董 波，戴愛玲，李曉華，楊小燕**

(1. 龍巖學(xué)院；2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心)

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豬流行性腹瀉疫苗毒株M基因的克隆與序列分析*

董 波1,2，戴愛玲1,2，李曉華1,2，楊小燕1,2**

(1. 龍巖學(xué)院；2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心)

從龍巖地區(qū)某豬場使用的弱毒疫苗中，提取毒株核酸.根據(jù)GenBank已發(fā)表的CV777毒株M基因序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了疫苗毒株的M基因序列，并對(duì)其進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析.通過分析表明，疫苗毒株與韓國毒株virulent DR13的親緣性較近，與2010年后中國流行毒株親緣性較遠(yuǎn).這一結(jié)果暗示該豬場使用的疫苗對(duì)于豬群的保護(hù)能力不足，無法有效對(duì)抗現(xiàn)在的流行毒株，需引起重視.

豬流行性腹瀉；弱毒疫苗；M基因；遺傳進(jìn)化分析；同源性分析

0 引言

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，一種高傳染性高接觸性的腸道傳染病，以食欲下降、急性腹瀉伴有嘔吐為主要臨床特征[1].尤其對(duì)哺乳仔豬的危害較大，死亡率可達(dá)100%.目前，預(yù)防PED的主要手段是免疫接種，使用的疫苗類型有強(qiáng)毒疫苗，弱毒疫苗以及滅活疫苗等[2].由于強(qiáng)毒疫苗能夠長期存在于而導(dǎo)致該病的反復(fù)發(fā)作，所以幾乎禁止使用.而弱毒疫苗的應(yīng)用性最佳，使用后的母豬抗體水平提高，仔豬的成活率得到保證，沒有出現(xiàn)臨床癥狀[3].因此，弱毒疫苗受到養(yǎng)豬場的青睞.

2010年以來，我國大面積爆發(fā)PED，造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失，即使在接種了PED弱毒疫苗或滅活疫苗的豬群中，發(fā)病率依然很高[4].這提示人們現(xiàn)在使用的疫苗對(duì)于流行變異毒株的保護(hù)力不強(qiáng)，只能提供有限的免疫保護(hù).該研究對(duì)龍巖地區(qū)某豬場使用的弱毒疫苗M基因進(jìn)行克隆、測序及遺傳分析，理清疫苗毒株與參考毒株以及流行毒株之間的進(jìn)化關(guān)系，從基因水平分析目前龍巖地區(qū)豬場使用疫苗的可靠性，并為PED的防控提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣品

PEDV疫苗毒株來自龍巖地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)豬場使用的弱毒活疫苗.

1.2 主要試劑

DL2000 Marker、總RNA提取液(TaKaRa RNAiso Reagent)、病毒RNA/DNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0)、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、rTaq DNA聚合酶、Oligo(dT)18、dNTP、DNA Marker DL 2000、RNA酶抑制劑、pMD18-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司； DNA 凝膠回收試劑盒(DNA Gel Extraction Kit)及質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid Miniprep Kit)購自 AXYGEN公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞制備試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；氯仿、異丙醇采用分析純?cè)噭?

1.3 M基因的擴(kuò)增、純化

參考GenBank上發(fā)表的PEDV CV777株M基因序列，使用Premier Premier 5.0生物軟件設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，PEDV-M-F：TTCTATTCCCGTTGATGAGG，PEDV-M-R：CATGAAGCACTTTCTCACTATC.自多重RT-PCR陽性樣品中擴(kuò)增病毒M基因.反應(yīng)條件為： 95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min.使用瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果.

1.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定

將PCR產(chǎn)物純化后連接至0.5 μL pMD18-T載體轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板過夜，挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序.

1.5 序列分析

將疫苗毒株與NCBI上公布的PEDV毒株進(jìn)行對(duì)比，用DNAstar分析不同毒株之間的同源性，并用MAGE5.2分析疫苗毒株與選擇毒株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系.所引用的已知代表毒株信息見表1.

表1 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析中引用的PEDV毒株

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

使用特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過電泳凝膠成像得到圖1所示的結(jié)果，得到了預(yù)計(jì)的結(jié)果，目的條帶大約在681bp，與預(yù)期結(jié)果相符合.

圖1 M基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 同源性分析

弱毒疫苗毒株M基因的同源性分析表明，疫苗毒株與標(biāo)準(zhǔn)毒株CV777的氨基酸同源性為98.7%，與韓國毒株SM98的同源性為97.8%，與韓國Attenuated DR13毒株的氨基酸同源性為98.7%，與中國2006年的LZC毒株的同源性為96.9%，與2008年JS2008_KC109141毒株的氨基酸同源性為98.2%，與2011年的BJ-2011-1和LC的氨基酸是同源性分別為97.3%、97.8%，與2014年FJ-ZP的氨基酸同源性為96.9%，與FJ-FQ毒株的氨基酸同源性為96.5%.

2.3 M基因系統(tǒng)發(fā)育分析

使用MEGA 5.2對(duì)選擇的M基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析顯示，可以將所選取毒株分為兩個(gè)大組， G1與G2組.其中，G1組包括傳統(tǒng)毒株CV777、2010年前中國分離毒株LCZ、SM98以及韓國毒株virulent DR13，而疫苗毒株yimiaoM也包含在G1組.系統(tǒng)發(fā)育分析顯示(如圖2所示)，疫苗毒株與韓國毒株virulent DR13的親緣性較近，而與2010年后中國變異毒株以及2013年美國毒株親緣性較遠(yuǎn).

圖2 PEDV M基因系統(tǒng)發(fā)育分析

3 結(jié)束語

在PEDV的4個(gè)結(jié)構(gòu)基因中，M基因較為保守，在基因工程疫苗的設(shè)計(jì)中，可作為主要抗原[5].對(duì)PEDV M基因的檢測和分析有助于了解我國目前PEDV流行毒株的流行類型.該研究中，疫苗毒株與2010年后的中國變異毒株同源性分別為95.5%～97.8%，說明疫苗毒株與變異毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn).另外從遺傳進(jìn)化關(guān)系分析表明，疫苗毒株與變異毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),疫苗毒株與韓國virulent DR13在同一分支上，這說明他們可能來自同一祖先，也有可能疫苗毒株來源于韓國virulent DR13 毒株.遺傳進(jìn)化表明，G2組包括大部分2010年后中國變異毒株以及2013年美國毒株，而2012年中國毒株SD-M、KC189944在G1組里，推測與豬群可免疫帶毒有關(guān).因?yàn)槿醵疽呙绱嬖谥底娴娜秉c(diǎn)，這可能是導(dǎo)致SD-M與KC189944毒株在傳統(tǒng)毒株群中的原因.

2013年，美國爆發(fā)PED，給美國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重影響，經(jīng)濟(jì)損失巨大[6].這次爆發(fā)的PEDV，與2010年我國爆發(fā)的PEDV的流行方式極為相似.遺傳進(jìn)化分析證實(shí)，兩次流行的PEDV，親緣性上很相近，可以認(rèn)為來自同一祖先，屬于變異毒株.而本研究選擇的疫苗毒株，親緣關(guān)系上與韓國毒株virulent DR13較近，而與變異毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，暗示該疫苗對(duì)于目前流行毒株的保護(hù)力不強(qiáng)，只能提供有限的免疫保護(hù)，需要選用更為有效的疫苗來防控目前流行的PEDV毒株.

[1] Cavanagh D. Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae[J]. Arch Virol, 1997, 142(3): 629-633.

[2] 劉孝珍,陳建飛.時(shí)洪艷,等.2011年豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012(3):180-183.

[3] 甘海霞,梁昆,韋顯凱，等.2011年廣西豬群豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎調(diào)查[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,33(10):125-127.

[4] 鄭逢梅,霍金耀,趙軍,等.2010-2012年華中地區(qū)豬流行性腹瀉病毒分子特征和遺傳進(jìn)化分析[J].病毒學(xué)報(bào),2013,29(2):197-205.

[5] Brian D, Baric R. Coronavirus genome structure and replication[J].Curr Top Microbiol Immunol,2005(287): 1-30.

[6] Stevenson GW,Hoang H,Schwartz K J, et al.Emergance of Porcine epidemic diarrhea virus in the United States:clinical signs,lesions,and viral genomic Sequences.J Vet Digan Invest,2013(25):649-654.

(責(zé)任編輯：季春陽)

The Cloning and Sequence Analysis of M Gene of Vaccine Strains about Porcine Epidemic Diarrhea

Dong Bo1,2, Dai Ailing1,2, Li Xiaohua1,2,Yang Xiaoyan1,2

(1. Longyan College; 2. Pig Disease Prevention and Control Engineering Technology Research Center of Fujian Province)

In this study, from the region one of the weak poison vaccine used in pig farms, the virus nucleic acid is extracted. According to a published CV777 GenBank strain M gene sequence specific primers, design synthesis using rt-pcr technique amplified the vaccine strains of M gene sequences, and the analysis of genetic evolution is carried on. The analysis result shows that the vaccine strain is closed with South Korea virulent DR13, is far way with China after 2010 pandemic strain affinity. Therefore, a weak poison vaccine can't be used to protect piglets from pandemic strain infection. It need to be attach great importance.

The pig epidemic diarrhea; Weak poison vaccine; M genes; Analysis of genetic evolution; Homology analysis

2016-01-02

*龍巖學(xué)院博士啟動(dòng)項(xiàng)目(LB2014004)

Q34

A

1000-5617(2016)03-0097-04

* *通訊作者：Lyyxy1988@126.com