劉 洋，柳 青，李 楠，劉相國，張 航，趙方方，賈 偉，韓四平，尹悅佳**

(1.吉林省農業(yè)科學院; 2.吉林省農業(yè)生物技術重點實驗室; 3.哈爾濱師范大學;4.吉林農業(yè)大學)

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轉cry1Ab/Gc基因玉米的不同轉化事件Bt蛋白表達和抗蟲性分析*

劉 洋1,2，柳 青1,2，李 楠1,2，劉相國1,2，張 航3，趙方方3，賈 偉4，韓四平1,2，尹悅佳1,2**

(1.吉林省農業(yè)科學院; 2.吉林省農業(yè)生物技術重點實驗室; 3.哈爾濱師范大學;4.吉林農業(yè)大學)

分析不同轉化體Bt蛋白表達量和評估其抗蟲性，進而篩選優(yōu)異轉化事件是轉基因玉米新品種培育研究中的重要環(huán)節(jié).為分析轉cry1Ab/Gc基因玉米中Bt蛋白表達特性與抗蟲性的關系，篩選優(yōu)秀轉化事件，研究以三個轉化事件HG-1、 HG-2、HG-3為試驗材料，利用ELISA檢測、玉米螟生測等技術，在室內和田間詳細分析心葉期和抽絲期玉米抗蟲蛋白表達量，并評估抗蟲性.研究結果表明，同一轉化事件不同組織或器官Cry1Ab/Gc蛋白含量存在顯著差異，均表現(xiàn)為葉>莖>根；不同時期葉片Cry1Ab/Gc蛋白含量存在顯著差異，表現(xiàn)為抽絲期>心葉期；不同轉化事件間，心葉期轉化事件HG-1的葉片、抽絲期轉化事件HG-1和HG-2的莖中Cry1Ab/Gc蛋白的含量明顯高于其他材料.室內和田間亞洲玉米螟生測試驗結果表明：不同轉化事件抗蟲性差異顯著，轉化事件HG-1在心葉期和抽絲期亞洲玉米螟抗性顯著高于其他兩個玉米轉化事件，與該時期Cry1Ab/Gc蛋白高表達的試驗結果一致.本研究結果證實不同玉米轉化事件Bt蛋白表達量顯著差異，心葉期和抽絲期Bt蛋白表達量與亞洲玉米螟抗性呈正相關，可以作為抗蟲轉基因玉米優(yōu)秀轉化體初步篩選的重要技術指標，具有可操作性強、技術穩(wěn)定性好、節(jié)省時間等優(yōu)勢，為抗蟲轉基因玉米新品種培育研發(fā)提供數(shù)據參考.

Cry1Ab/Gc蛋白；轉化事件；抗蟲性

0 引言

亞洲玉米螟是我國玉米的重要害蟲，一般發(fā)生年份可使玉米減產10%左右，大發(fā)生年份可造成玉米產量損失30%以上，嚴重時甚至絕收[1].轉Bt基因玉米是通過生物技術將外源抗蟲基因插入到玉米基因組中，使其成為具備抗蟲性狀的玉米品系，為控制玉米螟危害提供了新的途徑[2].目前，已有26個國家批準40余種轉Bt基因玉米事件開展商業(yè)化種植或飼料食品加工[3]，其中包括孟山都公司和先正達公司分別推出的MON810 與 Bt11、Bt176 抗蟲玉米雜交種[4].

進入商業(yè)化種植的轉基因材料初期通常產生成百至上千個不同事件，并不斷篩選事件中具有商業(yè)用途所需的轉基因表達水平和模式的單個事件.岳同卿[5]等從12個轉cry1Ah基因玉米事件植株中，篩選出高抗轉基因事件2個，分別為B1-1 和 B1-7.孫越等[6]從以玉米自交系9801為背景的42個轉化事件，篩選出高抗草甘膦、高抗玉米螟轉化事件3個，從以玉米自交系齊319為背景的12個轉化事件中篩選出高抗草甘膦、高抗玉米螟轉化事件3個，并發(fā)現(xiàn)抗蟲基因cry1AcM表達量的高低與玉米抗蟲性強弱成正比.

一般來說，表達量越高，抗蟲效果就越好.早期的轉抗蟲基因植物的殺蟲蛋白在植株上的表達量很低(占全部可溶性蛋白的 0.001%以下)，抗蟲效果不理想[7].從已有的研究結果來看，通過對cry基因的修飾、改造和密碼子優(yōu)化，不但可以有效解決昆蟲產生抗性問題[8]，同時轉基因植物中Bt蛋白表達量也逐步提高，獲得了多種有應用價值的轉基因植物.Bohorova等[9]將融合基因crylB-crylAb轉入玉米中來防治多種農業(yè)害蟲.國內很多通過密碼子優(yōu)化，改造合成新的基因，獲得高表達抗蟲蛋白的轉基因植物，有效提高了轉基因玉米的殺蟲活性[10-12].但對于在不同生育期玉米不同組織部位殺蟲蛋白表達量和抗蟲效果的詳細解析還未見報道.

該實驗室前期通過結構域交換等合理化分子改造方法獲得新型抗蟲基因cry1Ab/Gc，將其構建到植物表達載體pTF101-ubi中，通過農桿菌介導法進行玉米遺傳轉化，共獲得216個轉化事件.經過高壓力蟲試初步篩選，獲得農藝性狀優(yōu)異的玉米轉化事件3個，分別為HG-1、 HG-2、 HG-3.本研究通過對三個轉化事件T4代材料心葉期和抽絲期抗蟲蛋白表達量測定和抗蟲性分析，解析在玉米不同生育期兩者關系，篩選出高抗玉米螟的轉基因玉米轉化事件，為抗蟲轉基因玉米新品種培育研發(fā)提供數(shù)據參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料 轉cry1Ab/Gc基因玉米轉化事件HG-1、HG-2、HG-3，是將抗蟲基因cry1Ab/Gc構建到適用于單子葉植物高效表達的植物表達載體pTF101-ubi中，通過農桿菌介導法進行玉米遺傳轉化，并對216個轉基因玉米事件的T2、T3代抗蟲篩選后獲得的三個性狀優(yōu)良的轉化事件，由吉林省農業(yè)科學院農業(yè)生物技術研究所創(chuàng)制；pTF101-ubi-cry1Ab/Gc質粒為用于轉化到玉米中的含cry1Ab/Gc的植物表達載體質粒，抗蟲基因cry1Ab/Gc由玉米泛素化啟動子ubi啟動，nos終止子終止.試驗中所需亞洲玉米螟蟲由吉林省農業(yè)科學院農業(yè)生物技術研究所提供.

1.2 試驗方法

1.2.1 PCR

選取HG-1、HG-2、HG-3玉米T4代植株各三株，用CTAB法(參照 GB/T 19495.3—2004《轉基因產品檢測核酸提取純化方法》中的 CTAB-1 法)分別提取的葉片DNA，濃度稀釋為1μg/μL作為模板.pTF101.1-ubi-cry1Ab/Gc質粒為陽性對照，非轉基因玉米HiII為陰性對照，水為空白對照.根據載體上目的基因cry1Ab/Gc序列，利用Primer Premier 5軟件設計引物，引物序列如下：cry1Ab/Gc R: CGCCTTATTGGCAACTAC; cry1Ab/Gc F: CCTGCTACTACTGGACGAAA.使用2×EasyTaq PCR SuperMix進行PCR反應.反應條件為：95℃，5 min；95℃，30 sec、58℃，45sec、72℃，90 sec，共30 cycles；72℃ 10 min.PCR反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測

1.2.2 ELISA

分別在心葉期、抽絲期選取三個轉化事件HG-1、HG-2、 HG-3和非轉基因玉米HiII植株各三株，3次重復，剪取根、莖和葉片，按照Bt-Cry1Ab/1Ac ELISA Kit 試劑盒方法，測定在心葉期和抽絲期的根、莖、葉中cry1Ab/Gc基因的蛋白表達量，使用 Bio-Rad 酶標儀測定其 OD655 值.根據標準品蛋白的濃度和其 OD655值，繪制出標準曲線，根據標準曲線計算出待測樣品中 Bt 蛋白濃度.計算公式為：蛋白含量鮮重測試樣品濃度(μg/g)=測試樣品濃度(ng/ml)×稀釋倍數(shù)×抽提液(mL)/組織鮮重(g)×1000(ng/μg)

1.2.3 心葉期抗蟲性

在心葉期，將已經黑頭的、即將孵化的玉米螟卵塊接于轉基因玉米HG-1、 HG-2、 HG-3、非轉基因玉米HiII心葉中.每種材料接蟲96株，每株接 2-3個中等大小的卵塊，于接蟲14天-21天后，調查食葉級別.參照國家行業(yè)標準(NY/T 1248.5-2006)分級標準，評價各轉化事件抗蟲性.

表1 玉米螟對心葉為害程度的分級標準

表2 玉米抗玉米螟的抗性評價標準

1.2.4 抽絲期抗蟲性

抽絲期將已經黑頭的、即將孵化的玉米螟卵塊接于HG-1、 HG-2、 HG-3、非轉基因玉米HiII.每株接2～3個中等大小的卵塊，接蟲14～21 d后調查植株被取食情況.參照國標(農業(yè)部953公告-10.1-2007)分級標準，調查玉米蛀孔數(shù)量、蛀孔隧道長度以及存活幼蟲數(shù)量，采用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析，采用單因素方差分析方法進行差異顯著性分析，采用Tukey法和Duncan法進行材料間指標的多重比較.

抽絲期取轉基因玉米和非轉基因玉米新鮮花絲在實驗室測定抗蟲能力.稱取玉米花絲1g，放置于鋪有潤濕的三層濾紙的培養(yǎng)皿中，將初孵玉米螟5只接于花絲上，注意保持濕度和溫度，觀察5天玉米螟取食花絲情況.

2 結果

2.1 PCR

為鑒定抗蟲基因cry1Ab/Gc已整合到三個轉化事件HG-1、HG-2、HG-3中，對三個轉化事件玉米進行PCR鑒定.以pTF101-ubi-cry1Ab/Gc質粒為陽性對照，水為陰性對照.根據孟德爾遺傳分離規(guī)律，自交授粉后代表現(xiàn)3:1分離規(guī)律，隨著自交代數(shù)的增加，獲得純合體的概率越來越高，本研究選取的是T4代轉基因材料，純合度達93%以上.因此隨機選擇3株進行檢測，由圖可以看出，質粒和三個轉化事件玉米植株擴增出981bp條帶，陰性對照和空白對照未擴增出目的條帶，可見抗蟲基因cry1Ab/Gc在三個轉化事件HG-1、HG-2、HG-3中穩(wěn)定遺傳.

圖1 轉基因玉米PCR鑒定 M：DL2000 marker; 1：質粒(陽性對照)；2：HiII(陰性對照)；3: 水(空白對照)；4-6：轉基因玉米HG-1；8-10：轉基因玉米HG-2；12-14：轉基因玉米HG-3

2.2 ELISA

對心葉期和抽絲期三個轉化事件進行ELISA檢測，分析不同轉化事件不同組織抗蟲蛋白Cry1Ab/Gc表達量.根據標準曲線計算出待測樣品中Cry1Ab/Gc蛋白占總蛋白的鮮重.

表3 不同時期不同轉化事件不同部位Cry1Ab/Gc蛋白鮮重

結果表明：在同一時期，不同轉化事件中Cry1Ab/Gc蛋白表達量的一致趨勢為，葉片中含量最高，莖次之，根中最低.在心葉期，轉化事件HG-1不同部位Cry1Ab/Gc蛋白表達量均高于HG-2和HG-3；在抽絲期，轉化事件HG-1的根、葉Cry1Ab/Gc蛋白表達量明顯高于轉化事件HG-2和HG-3，但轉化事件HG-2的莖中Cry1Ab/Gc蛋白表達量高于轉化事件HG-1和HG-3.

隨著轉基因玉米的生長，不同時期同一轉化事件同一部位的Cry1Ab/Gc蛋白表達量有所變化.轉化事件HG-1、HG-2、HG-2的葉和根、HG-2的莖中Cry1Ab/Gc含量升高.

2.3 心葉期抗蟲性

為分析三個轉化事件在Cry1Ab/Gc表達量不同的情況下的抗蟲性情況.在心葉期對非轉基因玉米和三個轉化事件轉基因玉米進行田間玉米螟抗蟲性試驗.接初孵幼蟲14 d后，非轉基因玉米葉片出現(xiàn)大量排孔、被玉米螟蟲啃食嚴重；轉化事件HG-1葉片較少排孔，未受影響；轉化事件HG-2、 HG-3葉片出現(xiàn)一定的排孔，部分被玉米螟蟲啃食.記錄各材料玉米螟危害程度級別，計算玉米螟對各鑒定材料群體葉片食葉級別的平均數(shù).

參照國家行業(yè)標準(NY/T 1248.5-2006)分級標準，HG-1蟲害級別為1級，抗性為高抗(HR)，HG-2和HG-3蟲害級別為3，抗性為抗(R)，HiII蟲害級別為9，抗性為感(S).綜上，田間心葉期抗蟲性高低依次為HG-1> HG-2>HG-3.

表4 心葉期轉cry1Ab/Gc基因玉米抗蟲性評價

圖2 心葉期轉基因玉米抗蟲性鑒定 A：HiII； B：HG-1；C：HG-2；D: HG-3

2.4 抽絲期抗蟲性

為進一步評價三個轉化事件抗蟲性，在抽絲期接蟲后統(tǒng)計植株被害情況.參照國標(農業(yè)部953公告-10.1-2007)分級標準，調查玉米蛀孔數(shù)量、蛀孔隧道長度以及存活幼蟲數(shù)量(表5)，結果表明:抽絲期轉基因玉米HG-1、HG-2抗蟲性高于HG-3，且明顯高于對照HiII，抗性級別依次為高抗、高抗、抗、感.

表5 抽絲 期轉cry1Ab/Gc基因玉米抗蟲性評價

表中不同小寫字母間5%水平上差異顯著，表中數(shù)值為Mean±SE.

同時，在轉基因玉米和非轉基因玉米抽絲期選擇新鮮花絲在實驗室測定抗蟲能力，如圖3所示.結果發(fā)現(xiàn)，對照組玉米螟前三天生長良好，第4、5天出現(xiàn)死亡，花絲已全部吃光，只剩深褐色的糞便和廢屑；轉基因玉米HG-1、HG-2抗性良好.它們的花絲被取食非常少，接蟲3天以后玉米螟死亡率在80%以上，5天以后大部分轉化系上玉米螟死亡率到達100%.HG-3被部分取食.因此，轉化事件HG-1、HG-2室內花絲抗蟲性級別較高.

圖3 室內抗蟲性測定A：空白對照；B：HiII；C：HG-1；D：HG-2；E：HG-3

3 討論

培育轉基因抗蟲玉米是解決玉米蟲害的有效方法.從已有的研究結果來看，通過對cry基因的修飾與改造，轉Bt基因的作物可以獲得較好的抗蟲效果[13-14].該實驗室在前期通過合理化定向分子改造出新型抗蟲基因cry1Ab/Gc，通過遺傳轉化到玉米中獲得216 個轉化事件.經過高壓力抗蟲性初步篩選，獲得目標性狀優(yōu)異的玉米轉化體3個，分別為HG-1、HG-2、 HG-3.

為分析不同轉化體Bt蛋白表達量和評估抗蟲性.首先對轉化事件HG-1、HG-2、HG-3的T4代的玉米進行PCR鑒定，確定陽性植株.采用ELISA方法分別對三個轉化事件陽性轉基因玉米心葉期和抽絲期的根、莖、葉中Cry1Ab/Gc蛋白表達量進行了測定，研究表明(1)在同一時期，不同轉化事件中Cry1Ab/Gc蛋白表達量的一致趨勢為，葉片中含量最高，莖次之，根中最低；這種現(xiàn)象與李蔥蔥等[15]對先正達公司轉cry1Ab玉米中Cry1Ab蛋白、楊麗麗[16]對抗蟲轉基因玉米Bt799中mCry1A蛋白在各組織部位表達量趨勢一致；(2)不同時期葉片Cry1Ab/Gc蛋白含量存在顯著差異，表現(xiàn)為抽絲期>心葉期，與劉金洋等[17]對抗蟲玉米的Bt蛋白表達特征分析趨勢一致；(3)不同轉化體間，心葉期轉化事件HG-1的葉片、抽絲期轉化事件HG-1和HG-2的莖中Cry1Ab/Gc蛋白的含量明顯高于其他材料.以上趨勢可能由于外源基因cry1Ab/Gc插入玉米中不同的位點、目的基因拷貝數(shù)等因素不同所致；也可能當外源基因整合到生長發(fā)育相關的基因附近，生長發(fā)育基因的調控序列也會影響外源基因的表達.外界環(huán)境因子、植株不同組織中碳水化合物和總蛋白含量不同等因素也能引起外源基因表達量的差異，其機理有待深入研究.

玉米螟初孵幼蟲取食偏好嫩葉、抽穗后的秸稈，破壞植物組織，阻礙玉米養(yǎng)分的輸送，進而造成減產，因此心葉期和抽絲期是玉米螟危害的主要時期.本研究參照國家行業(yè)標準分級標準，對心葉期、抽絲期三個轉化事件進行抗蟲性評價.在心葉期，轉化事件HG-1抗蟲性級別為高抗，轉化事件HG-2和HG-3抗蟲性級別為抗；抽絲期的田間和室內抗蟲性試驗結果表明抽絲期 HG-1和HG-2抗蟲性級別為高抗，HG-3抗性級別為抗.這與心葉期轉化事件HG-1葉中、抽絲期轉化事件HG-1葉中、HG-2葉和莖中Cry1Ab/Gc蛋白表達量相對較高的趨勢一致.說明轉基因玉米對亞洲玉米螟的毒性強弱與其所表達的毒蛋白含量高低相吻合[6].根據殺蟲晶體蛋白的作用機制，Bt蛋白被昆蟲攝入并活化后，與昆蟲中腸上皮細胞的受體結合，造成離子通道或形成孔洞，引起滲透壓失衡，最終導致昆蟲死亡[18].轉基因作物的抗蟲性是殺蟲蛋白與特異性受體結合的過程.ELISA技術的基礎就在于抗原抗體之間的特異結合反應，具有高效、靈敏、特異、穩(wěn)定、可靠等特點.Wang等[19]已利用此技術篩選出高抗二化螟蟲的轉基因水稻T1C-19b.本研究通過ELISA方法測定心葉期和抽絲期不同轉化體的根、莖、葉中抗蟲蛋白Cry1Ab/Gc表達量，并對轉基因玉米抗蟲性進行評價，明確了心葉期和抽絲期Bt蛋白表達量與亞洲玉米螟抗性呈正相關，選育出高表達抗蟲蛋白高抗亞洲玉米螟的轉基因玉米HG-1.因此對轉基因作物中外源基因的表達水平進行個案分析，可作為優(yōu)秀抗蟲轉化體初步篩選和評估的重要技術指標，為抗蟲轉基因玉米新品種培育研發(fā)提供數(shù)據參考.

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(責任編輯：季春陽)

Analysis of Bt Protein Expression and Insect Resistance in Different Transgeniccry1Ab/GcMaize

Liu Yang1,2, Liu Qing1,2,Li Nan1,2;Liu Xiangguo1,2;Zhang Hang3, Zhao Fangfang3, Jia Wei4, Han Siping1,2,Yin Yuejia1,2

(1.Jilin Academy of Agricultural Sciences; 2. Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Jilin Province; 3. Harbin Normal University; 4. Jilin Agricultural University)

It’s an important key to analysis of Bt protein expression and insect resistance in different transgenic maize for new variety breeding. To analysis of relationship between Bt protein expression and the insect resistance of transgeniccry1Ab/Gcmaize, three transformants, HG-1, HG-2, HG-3 as experimental materials are selected, and the expression of different transformants in different tissues at different periods are detected by using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method, the insect resistance of transgenic maize at whorl stage and silking stage are evaluated. The results show that the order ofCry1Ab/Gcprotein expression in different tissues at the same period was leaf > stem > root with significant differences andCry1Ab/Gcprotein expression in transgenic leaf at different periods is silking stage > whorl stage;Cry1Ab/Gcprotein expression of HG-1 maize leaf in whorl stage and HG-1、HG-2 stem at silking stage is significantly higher than that of other materials. The laboratory and field test at whorl stage and silking stage show that the Asian corn borer resistant of HG-1 is significantly higher than that of the other transformants, in accord with the high expression ofCry1Ab/Gcprotein in leaf and stem of HG-1. The results of this study demonstrate that the expression of Bt protein is related to the Asian corn borer resistance at whorl stage and silking stage. The expression of Bt protein can be an important technical index as selecting excellent insect resistant transgenic maize, with operability, stability, saving time and other advantages.

Cry1Ab/Gcprotein expression; Transformants; nsect resistance

2016-05-22

*吉林省農業(yè)科技創(chuàng)新工程資助(吉財教[2012]1072)；吉林省科技發(fā)展計劃項目資助(20160520060JH)

Q78

A

1000-5617(2016)03-0087-06

**通訊作者:yyjqishi@163.com