差異，中等強(qiáng)度訓(xùn)練組與對(duì)照組EF值無(wú)顯著性差異，而大強(qiáng)度組EF值顯著低于對(duì)照組(P<0.05,表1)。

表1 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果一覽表

時(shí)間(周)nLVPWD(mm)LVPWS(mm)EF(%)C組1681.08±0.191.33±0.2461.4±4.1M組1681.17±0.321.36±0.2465.0±3.9H組1681.00±0.191.16±0.2652.1±8.0*

注：不同訓(xùn)練強(qiáng)度比較，*P<0.05。

2.2 心臟組織形態(tài)改變

大鼠訓(xùn)練16周后：對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，橫紋清晰，細(xì)胞外間質(zhì)較少；中等強(qiáng)度組7只大鼠心肌細(xì)胞排列稍紊亂，細(xì)胞間隙增大，橫紋模糊；大強(qiáng)度組8只大鼠心肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，細(xì)胞核增大，細(xì)胞間隙增大，橫紋消失，部分肌纖維斷裂(圖1)。

圖1 大鼠左心室壁心肌纖維HE染色結(jié)果(×400)

2.3 心肌細(xì)胞形態(tài)改變

大鼠經(jīng)過(guò)16周的訓(xùn)練，對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，明暗帶清晰，Z線(xiàn)完整；中等強(qiáng)度組8只大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)基本正常，肌原纖維偶有攣縮，線(xiàn)粒體數(shù)量增加，偶見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)；大強(qiáng)度組7只大鼠肌原纖維斷裂，甚至缺失；線(xiàn)粒體增多聚集，形態(tài)變異，線(xiàn)粒體嵴斷裂、消失，電子密度增加，線(xiàn)粒體被細(xì)胞膜包裹形成雙層膜結(jié)構(gòu)，自噬程度增強(qiáng)(圖2、圖3箭頭所指處)。

圖2 大鼠心肌透射電鏡結(jié)果—肌纖維和線(xiàn)粒體變化(×2 000)

圖3 大鼠心肌透射電鏡結(jié)果—自噬程度變化(×2 000)

2.4 運(yùn)動(dòng)對(duì)左心室Beclin1和LC3 mRNA的影響

16周中等強(qiáng)度和大強(qiáng)度訓(xùn)練都促進(jìn)了大鼠左心房Beclin1 mRNA的表達(dá)，且與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P<0.05，圖4A)。同時(shí)，16周的長(zhǎng)時(shí)間耐力訓(xùn)練也顯著提高了大鼠左心室LC3 mRNA的表達(dá)(P<0.01，圖4B)，且大強(qiáng)度訓(xùn)練組顯著高于中等強(qiáng)度訓(xùn)練組(P<0.01)。

圖4 各組大鼠左心室Beclin1和LC3相對(duì)表達(dá)變化

注：*P<0.05，與對(duì)照組比較；**P<0.01，與對(duì)照組比較。

2.5 運(yùn)動(dòng)對(duì)左心室Beclin1和LC3蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，中等強(qiáng)度訓(xùn)練組和大強(qiáng)度訓(xùn)練組Beclin1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，且大強(qiáng)度訓(xùn)練組顯著高于中等強(qiáng)度訓(xùn)練組(P<0.01，圖5A)。

中等強(qiáng)度訓(xùn)練組和大強(qiáng)度訓(xùn)練組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且大強(qiáng)度訓(xùn)練組顯著高于中等強(qiáng)度訓(xùn)練組(P<0.01，圖5B)。

3 討論

3.1 長(zhǎng)時(shí)間耐力訓(xùn)練后心臟大體結(jié)構(gòu)與功能的改變

圖5 各組大鼠左心室Beclin1和LC3蛋白的表達(dá)變化

注：*P<0.05，與對(duì)照組比較；**P<0.01，與對(duì)照組比較。

超聲心動(dòng)圖(Ultrasonic cardiogramgraph，UCG)是臨床檢測(cè)心功能最常用的無(wú)創(chuàng)性技術(shù)，通過(guò)UCG中計(jì)算左心室后壁舒張期厚度(LVPWD)、左心室后壁收縮期厚度(LVPWS)、射血分?jǐn)?shù)(EF)，可以定量檢測(cè)心臟結(jié)構(gòu)功能狀態(tài)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠進(jìn)行16周跑臺(tái)訓(xùn)練后，安靜對(duì)照組、中等強(qiáng)度訓(xùn)練組和大強(qiáng)度訓(xùn)練組間LVPWD、LVPWS無(wú)顯著性差異，中等強(qiáng)度訓(xùn)練組EF值略高于對(duì)照組，但二者并無(wú)顯著性差異，而大強(qiáng)度組EF值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。這可能是由于中等強(qiáng)度訓(xùn)練對(duì)大鼠左心室屬于適應(yīng)性刺激，不足以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能的改變。Babette M等研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)員心臟做功效率高，功能儲(chǔ)備強(qiáng)，一般安靜時(shí)EF值較普通人大，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。胡繼明等[1]的研究也發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)員的心臟收縮舒張功能均好于對(duì)照組，有氧運(yùn)動(dòng)可以提高每搏輸出量及射血分?jǐn)?shù)，從而使心臟得到良好的適應(yīng)性及較強(qiáng)的儲(chǔ)備能力。這可能是由于中等強(qiáng)度對(duì)大鼠左心室供血能力屬于適宜刺激強(qiáng)度，中等跑臺(tái)訓(xùn)練增強(qiáng)了左心室射血能力，保障肌體供血充足。本研究中大鼠經(jīng)過(guò)16周大強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練后，EF值并未與中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組保持相同的上升趨勢(shì)，反而顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，可能與長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度的訓(xùn)練造成心肌組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)，導(dǎo)致心肌射血功能下降。

3.2 長(zhǎng)時(shí)間耐力訓(xùn)練后心肌細(xì)胞形態(tài)與自噬發(fā)生程度的改變

經(jīng)過(guò)對(duì)左心室壁石蠟切片HE 染色發(fā)現(xiàn)，大鼠訓(xùn)練16周后：對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，橫紋清晰，細(xì)胞外間質(zhì)較少；中等強(qiáng)度組心肌細(xì)胞排列稍紊亂，細(xì)胞間隙增大，橫紋模糊；大強(qiáng)度組心肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，細(xì)胞核增大，細(xì)胞間隙增大，橫紋消失，肌纖維斷裂。孫曉娟等[6]在對(duì)60只SD大鼠進(jìn)行8周不同強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和低強(qiáng)度組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，著色均勻；中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組心肌纖維無(wú)明顯形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變；大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組心肌纖維可見(jiàn)明顯結(jié)構(gòu)異常和缺血缺氧的改變，并伴有不同程度的細(xì)胞濁腫和局限性間質(zhì)水腫等改變。劉澤廣等[4]通過(guò)比較大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和對(duì)照組大鼠心肌纖維形態(tài)發(fā)現(xiàn)，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌纖維可見(jiàn)形態(tài)異常，著色不均勻，細(xì)胞邊界模糊不清，細(xì)胞排列不整齊。由此可見(jiàn)，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致心肌纖維心態(tài)結(jié)構(gòu)異常，這也構(gòu)成了心肌損傷的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

自噬是一種物種進(jìn)化過(guò)程中高度保守的代謝機(jī)制[18]，而自噬體是一種包繞變性、衰老大分子物質(zhì)及受損、廢用細(xì)胞器的雙層膜結(jié)構(gòu)。半個(gè)世紀(jì)前，科學(xué)家就已經(jīng)借助電鏡觀察到了自噬體結(jié)構(gòu)，此后，免疫熒光、冷蝕刻、蛋白印跡等檢測(cè)自噬發(fā)生程度的研究方法應(yīng)運(yùn)而生。目前，應(yīng)用透射電鏡動(dòng)態(tài)觀察自噬體的形成是檢測(cè)自噬發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)[16]。本研究通過(guò)透射電鏡觀察肌纖維、線(xiàn)粒體和自噬程度變化發(fā)現(xiàn)：大鼠經(jīng)過(guò)16周的訓(xùn)練，對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，明暗帶清晰，Z線(xiàn)完整；中等強(qiáng)度組心肌細(xì)胞形態(tài)基本正常，肌原纖維偶有攣縮，線(xiàn)粒體數(shù)量增加，偶見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)；大強(qiáng)度組肌原纖維斷裂，甚至缺失；線(xiàn)粒體增多聚集，形態(tài)變異，線(xiàn)粒體嵴斷裂、消失，電子密度增加，線(xiàn)粒體被細(xì)胞膜包裹形成雙層膜結(jié)構(gòu)，自噬程度增強(qiáng)?，F(xiàn)有研究表明，適宜強(qiáng)度的訓(xùn)練可以上調(diào)心肌細(xì)胞的自噬水平，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，減少細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)大強(qiáng)度組自噬程度的變化趨勢(shì)與Campos Munoz A[10]研究結(jié)果基本一致。

3.3 長(zhǎng)時(shí)間耐力訓(xùn)練后心肌細(xì)胞自噬因子Beclin1和LC3表達(dá)的改變

作為分化再生能力有限的心肌細(xì)胞，細(xì)胞自噬可以作為其促進(jìn)物質(zhì)循環(huán)以及細(xì)胞自我更新的途徑之一，所以，心肌細(xì)胞自噬對(duì)于維持心臟功能和活力具有重要的作用[3]。Beclin1是最早自定位在自噬前體的結(jié)構(gòu)中，被認(rèn)為可以調(diào)控自噬的基因。而LC3，尤其是LC3-Ⅱ表達(dá)量的檢測(cè)也是目前大多數(shù)自噬研究所采用的方法。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化成LC3-Ⅱ，定位在自噬體膜上。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和LC3-Ⅱ的多少與自噬發(fā)生程度成正相關(guān)。本研究中，16周中等強(qiáng)度訓(xùn)練和大強(qiáng)度訓(xùn)練均顯著提高了大鼠左心房自噬因子Beclin1、LC3 mRNA和蛋白的表達(dá)。賈少輝等[2]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠進(jìn)行自由轉(zhuǎn)輪、游泳和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)8周后，3種運(yùn)動(dòng)方式均能提高Beclin1的表達(dá)，且游泳和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)提高的幅度更大。有研究表明，梯度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)6周后，衰老大鼠運(yùn)動(dòng)組和對(duì)照組相比，Beclin1表達(dá)增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加，提示，運(yùn)動(dòng)可上調(diào)衰老大鼠心肌細(xì)胞自噬水平，從而減緩心肌細(xì)胞的衰老過(guò)程，減輕老齡心肌細(xì)胞損傷，改善老齡大鼠心臟功能[8]。Lira VA等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，4周跑步訓(xùn)練可增加基底自噬流量，同時(shí)，也上調(diào)LC3-Ⅱ、Beclin1的表達(dá)水平，也使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，這與本研究結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，運(yùn)動(dòng)刺激可通過(guò)上調(diào)自噬水平，增強(qiáng)降解細(xì)胞內(nèi)代謝廢物的能力，減少細(xì)胞損傷，從而維持細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)。

本研究結(jié)果值得關(guān)注的是，大鼠運(yùn)動(dòng)16周后，不但運(yùn)動(dòng)組心肌細(xì)胞自噬因子Beclin1和LC3的表達(dá)升高，且大強(qiáng)度訓(xùn)練組顯著高于中等強(qiáng)度訓(xùn)練組，這可能與長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)引起心肌細(xì)胞自噬過(guò)度激活有關(guān)。Feng等[11]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度訓(xùn)練可使肌肉萎縮，自噬相關(guān)基因Beclinl、LC3表達(dá)顯著增加，并因此認(rèn)為過(guò)度訓(xùn)練可引起細(xì)胞自噬的過(guò)度激活，從而過(guò)多降解骨骼肌細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器(線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng))等主要成分，使肌肉發(fā)生萎縮，肌肉能力下降，細(xì)胞免疫功能降低。也有研究顯示，超負(fù)荷訓(xùn)練可使心肌細(xì)胞自噬被過(guò)度激活，加速心肌細(xì)胞死亡，同時(shí)也加快了心肌細(xì)胞產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性損傷的速度[7]。

4 結(jié)論

1.中等強(qiáng)度耐力訓(xùn)練可引起心肌組織細(xì)胞良好的適應(yīng)性重塑，促進(jìn)心肌細(xì)胞適當(dāng)自噬水平及活性，從而有效上調(diào)Beclin1和LC3的表達(dá)，提高LC3-II/LC3-I比值，增強(qiáng)心肌細(xì)胞代謝能力，有利于心肌能量代謝和收縮功能。

2.大強(qiáng)度長(zhǎng)時(shí)間耐力訓(xùn)練會(huì)導(dǎo)致心肌纖維受損，自噬體異常增多，Beclin1和LC3出現(xiàn)過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象，構(gòu)成心肌細(xì)胞損傷的結(jié)構(gòu)與分子病理基礎(chǔ)。

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Effects of Long-term Endurance Training on Autophagy-related Factors Beclin1 and LC3 of Rat Cardiomyocytes

MA Xiao-wen1,2,CHANG Yun1,WANG Shi-qiang2

Objective:Through experimental research of expression changes on autophagy -related factors Beclin1 and LC3,this paper explores the influence of long-term endurance training on the degree of rat cardiomyocyte autophagy,and in order to provides experimental evidence for the long-term endurance training inducing mechanism of autophagy.Methods:Select 24 SD rats were grouped to control group,moderate intensity group and high instensity group with 8 animals in each group.Respectively does 16 weeks treadmill training on 15.2m / min speed of 5° slope and 28m / min speed of 10° slope,5 days/weeks,1h/day.Make detection of echocardiography after 16 weeks training.Left ventricular wall used in HE staining,observe the myocardial tissue,preparation of ultrathin slices for transmission electron microscope,testing level of autophagy.Use RT-PCR,Western Blot to detect autophagy-related genes Beclin1 and LC3 mRNA and protein expression of rat cardiomyocytes.Results:1) Echocardiography showed that,after 16 weeks treadmill training,high intensity group EF value is lower than control group(P<0.05);2) HE staining results showed that,high intensive group of myocardial cell injury is serious;3) TEM analysis suggests that long terms high intensity endurance training increased degree of autophagy;4) After 16 weeks training,RT-PCR results that the expression of autophagy-related genes Beclin1 and LC3 was raised;5) Western Blot suggests that,compair with control group,both moderate intensity group and high instensity group,the expression of Beclin1and LC3-II / LC3-I ratio was significantly increased (P<0.05),and high intensity training group was significantly higher than moderate intensity training group (P<0.05).Conclusion:1) Mderate intensity endurance exercise can cause cardiac tissue good adaptability remodeling,promote appropriate levels of autophagy and activity of myocardial cells,which effectively increases the expression of Beclin1 and LC3 and improve LC3-II / LC3-I ratio,increase cardiac cells metabolism,and in favor of myocardial energy metabolism and contractile function;2) High intensity endurance exercise can cause myocardial fiber damaged,autophagy abnormal increased,Beclin1 and LC3 over-expressed,and form the structure and basis of the molecular pathology of myocardial cell injury.

myocardialcells;exerciseintensity;Beclin1;LC3

1000-677X(2016)02-0066-06

10.16469/j.css.201602008

2015-08-21；

2016-01-21

國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(14-01)。

馬曉雯(1989-)，女，北京人，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)心臟生理和病理，Tel：(010)87182567，E-mail：1219104640@qq.com；常蕓(1957-)，女，內(nèi)蒙古人，研究員，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)員心臟病生理與醫(yī)務(wù)監(jiān)督，Tel：(010)87182526，E-mail：changyun@ciss.cn；王世強(qiáng)(1987-)，男，山東濟(jì)寧人，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)心臟生理和病理。

1.國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所，北京 100061；2.上海體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院，上海 200438 1.China Institute of Sports Science，Beijing 100061，China.2.Shanghai University of Sport，Shanghai 200438， China.

G804.2

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